1、 第六章 微生物菌種的選育 第一節 從自然界中分離篩選菌種*1.基本步驟：采樣增殖培養純種分離篩選(初篩、復篩)2.環境條件對土壤樣本中微生物分布的影響：（1）營養環 境（2）水分（3）溫度：采樣以秋季為好（4）通風（5）酸堿度：細菌、放線菌：中性或偏堿；霉菌、酵母：偏酸3.采樣方法（1）去除表層土（2）取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或塑料袋中4.增殖培養（富集培養） 目的：提高樣品中目的菌的數量和比例 原理：通過控制營養成分和/或培養條件，使樣品中目的 菌得以大量繁殖而非目的菌的生長受到抑制或繁殖減緩，從而提高樣品中目的菌 的數量和比例 *方法：（1）控制營養成分 （2）控制培養

2、基pH （3）控制培養溫度：30左右培養，可培殖嗜溫微生物5060培養，可培殖嗜熱微生物，篩選耐熱菌株 （4）熱處理增殖芽孢細菌 樣品懸浮液經80、10分鐘處理，殺死營養體，再添加營養培養后可增殖產芽孢細菌（5）添加抑制劑5. 純種分離（一）純種分離的方法 目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養 方法：涂布平板分離法、傾注平板分離法、平板劃線分離法、組織分離法*（二）平皿反應快速檢出法依據是檢測單菌落是否產目的產物并對目的產物的產量進行粗略估計 A紙片培養顯色法：以飽浸含有某種指示劑的固體培養基的濾紙擱置在培養皿中，用牛津杯架空，下放一小團浸有3%甘油的脫脂棉保濕，用接種環將適量細

3、胞懸液接于濾紙上，保溫培養，得到分散的單菌落，菌落周圍形成對應的顏色變化。指示劑變色圈與菌落直徑之比值大者表示產物的產量高，由此可以挑選產量較高的菌株。所用的指示劑是酸堿指示劑或能與產物反應產生有色物質的其他指示劑。B透明圈法：利用混濁的底物被分解后形成透明圈的大小，可以檢出微生物分解利用此物質的能力。可溶性淀粉淀粉酶，粉末碳酸鈣有機酸，酪素蛋白酶C變色圈法：直接用顯色劑或指示劑摻入培養基中，或噴灑至已形成菌落的培養基的表面，根據顯色圈或變色圈等形成而對目的菌進行檢出，稀碘液與淀粉變色圈的顏色及大小E生長圈法：生長圈法是根據工具菌在目的菌周圍形成生長圈而對目的菌進行檢出。工具菌一般為某種生長因

4、子的營養缺陷型，而對目的菌在缺乏該生長因子的瓊脂培養基上生長并分泌生長因子或生長后分泌的某種酶能夠使前體轉化為該生長因子。經過培養后，工具菌會在目的菌周圍形成生長圈。生長圈法用于檢出氨基酸、核苷酸以及維生素等生產菌。F抑菌圈法：是根據工具菌在目的菌的周圍的生長被抑制而形成一個抑菌圈而對目的菌進行檢出。目的菌在生長過程中能分泌抗生物質或能分泌某種酶能將無抑菌作用的前體物質轉化成抗生物質，而工具菌則是對該抗生物質敏感的菌株。此法可以直接在分離培養基中對目的菌進行檢出。但是由于微生物要到生長晚期才能分泌抗生物質，需要培養的時間長，各菌產生的抗菌物質相互干擾，所以往往需要分兩步進行先用不加工具菌的瓊脂

5、培養基對樣品進行純種分離，待菌落形成后，將菌落與周圍小塊瓊脂培養基用直徑6mm的木塞穿孔器一起取出，置于另一無菌培養基中保濕培養4-5天，使微生物所產生的抗生物質在小瓊脂塊中積累；然后，將上述瓊脂塊轉移到涂有工具菌的鑒定板上，保持瓊脂塊之間的距離為2cm左右，培養過夜后即可觀察到抑菌圈，抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中抗生物質濃度的高低。抑菌圈法用于抗生素產生菌的檢出。6. 厭氧微生物的分離方法 厭氧微生物要求在低氧化還原電位的培養基中才能生長。保持低氧化還原電位方法：一是在培養基中加入還原物質（如半胱氨酸等）二是要為微生物創造一個無氧環境.厭氧分離（培養）技術：高層瓊脂柱技術、厭氧罐技術、厭氧手套

