1、基于生物材料的殼聚糖/海藻酸鈉的表面電荷和機械特性的研究摘要：這個研究目的是為了生物醫學應用而檢驗殼聚糖/藻朊酸鹽生物材料的表面電荷和機械力學特性。通過不同濃聚度的殼聚糖和藻朊酸鹽，我們測的表面有不同濃度的表面電荷和力學性能。這些膜表面的電荷濃度由一種源自原子力顯微鏡（AFM)的曲線分析模型。膜的平均表面電荷濃度包含60%殼聚糖和80%殼聚糖對應0.46mc/m2和0.32mc/m2。膜包含90%殼聚糖電荷被發現為中性，并且隨著殼聚糖濃度的提高彈性系數和水容量會降低。膜包含殼聚糖60%，80%，90%會增加93.5+/-6.6%，217.1+/-22.1%和396.8+/-67.5%對于他們最

2、初的質量。而這兒的彈性系數分別為2.6+/-0.14Mpa，1.9+/-0.17Mpa和0.93+/-0.12Mpa。這種傾向于觀察機械回應的膜歸咎于結合聚合電解質的影響和大量水的吸收。傅立葉變換紅外光譜學實驗表明膜表面更高的藻酸鹽對比與其他同體積膜。根據AFM實驗表明有更高藻酸鹽濃度的膜表面有連續不斷的負電荷。1.介紹生物材料是合成的或起源于生物的，并可有望執行它們所取代的組織的生物功能。在一些應用中，如在骨移植中，它們可以與周圍組織相互作用并形成牢固的鍵1-3。在其他如血管移植和抗粘連屏障，它們應該表現出惰性，并避免任何細胞的粘連4-6。所有植入的生物材料可能潛在地引起宿主組織的響應，而且

3、該響應可歸因于來自復雜而繁多的材料性能的交互作用，舉幾個例子來說，如機械性能，表面化學，體相化學，表形，形狀和降解速率。所有這些最終涉及到表面的相互作用7,8。除了上述因素的影響，表面電荷也被觀察到對細胞的行為，如炎性反應，集落形成，取向，粘連和增殖顯著影響。Hunt等。研究了對炎癥反應刺激作用下的表面電荷的影響9。通過改變取代負電荷的磺酸鹽基團，聚（醚）氨基甲酸酯表面電荷逐漸增加。結果表明在早期階段的急性炎癥反應的顯著影響。表面電荷密度也已發現，覆布有正和負電荷的分子纖維網眼影響血管向內生長10。帶負電荷的網格更加顯著的促進血管向內生長。表面電荷密度也被報道了是通過成骨細胞和神經母細胞瘤細胞

4、的取向從而影響集落形成。11,12當具有相反電荷的基團時，如脫乙酰殼多糖和藻酸鹽的聚合物，在水性條件下混合，它們自發地結合形成聚電解質復合物（PEC）。PECs組成主要包括至少兩種相反電荷的聚合物13。聚合電解質復合物形成的驅動力是帶相反電荷的聚合物之間的熵和強烈的靜電吸引力。脫乙酰殼多糖可作為一種三維組織的生長的非蛋白質基質。潛在地，它可以提供生物細胞組織增生和重建的引物14。但是，脫乙酰殼多糖具有非常低的機械完整性，并降解地十分迅速。許多研究已經進行了基于殼聚糖設計和制造的混合系統15-17，通過化學修飾的氨基和/或羥基基團，以實現改進機械性能，以及改進的生物性能18-20。藻酸鹽被認為是

