1、dmd的基因診斷-進修生-給學生 dmd基因診斷中南高校 醫學遺傳學國家重點試驗室 薛晉杰 xunjinjie 概 述 單基因病 ：指由于單個基因的突變而引起的遺傳 病， 其遺傳方式符合孟德爾定律。 人類大約有2.5萬個基因，目前約有2千個單基因病的致 病基因被鑒定。 基因診斷： 利用分子遺傳學技術在dna或rna水平上 對某一基因進行突變分析，從而對特定的疾病進行診 斷。 多數單基因病目前尚無有效的治療。 對于一些嚴峻的單基因病可通過基因診斷和產前診斷 的方法，避開再生育患兒。 dmd疾病介紹 duchenne muscular dystrophy (dmd)假肥大型(進行性)肌養分不良 杜

2、氏肌養分不良 兒童最常見的致死性肌肉疾病 遺傳方式：x連鎖隱性遺傳 發病率：1/3500 活產男嬰 dmd臨床特征 35歲隱襲起病，病情進行性加重，9 12歲 不能行走，多于20歲左右死亡。 學步較晚，不情愿行走或跑、行走緩慢，活力 下降、易于跌倒、不能跳動、上樓困難。 90%有肌肉假性肥大，腓腸肌最明顯，觸之堅 韌。 鴨步：骨盆帶肌肉無力。 gower征：自仰臥位起立時，先翻身轉為俯臥 位，屈膝、髖關節，用手按壓膝部以幫助股四 頭肌的肌力，雙手攀附下肢緩慢地站立。 肩胛帶肌受累松弛，呈游離肩；前鋸肌和斜方肌萎 縮無力，兩臂前推或上舉時，肩胛骨呈翼狀直立于 背部，稱翼狀肩。 大多數伴心肌損害，

3、少數可消失充血性心力衰竭。 30%患兒有不同程度的智力障礙。 腱反射減弱，直至消逝 肌酶：ck等活性明顯上升 肌電圖：肌源性損傷 免疫組化：蛋白消逝或削減。 晚期多因呼吸道感染，心力衰竭死亡。 bmd:貝氏肌養分不良，臨床特征同dmd,發病 年齡較晚，進展緩慢，病情較輕，存活期長。 dmd基因 定位： 位于xp21 結構： 全長2.5mb,是人類最大基因； cdna長14kb,含 79個外顯子。 功能：表達 dystrophin蛋白，具有細胞支 架、抗牽拉、防止細胞膜在收縮活動時 撕裂。 突變類型： 缺失型：6065%; 點突變 和微缺失：30%;重復型突變：5% 發病機制dmd基因 dyst

4、rophin蛋白 與肌膜上的其他蛋白形成dapc復合體 在細胞外基質和細胞骨架蛋白之間形成一個跨膜結構 愛護肌纖維和肌膜在長期的反復機械收縮過程中免受損傷和壞死 dmd的危害 發病率高 致死性肌肉病 多于13歲前失去獨立行走力量，青春 期后期死亡 給家庭帶來沉重的精神和經濟負擔 目前沒有有效的治療措施 dmd基因檢測常用方法 18個外顯子的多重pcr技術 連鎖分析單體型分析 胎兒性別鑒定 變性高效液相色譜dhplc mlpa 基因測序 多重pcr技術 多重pcr( mpcr) 在一個pcr體系中由多對不同的引物同時 擴增多個不同的dna片斷。 dmd基因兩組9重pcra組：4、8、17、19、

5、44、45、48、51、60 號外顯子 b組：pm 、3、6、12、13、43、47、50、52號外顯子 突變檢出率：60%左右。 mpcr 反應體系試劑(reagents) 10 buffer mgcl2 dntps(10 mm) gold taq(5 u/ l) 體積(volume) 1 l1 l 0.3 l 0.15 l 2.5 l 0.7 l 4.35 l primers (100ng/ l)dna模板 (30 ng/ l) ddh2o mpcr 反應條件 連鎖分析 目的：檢測攜帶者 非缺失型的產前診斷與mpcr聯合分析 方法：在dmd基因內部及下游200kb范圍選擇11個雜合度較高的微衛星 (str)位點，進行單體型分析 11個微衛星位點具體狀況 marker名稱 5ca 2ca 1 1 等位基因 2 2 3 3 4 4 5 5 7ca44ca 45ca 49ca 11 1 1 22 2 2 33 3 3 44 4 4 55 5 5 50ca59ca 63ca 79 ca 3ca 11 1 1 1 22 2 2 2 33 3 3 3 44 4 4 4 55 5 5 5 pcr產物進行變性 聚丙烯酰胺凝膠電 泳 銀染顯色 各重復片斷存在多 種形式 長度最小的重復片 段命名為1 依此類推 留意：基因內部的交換重組