1、1SNPs的檢測方法 2007.4.122SNPs的定義定義：單核苷酸多態性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列序列多態性多態性。 (99.9%)3SNPs的研究意義1. SNPs作為第三代遺傳標記（已知性、可遺傳性、可檢測性），用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。_路標的作用傳統研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遺傳學（表型、基因、蛋白），42.基因多態性研究 研究SNPs本身對機體的影響（生理特征、病理條件下的千差萬別） 5SNPs研究進展和方向1. SNPs數據庫的構建發現2. SNPs功

2、能的研究（在1的基礎上）6SNPs檢測方法1.理想的檢測SNPs的方法 發現未知的SNPs，或檢測已知的SNPs(1) 靈敏度和準確度的要求（反應原理嚴緊）(2) 快速、簡便、高通量 (操作和分析的自動化程度高） (3) 費用相對低廉72.現狀： 到現在還沒有一個符合以上條件的理想方法出現,但根據實際情況,可以選擇出較合適方法。83.每種SNPs的檢測方法都可將之看成由 區分SNPs特異位點的原理方法 和 數據的檢測分析手段 兩部分組成。9SNPs檢測方法的分類一、區分一、區分SNPs 位點的位點的方法方法 1.基于雜交的方法 2.基于酶的方法 3.以構象為基礎的方法 4.直接測序的方法二、檢

3、測分析技術二、檢測分析技術 1.凝膠分析技術 2.熒光檢測技術 3. DNA 芯片 4.質譜檢測技術 101.基于雜交的方法基于雜交的方法n原理: 短的核苷酸探針在和互補的目的片段進行雜交時，完全匹配和有錯配兩種情況下，根據雜交復合體穩定性的不同而將SNPs 位點檢測出來。 （差異越大，檢測的特異性就越好）111）利用Tmn固定溫度 等位基因特異核苷酸探針 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修飾過的探針：引入一個錯配的堿基、 PNA、 LNAs 等n 動態的加熱過程 動態等位基因特異雜交 (dynamic allele-specific hybr

4、idization, DASH) 12核酸肽探針（Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽鍵n特點：1、與靶分子高特異性地結合（3個方面的影響）2、鏈擠入 （形成三鏈復合結構）（表達調控以及反義治療方面）3、對核酸酶和蛋白酶均不敏感（體外應用）131、與靶分子高特異性地結合nTm值高n受鹽濃度影響小（低鹽濃度的體系）nTm更大（一個PNA堿基的錯配會使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特異結合能得到很好的排除。14 LNA(locked nucleic acids) n其結構是在RNA分子的2羥基和核糖環的4碳原子間連入一個亞甲基的“橋”。n特點： 1.能

5、以很高的親和性和互補的DNA、RNA 或LNA 結合（構象更利于雜交的穩定） 2.匹配和不匹配的Tm增加15DASH(dynamic allele-specific hybridization）162）雜交+熒光共振分子信標（雙分子間雜交） 蝎狀探針（分子內雜交）17分子信標（Molecular beacons）18蝎狀探針 （Scorpion primer） 192.基于酶的方法基于酶的方法1）DNA聚合酶2）連接酶3）限制性內切酶4）外切酶FEN5）RNase H201）DNA聚合酶n等位基因特異性PCRn多重等位基因特異性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸測序法21等位基因特異性

6、PCR22Taqman 法23微測序法/引物延伸法24基本步驟（液相）1.設計PCR擴增含SNPs位點的一段DNA2.對PCR產物進行純化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸產物檢測（ 放射性同位素標記法、發光檢測法、凝膠為基礎的熒光檢測法、 質譜分析法、變性高壓液相色譜法等）25APEX (arrayed primer extension)固相26焦磷酸測序法(Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、熒光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶( apyrase) 。n原理：DNA 聚合酶在一種dNTP的存在下進行引物延伸反應,而引物的成功延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引一種發化學發光反應,通過發光計的實時監測來達到檢測的目的。27基本步驟1. 1.測序引物和DNA模板雜交（PCR擴增的、單鏈的），與酶和底物孵育。2.2.四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應體系，如與模板配對，與引物的末端形成共價鍵，dNTP的焦磷酸基團（PPi）釋放出來。3.一系列的酶學反應，發出可見光信號。每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比。4. 4. ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應體系。5.然后加入下一