5、陰離子聚電解質。殼聚糖和藻酸鹽在動物研究中已被證明具有生物相容性，生物降解性的和生物功能性21-24。聚電解質復合物的生物材料，特別是基于多糖的，具有的傷口愈合，藥物遞送和組織工程應用的潛能17,21,25。PECs在已經開發的微膠囊，水凝膠，薄膜和泡沫26-28等方面產生了不同的生物材料。近日，在維爾馬報。報道一種新的方法來合成PEC支架和薄膜15。此方法允許更好地控制成分，混合和PECs的結構，其中后者可通過改變pH值來控制。在較高的pH（8），以納米膠體顆粒形式存在，而在低pH值（4），以纖維狀的PECs的形式（圖1）存在。目前殼聚糖/海藻酸鈉基薄膜包括PEC纖維。另外，室溫和基于水加工

6、條件的PECs將有可能減輕與生物活性劑結合。兩者的機械性能的表面電荷特性影響其生物反應。因此，在這里，我們報道其機械性能和脫乙酰殼多糖/藻酸鹽類膜的表面電荷的測量。這是對殼聚糖/海藻酸鹽基生物材料表面電荷測量的第一項研究。圖12.材料和方法2.1 材料脫乙酰殼多糖（脫乙酰化，> 75，分子量為300千道爾頓-400 kDa的）和藻酸鈉（分子量12 KDa的-40 KDa的）購自Sigma-Aldrich化學品公司。所有這些化學品均是購自igma-Aldrich化學品公司。2.2 試驗使用Nanoscope-IIIA控制器并配備了J型壓電掃描儀的多模AFM測量AFM力曲線(Veeco Me

7、trology Group, Santa Barbara, CA)。AFM針尖（Novascan Technologies公司）通過二氧化硅珠（直徑5微米和0.17牛頓/米2的彈簧常數）進行了預改性。機械測試使用的是EnduraTech，ELF 3200。 Bruker Equinox 55 FTIR光譜儀（布魯克光譜公司，比爾里卡，MA）用于FTIR分析。傅立葉變換紅外光譜均被收集在傳輸（4000-400 cm-1）和衰減全反射（ATR）模式（4000-600 cm-1）中。所有測量均通過4cm-1的分辨率進行共加入100次掃描。2.3 殼聚糖海藻酸鈉薄膜的制備該脫乙酰殼多糖溶液（

8、1w / v）的是用含有100微升的乙酸的30毫升的去離子水溶解0.3克殼聚糖而制備的。該海藻酸鈉溶液（1w / v）的是用30毫升的去離子水溶解0.3克海藻酸鈉而制備的。脫乙酰殼多糖溶液逐滴于藻酸鈉溶液使這兩種溶液混合在一起。下一步將混合溶液進行超聲處理，空氣干燥24小時，制成薄膜。這些膜的脫乙酰殼多糖/藻酸鹽比率分別為60/40的（殼聚糖海藻酸鈉60）80/20（殼聚糖海藻酸鈉80）和90/10的（殼聚糖海藻酸鈉90）。制備的膜的厚度是用數字測徑器進行測量的。2.4 PEC含量測定每個殼聚糖海藻酸鈉的2毫升溶液在6000rpm下離心3分鐘。除去上清液后，加入1ml去離子水到殘余物溶液中并混

9、合。此過程重復3次，以除去可溶部分。殘余PEC在50干燥和最終質量標記作為PEC組成。2.5 力數據集的數據分析原子力顯微鏡（AFM）是一種用于表面分析高度無創的技術。它也被廣泛地用于確定表面電勢29-31。表面電位測量間接的通過AFM實驗的力曲線確定。在該技術中，力被測量為尖部 - 表面分離的函數。除了靜電相互作用，AFM力曲線分析也被應用到分子識別，蛋白質折疊和范德華相互作用32,33。圖2顯示了一個典型的AFM力曲線的示意圖。收集力曲線（FV）的數據集，或力的映射，使用的是Nanoscope控制軟件（版本NS3A，數字儀器）。力映射涉及力曲線集合的每個點的規則間隔排列在兩維（X-Y）的掃