6、箱技術7.篩選初篩：通風發酵菌種，通過搖瓶發酵進行，每株一瓶 目的：淘汰80%-90%的分離菌株中的低產菌復篩：每株35瓶，可提前培養種子，使接種量比較一致，35%接種量， 復篩可進行多次，逐步淘汰，留下35株甚至最好的1株 第二節 基因突變1. 突變型的類型： 形態突變型：指細胞個體形態或菌落形態發生改變的突變型營養突變型：野生型菌株由于基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力，這種突變株叫做營養缺陷型突變株。主要有氨基酸缺陷型、維生素缺陷型和嘌呤嘧啶缺陷型抗性缺陷型：由于基因突變而產生對某種化學藥物、致死物理因子或噬菌體具有抗性的變異菌株叫抗性菌株。致死突變型：由于基因突變而導致個體死亡

7、的突變型條件致死突變型：在某種條件下可以正常生長繁殖并呈現其固有表型，而在另一條件下致死的突變型產量突變型：所產生的代謝產物的產量明顯有別于原始菌株的突變株 正變株：產量高于原始菌株； 負變株：產量低于原始菌株。2. 基因突變的特點： (1）自發性 (2）非對應性(3）稀有性 (4）獨立性 (5）可誘 變性(6）穩定性 3. 突變的類型：染色體畸變、基因突變4. 基因突變包括堿基置換和移碼突變，堿基置換分為轉換和顛換5. 基因突變自發性和不對應性的證明個經典實驗：變量實驗、涂布實驗、影印實驗證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應關系！ 6. 基因突變的機制可以分為自發突變和人工誘發突變兩大

8、類 第三節 誘變育種1. 誘變育種： 是選擇合適的誘變因素、處理劑量及處理方法，人為地對出發菌株進行誘變，然后運用合理的篩選程序及適當的篩選方法把優良的變異菌株篩選出來。2.誘變育種的用途首先，通過誘變育種可以提高產物的產量，即可以獲得高產突變株。其次，通過誘變育種可以改善菌種特性。提高產品質量。第三，通過誘變育種可以選育出更適合工業化發酵要求的突變株，簡化工藝條件。第四，通過誘變可以開發新產品。3. 誘變育種的步驟和方法選擇優良的出發菌株， 誘變菌株的培養，誘變菌懸液的制備，誘變處理，后培養，突變株的分離和篩選4. 前培養： 目的是將誘變細胞的生理狀態調整到處于同步生長狀態的旺盛的對數生長期

9、，而細胞內又要含有豐富的內源性堿基。大腸桿菌的前培養方法：（1）用培養24小時的斜面培養物接種LB液體培養基，于37振蕩培養過夜（約16h）；（2）以5接種量轉接新鮮LB培養基，于37培養46h，使細胞處于對數生長期；（3）將上述培養物置46 放1h，低溫誘導同步生長；（4）將經低溫誘導的細胞以20接種量轉接新鮮LB培養基，于37 振蕩培養3050min，使細胞處于同步狀態，立即置冰水裕中保藏10min，離心收獲細胞產生孢子的絲狀菌的前培養方法：取其孢子進行處理，因為多數絲狀菌的孢子是單核。不產生孢子的絲狀真菌的前培養方法：可直接采用年幼的菌絲體進行誘變處理（1）對菌絲尖端進行誘變處理（2）對

10、菌落邊緣菌絲進行處理（3）對小段菌絲懸浮液進行誘變處理5.誘變菌懸液的制備：（1）選擇合適的介質，一般可用生理鹽水或緩沖液制備。（2）使細胞或孢子處于良好的分散狀態。方法：先用玻璃珠振蕩分散，然后用脫脂棉或過濾紙過濾。理由：如果幾個細胞在一起，誘變時劑量不均勻，細胞的變異情況不一致，產生誤差，給篩選帶來麻煩。（3）調節適當的細胞或孢子密度。后培養：是指誘變處理后，立即將處理過的細胞轉移到營養豐富的培養基中進行培養，使突變基因穩定、純合并表達。后培養的另一個重要作用是可以消除表型遲延，即表型的改變落后于基因突變的現象。（1）分離性遲延：在大腸桿菌等細菌中一般含有兩個核質體，突變基因常是隱性的，所