10、描區。此FV數據集是偏轉與位移曲線上的x-y平面（樣品表面）的三維陣列。力曲線的收集是通過移動垂直壓電直到懸臂偏轉達到觸發值。力曲線的接近部分終止在這一點上，與AFM針尖后退到預定的距離（在z掃描尺寸）。在樣品的二維（X-Y）掃描每個點重復進行這一過程。 FV測量在32微米×32微米，間隔2微米（總計256點）的的區域內進行。進針和退針曲線均被記錄。在每個點力曲線是1000次進針和退針曲線的平均水平。在0.1mM，pH7.4的NaOH維持NaCl的溶液的收集FV數據集。在力曲線中，x軸對應于懸臂和樣品表面之間的高度，并且y軸對應于懸臂的偏轉。該曲線被分成三個區域（圖2）。C區域對應最

11、初的懸臂運動，那里沒有表面和針尖的相互作用。尖端更接近表面，長程靜電相互作用引起的尖端（區域B）的偏轉。由于表面電荷被反荷離子在含水條件下的吸附中和，AFM測定的力，基本上是針尖的反離子和樣品表面之間的靜電相互作用。懸臂進一步向下移動，最終尖端與樣品表面接觸，并且尖端與樣本的壓縮引起了尖端（區域A）的進一步的偏轉。圖22.6 表面電荷密度的測定由于靜電力是由AFM針尖和樣品表面的雙層之間的相互作用造成的，這些力可通過泊松-波爾茲曼方程來建模。泊松 - 波爾茲曼方程的雙層被描述為：其中為表面電位，e是基本電荷，= 1 /（KT）是逆熱能，并且k-1被定義為K2 =2e2n/（0）的德拜長度，由此

12、n是在本體一價鹽數量濃度并且0是水的介電常數。泊松 - 玻耳茲曼方程可以通過考慮恒流充電（CC）或恒電位（CP）的邊界條件34,35來解決。另一種方法是用分析方程獲得表面電荷密度31。基于電解液中兩個電極平面的電壓表達式，Butt推導出介于半球形電極頭與平面樣品間的雙電層電力，力F被描述為：其中，R是尖端半徑，L為德拜屏蔽長度，tip和sample分別針尖與樣品電荷密度，并且z是針尖-樣品的分離。這個推導需要幾個假設，包括小的表面電位，針尖 - 樣品的分離比德拜長度大，并且尖端半徑與分離相比，R»z。盡管有這些近似值，該實驗測量通過力依賴的針尖-樣品的分離，尖端半徑，電解質濃度和pH

13、成功的進行了描述。它已被廣泛應用于Si3N4和硅探針尖和無機表面以及脂膜之間的靜電相互作用37。半徑R，硅珠尖被給定2.5微米，力F和校準的針尖的偏轉的值和彈簧常數使用胡克定律計算。tip是硅珠表面電荷并已知為-7.1×10-3C/m，Z是沿z軸針尖的運動，0和分別取為7.08335×10-10和9.1×10 -8m。 由于脫乙酰殼多糖和藻酸鹽包含相反電荷的官能團，以不同的比例將它們混合改變薄膜的表面電荷特征。原子力顯微鏡（AFM）是用于確定表面電荷密度。在pH值7.4和0.1毫米離子強度水條件下 AFM直接測量殼聚糖/海藻酸鈉膜和硅膠珠之間的力。

14、60;離子強度用加入的NaCl維持。硅石珠是在含水條件下帶負電荷的。硅珠和薄膜之間的力是通過懸臂的偏轉確定的。在區域C中的數據被用于標準化所述偏轉軸線的曲線（圖3）， 而B是含有表面電荷的偏轉數據，A是包含數據表面壓痕的數據。區域C線性部分的平均偏轉被確定并且用于標準化的力的曲線，如圖所示，3A。然后，線性擬合被用于偏轉值，并且將這些值與實際數據點進行比較。該識別到的線性區域被淘汰（圖3C）和曲線進行標準化于z軸線（圖3D）。分析方程（方程（2）用于擬合數據，以確定所述的表面電荷密度。使用MATLAB程序進行所有這些步驟。圖32.7 力曲線的彈性模量的測定彈性模量可以從力曲線的區域A