11、以在一個核質體中發生了突變的細胞的表型還是屬于野生型，只有通過細胞分裂而出現同一細胞的兩個核質體中都帶有這一突變基因時，該細胞才表型出突變表型。（2）生理性遲延：是由于原已存在的野生型基因的產物只有通過細胞的多次分裂被”稀釋“到很低的濃度以后，呈隱性的突變型才能得以表達。常用篩選方法：a.隨機篩選（搖瓶篩選）b.平板菌落預篩 根據形態變異淘汰低產菌株 根據平皿生化反應直接挑取高產突變菌株6. 營養缺陷型菌株的篩選 *定義：從自然界中分離到的微生物在其發生突變前的原始菌株稱為野生型菌株。營養缺陷型菌株是野生型菌株經過人工誘變或自發突變失去合成某種營養物質（氨基酸、維生素、堿基等生長因子）的能力，

12、只能在完全培養基或補充了相應生長因子的基本培養基中才能正常生長的變異菌株。營養缺陷型菌株經回復突變或者重組變異后所產生的、在營養要求上與野生型相同的菌株稱為原養型菌株。基本培養基(MM)：它是僅能滿足微生物野生型菌株生長要求的培養基完全培養基(CM)：它是能滿足微生物所有營養缺陷型菌株營養要求的天然或半合成培養基補充培養基(SM)：凡是只能滿足某營養缺陷型生長需要的合成培養基*7.營養缺陷型菌株的篩選方法： 后培養、淘汰野生型、檢出缺陷型、鑒別缺陷型幾個步驟 后培養：在營養缺陷型菌株篩選過程中也將后培養稱為中間培養 淘汰野生型：起到“濃縮”缺陷型的作用，常用的方法有抗生素法和菌絲過濾法。抗生素

13、法原理（細菌青霉素、酵母菌-制霉菌素）：野生型細胞能在基本培養基上生長繁殖，可選用某種抗生素將生長狀態的細胞殺死，而留下不能生長的缺陷型。菌絲過濾法吧（真菌和放線菌）原理：使能在基本培養基上生長形成菌絲體的野生型留在濾膜上，不能生長的營養缺陷型細胞則能透過濾膜。 缺陷型的檢出： a.逐個檢出法：把上述處理液在CM平板上進行分離，然后將平板上長出的菌落用無菌牙簽逐個按一定次序點種到MM、CM平板上的相應位置，經過培養后逐個對照，如果發現某一位置上CM培養基上長出了菌落，而MM培養基上沒有長出菌落，則可以初步認定為這是一個營養缺陷型的菌株。 b.夾層檢出法：先在培養皿內部倒一層MM作底層，冷卻后加

14、上一層含處理細胞的MM層，固定后再繼續加第三層MM。經過一段時間的培養，平板上長出野生型菌落，在皿底相應位置做上記號，再在上面加上一層CM，再繼續培養。在加入CM新長出來的菌落，個體較小，可能是缺陷型菌落。在加入CM之前已經形成的野生型的菌落個體較大。此法雖然操作簡單，但可靠性差，需要對檢出的菌落進一步確認。 c.限量補充檢出法：將經過處理后的菌液接種在含有微量（0.01%或更少量）蛋白胨的MM培養基上培養，野生型迅速生長成大菌落，而營養缺陷型將較慢長成小菌落，因而可以檢出，此法稱為限量法。如果要篩選特定的營養缺陷型，可以在MM培養基中加入這種單一生長因子，此法為補充法。d. 影印培養法：就是

15、采用一種專用的接種工具-“印章”一次將CM平板上長出的菌落依次分別轉接到MM和CM兩個平板上，經培養，分別觀察在兩個平板相應位置長出的菌落，如果在CM上生長，而MM上不長，可初步認定是營養缺陷型，也可省略影印CM，因為從原CM平板上就可以比較出。缺陷型的鑒定：生長譜法：即在同一個平板上測定一個缺陷型菌株對多種生長因子的需求情況，由此確定該菌株是何種生長因子的缺陷型。（1）缺陷型菌株平板的制備： 將待測微生物從生長斜面上用無菌生理鹽水洗下或從液體培養物中離心收集細胞，沉淀物用生理鹽水洗滌后制成濃度為106108個細胞/ml的懸浮液。取0.1ml涂布在MM上，也可以與已融化并冷卻到50的MM混勻，

16、傾注平板。 （2）缺陷營養類別的確定：用于確定營養缺陷型類別的四種營養物質： 不含維生素的酪素水解液或氨基酸混合物或蛋白胨，含有氨基酸類生長因子；水溶性維生素混合物，含有維生素類生長因子； 0.1堿水解酵母核酸液，含嘌呤嘧啶類生長因子；酵母浸出物，含有所有的生長因子。檢測方法：可用濾紙片培養法 取0.5cm直徑的濾紙片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上四個相應位置培養，只要在此濾紙片周圍菌能生長，即可說明此營養缺陷型的類別，（3） 缺陷單一營養因子的確定 營養成分編組 濾紙片培養：將沾有組合營養因子溶液的濾紙片放在涂有試驗菌的MM平板上，培養后觀察生長情況。*8.抗性菌株的篩選辦法：一次性篩選法

17、：在對于出發菌株完全致死的環境中一次性篩選少數抗性突變株的方法，稱為一次性篩選。（適于不是很昂貴的藥物）梯度性篩選法：使用藥物濃度梯度平板篩選在對敏感菌致死的藥物濃度區生長的抗性突變株的方法叫做階梯性篩選法。 第四節 基因重組育種1. 基因重組育種定義：通過兩個細胞間遺傳物質的重組而實現的工業微生物育種稱基因重組育種2.基因重組形式微生物類別供體菌DNA進入受體菌途徑重組涉及的范圍有性生殖真菌 有性孢子的接合整個染色體組準性生殖真菌體細胞的接合整個染色體組細菌接合大腸桿菌等細菌細胞間暫時溝通部分染色體F因子轉導大腸桿菌等細菌細胞間暫時溝通F因子介導個別或少數基因放線菌接合天藍色鏈球菌等放線菌菌

18、絲間連接部分染色體轉導原核微生物細胞間不接觸，噬菌體介導個別或少數基因轉化原核微生物細胞間不接觸，吸收游離的DNA片段個別或少數基因原生質體融合所有微生物原生質體間的融合整個染色體組*3.細菌的接合接合定義： 供體菌（“雄性”）通過性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質粒或其攜帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞，就是接合子。機制(大腸桿菌的接合機制)   接合作用是由一種被稱為F因子的質粒介導。 F因子的四種細胞形式： a）F-菌株， 不含F因子，沒有性菌毛，但可以通過 接合作用接收F因子而

19、變成雄性菌株（F+）； b）F+菌株， F因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。 d）F菌株，Hfr菌株內的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F因子。 細胞表面同樣有性菌毛。（1） F+與F-菌株之間的接合的結果使受體菌F-菌株轉變成F+菌株。當兩菌株接觸后，通過性纖毛所形成的接合管將兩細胞溝通，供體菌中的F因子通過滾環復制產生一條單鏈F因子DNA，單鏈F因子DNA經過接合管進入受體菌細胞內，在受體菌細胞內，單鏈DNA的互補鏈合成，形成雙鏈，通過環化形成環狀F因子，最后供體菌和受體菌都為F

20、+細胞。（2） Hfr菌株與F-菌株的結合的結果是受體菌獲得供體菌的染色體DNA片段導致基因重組形成重組子。當兩菌株接觸后，通過接合管將兩細胞溝通，供體菌中整合有F因子的染色體片段DNA從轉移起始基因oriT處開始通過接合管向受體菌中轉移。*4.轉化：定義：指某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型細胞的游離DNA，并將其整合到自己染色體基因組中，從而獲得后者遺傳性狀的現象。通過轉化方式而形成的重組子，稱轉化子。參與轉化的基因供體只是游離DNA分子，稱為轉化因子。感受態:    研究發現，能發生轉化的受體細胞都處于感受態。   