15、確定。對無限剛性的樣品，懸臂的偏轉是相同的z方向上的壓電的移動。然而，在柔軟的樣品上，壓痕導致的偏轉較小。軟樣品上的壓痕可通過減去堅硬的樣品懸臂偏轉在來確定。由于胡克定律是連接的懸臂和通過懸臂的力常數k所施加的加載力的偏轉，該加載力可以寫成asF = kd。通過繪制壓痕與裝載力，并與赫茲模式確定彈性模量。一個半徑R為的無限硬球（AFM針尖）觸摸軟平面表面的赫茲模型給出的加載力F和壓痕之間的的關系如下：其中E是楊氏模量，是軟材料的泊松比。2.8 統計分析使用GraphPad Prism軟件La Jolla, California，Tukey多重比較檢驗之后進行單因素方差分析進行統計分析，如果P&

16、lt;0.05顯著則被認為有顯著差異。3.結果3.1 在殼聚糖海藻酸鈉溶液中的PEC組分PEC在殼聚糖海藻酸鈉60，殼聚糖海藻酸鈉80和殼聚糖海藻酸鈉90的組分內容示于圖4. PEC在殼聚糖海藻酸鈉60，殼聚糖海藻酸鈉80和殼聚糖海藻酸鈉90 中被發現的含量分別是69.2±2.9，29.8±0.6和18.2±2.2。4個樣本組分計算平均值。圖43.2 含水條件下的重量增加由于生物材料需要體內水的條件,生物材料的溶脹行為是他們成功的一個重要標準。通過在-MEM（最低必需培養基）中浸泡長度和寬度大約0.5厘米殼聚糖海藻酸鈉膜1小時如圖5進行測定溶脹行并顯示浸泡聚糖海藻

17、酸鈉膜1小時后，重量增加。因為殼聚糖和藻酸鹽是親水性的，膜顯著的吸收水。 在它們的初始重量上ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90分別得到93.5±6.6，217.1±22.1和的396.8±67.5。觀察到重量增加的同時脫乙酰殼多糖濃度也增加。用于該研究的樣本數為4。圖53.3 ChiAlgi膜的機械性能脫乙酰殼多糖/藻酸鹽薄膜切割成尺寸10mm的長度和5mm寬的帶材。數字測徑器測量的膜的厚度被認為是80微米。機械試驗是在張力和在生理條件下進行的。彈性模量計算從應力 - 應變曲線的初始線性部分。機械試驗之前，薄膜浸泡在-MEM培養基1小時。

18、ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90的彈性模量被發現分別為2.6±0.14兆帕，1.9±0.27兆帕，0.93±0.12兆帕（圖6）。 5-6樣品各組合物被用于測定彈性模量。 圖6在微觀層面，ChiAlgi薄膜的機械性質進行了研究。微壓痕試驗是用原子力顯微鏡（AFM）進行的。數據的獲得來自于每個薄膜式超過（32×32平方微米）的用于計算彈性模量的表面區域。AFM的力彎曲確定的彈性模量示于圖7。 ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi907.的彈性模量被發現是5.4±2.9千帕，6.57±3.7千帕

19、和68.1±16.9千帕。，從AFM實驗計算的彈性模量結果顯示的與宏觀力學測試相比下降了兩個數量級。圖73.4 ChiAlgi表面電荷分布圖8和圖9分別顯示ChiAlgi60和ChiAlgi80表面電荷密度分布。ChiAlgi60和ChiAlgi80均顯示表面負電荷密度。 ChiAlgi90沒有表現出遠距離的吸引力和排斥力。力的表面電荷密度分析顯示在所有樣本中均有非均勻電荷分布。ChiAlgi60和ChiAlgi80平均表面電荷密度分別是-0.46 mC /m2和-0.32 mC /m2。圖8圖93.5 FTIR研究為了進一步了解在體積的差異和表面所有ChiAlgi薄膜的機械性能，我