21、 感受態是指受體細胞最易接受外源DNA片段并能實現轉化的一種生理狀態。    感受態細胞具有攝取外源DNA能力的細胞。 感受態受遺傳控制，但也存在個體差異。 感受態出現的時間不同；感受態細胞所占比例和維持時間不同；外界環境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2+等對感受態也有重要影響。轉化過程： 每個受體細胞表面約有30-80個轉化因子結合點，當轉化因子結合到受體表面結合點上時，DNA一條鏈被受體細胞膜上的核酸酶分解，另一條鏈進入受體細胞，通過整合與受體細胞進行基因重組。感受態細胞的建立；DNA的結合和攝取；供體雙鏈DNA與受體細胞壁上的接受位點相結合。通過核酸酶的作用

22、，一條鏈被核酸酶降解，降解產生的能量協助把另一條鏈推進受體細胞。轉化子和染色體重組單鏈進入受體細胞后，與雙鏈結構的受體染色體DNA同源片斷發生交換重組通過DNA復制和細胞分裂而表現出轉化性狀，形成轉化子。*5.轉導定義：轉導是以噬菌體作為媒介，將一個細胞的遺傳物質傳遞給另一個細胞的過程。轉導分兩步完成：噬菌體首先感染供體細菌，通過細菌的裂解釋放出攜帶有供體菌染色體基因的轉導噬菌體，然后轉導噬菌體感染受體菌，將所攜帶的供體染色體基因傳遞到受體菌種。轉導噬菌體指的是攜帶有細菌染色體基因的噬菌體顆粒。轉導噬菌體內的遺傳物質可以是部分噬菌體基因組和細菌染色體DNA的個別基因（如局限性轉導噬菌體），也可

23、以全部是細菌染色體DNA而不含有噬菌體基因組（如普遍性轉導噬菌體）*轉導分為局限性轉導和普遍性轉導兩類。局限性轉導指的是只能傳遞供體細菌染色體上原噬菌體整合位點少數基因的轉導，普遍性轉導能傳遞供體細菌染色體上任何基因的轉導。普遍性轉導：    通過極少數完全缺陷噬菌體對供體菌任何小片段DNA進行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現象，稱為普遍性轉導。   一般用烈性噬菌體或經過改造的溫和噬菌體作為普遍性轉導的媒介。普遍性轉導的三種后果 A.進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩定的轉導子。  &

24、#160;B.流產轉導:（一）DNA不能復制，因此群體中僅一個細胞含有DNA，而其它細胞只能得到其基因產物，形成微小菌落。（二）轉導DNA不能進行重組和復制，但其攜帶的基因可經過轉錄而得到表達。 C.外源DNA被降解，轉導失敗。局限性轉導： 指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉導子的現象。 特點：只局限于傳遞供體菌核染色體上的個別特定基因，一般為噬菌體整合位點兩側的基因；該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；缺陷噬菌體的形成方式是由于它在脫離宿主核染色體過程中，發生低頻率的誤切而形成；局限轉導噬菌體的產生要通過UV等因素對溶源菌的誘

25、導并引起裂解后才產生。局限性轉導與普遍性轉導的主要區別： a）局限性轉導中，被轉導的基因與噬菌體DNA共價連接，與噬菌體DNA一起進行復制、包裝以及被導入受體細胞中。而普遍性轉導包裝的可能全部是宿主菌的基因。 b）局限性轉導顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因導入受體，故稱為局限性轉導。而普遍性轉導攜帶的宿主基因具有隨機性。 第六節 菌種退化、復壯與保藏1.退化*菌種退化的原因：基因自發突變退化是發生在群體細胞中的一個從量變到質變的逐步演變過程。 自發突變率10-810-9 加速退化的因素：傳代次數過多、不適宜的培養條件*防止退化的措施（1）控制傳代次數（2）創造良好的培養條件：培養基；培養溫度等 保藏培養基： 細 菌：營養瓊脂 放線菌：高氏一號 霉 菌：察氏培養基 酵母菌：YEPD。（3） 利用不易衰退的細胞傳代：霉菌、放線菌：無性孢子或有性孢子（4） 采用有效的菌種保藏方法 菌種退化的表現 生產性狀的劣化,遺傳標記的丟失, 原有的典型性狀的不典型等菌落及細胞形態的改變、生長速度緩慢、代謝產物生產能力下降，即負突變、致病菌對宿主侵染力下降、抗不良環境條