20、們進行了傅里葉變換紅外光譜（FTIR）中的傳輸衰減和傳輸反射（ATR）模式的實驗。FTIR在傳輸模式以提供大量的體積信息為主，而ATR提供表面信息。圖10和11示出了在傳輸和ATR模式的脫乙酰殼多糖，藻酸鹽，ChiAlgi90，ChiAlgi80和ChiAlgi60的1250-900 cm-1紅外光譜。1085 cm-1位置的帶起源于反對稱伸縮的C-O-C糖苷鍵和1035cm-1位置的帶源自C-O骨架震動的拉伸。這兩個鍵分別存在于藻酸鹽和脫乙酰殼多糖，并具有紅外活性。但是，C-O伸縮帶在藻酸鹽更為突出，而由于C-O-C伸縮帶在脫乙酰殼多糖更突出。我們比較了在傳輸和ATR模式下，所有的薄膜的這兩

21、個波段的相對強度來研究在體積和表面組成的差異。圖10圖114.討論基于聚電解質復合物的殼聚糖和海藻酸鈉顯示具有高潛力的組織工程和藥物輸送的應用。機械性能和表面電荷特性都能影響其生物反應。在這項工作中，我們研究了機械性能和脫乙酰殼多糖/藻酸鹽類膜的表面電荷。這是對這些生物材料的表面電荷測量的第一項研究。機械試驗是在37和pH 7.4進行模擬生理條件下進行的。結果表明：隨著脫乙酰殼多糖比例的增加彈性模量降低。在該薄膜的彈性模量所觀察到的趨勢是由于PEC纖維的相對含量和吸收的液體決定的。膜的總PEC組分與彈性模量的趨勢相同。因此，我們的結論是該纖維的PEC潛在是作為增強劑強化濕的條件下的膜。MEM的

22、吸收導致腫脹和會影響這些薄膜的力學響應。由于具有較高的PEC含量的樣品將包含低級游離氨基與水分子相互作用，他們預計吸收較少量水，如圖4所證實的結果。膜的表面的彈性模量是用原子力顯微鏡力顯微鏡來確定。從AFM實驗確定的彈性模量表現出與體積彈性模量相比低兩個數量級較低。 我們推測，在彈性模量下降的出現是由于在體積和薄膜表面的化學成分的差異。研究體積和表面之間的成分差別，我們在傳輸和ATR模式進行FTIR。在FTIR，透射譜主要是提供大量的體積信息，而ATR譜主要提供表面信息。 由圖10和11比較FTIR光譜，我們觀察到C-O條帶在ATR譜（圖11）出現，這表明在高濃度的海藻酸鈉中表面比體

23、積更加突出。隨著脫乙酰殼多糖比例的增加此帶的強度減少。表面高的藻酸鹽的存在會導致表面比體積更多的水吸收，因此與體積相比比具有更低的彈性模量相比。表面更高的海藻酸鈉的存在也與AFM表面電荷測量的研究結果一致。原子力顯微鏡研究展現了ChiAlgi60和ChiAlgi80負電荷的表面和負電荷的表面中性表面。這些樣品的表面由于存在于藻酸鈉羧酸基團的存在展現出負電荷密度。這些羧酸基團在水性條件下離解這有助于負電荷聚合成物;脫乙酰殼多糖含有氨基基團并且這些基團的質子化產生正電荷，在溶液中的聚合成物。當脫乙酰殼多糖和藻酸鹽混合在一起在溶液中，由于它們的電荷的互補性質，它們自發地結合在一起，形成PEC。聚合物混合物的最終電荷是由未反應的官能團的質子化/去質子化決定的。聚合物的質子