1、Western一、儀器與試劑及耗材1）儀器：2）試劑：3）雜品與耗材：二、試劑配制：1、母液1）1.0mol/L Tris-HCl Tris (MW121.14) 30.29g超純水 200ml溶解后，用濃HCl調 pH 至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至 250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PH HCl7.4 約 17ml7.5 約 16ml（所需18.5）7.6 約 15ml 8.0 約 10ml2）1.5mol/L Tris-HCl（pH 8.8）（實際：用玻璃瓶配制50ml或100ml，其他材質會被鹽酸腐蝕。）Tris (MW121.14) 9.086g 18.172g 36.34

2、4g 45.43g超純水至 40ml 80ml 160ml 200ml加濃鹽酸量 1.4ml 2.8ml 5.6ml 7ml定容至 50ml 100ml 200ml 250ml溶解后，用濃鹽酸調 pH 至 8.8，最后用超純水分別定容至50ml、100ml、200ml、 250ml，高溫滅菌后室溫下保存。3）0.5mol/L Tris-HCl（pH 6.8）（實際：用玻璃瓶配制50ml或100ml，其他材質會被鹽酸腐蝕。）Tris (MW121.14) 3.028g 6.056g 12.112g 15.14g超純水至 40ml 80ml 160ml 200ml加濃鹽酸量 1.8ml 3.6ml

3、 7.2ml 9.0ml定容至 50ml 100ml 200ml 250ml溶解后，用濃鹽酸調 pH 至 6.8，最后用超純水分別定容至50ml、100ml、 200ml、250ml，高溫滅菌后室溫下保存。4）1.74mg/ml（10mmol）PMSF（實際：一次性離心管配制5或10ml） PMSF 0.0174g 0.0435g 0.087g 0.174g 異丙醇 10ml 25ml 50ml 100ml溶解后，高壓滅菌，-20保存。5）10SDS（實際：一次性離心管配制5或10ml）SDS 0.5g 1g 2g 10g蒸餾水至 5ml 10ml 20ml 100ml50水浴下溶解，室溫保存

4、。如在長期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。6）10過硫酸胺（AP）（實際：一次性離心管配制0.1或0.5ml）過硫酸胺 0.01g 0.05 0.1g超純水至 0.1ml 0.5ml 1.0ml溶解后，4保存，保存時間為 1 周。最好現用現配7）40Acr/Bic（37.5：1）（實際：一次性離心管配制50ml。）丙稀酰胺（Acr） 18.75g 37.5g甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 0.5g 1g超純水至 50ml 100ml37下溶解后，4保存。使用時恢復至室溫且無沉淀。8）20Tween20（實際：一次性離心管配制10ml）Tween20 2ml 5ml 10ml 20ml蒸餾水至

5、10ml 25ml 50ml 100ml混勻后 4保存。9）0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW 119.98） 12g蒸餾水至 500ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。10）0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO4 。12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸餾水至 1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。2、使用液1）單去污劑裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100g/ml PMSF）：1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml

6、蒸餾水至 50ml混勻后， 4保存。使用時，加入 PMSF 至終濃度為 100g/ml（0.87ml 裂解液加入 1.74mg/ml PMSF 50l）。2）0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸餾水至 2000ml3）G250 考馬斯亮藍溶液（測蛋白含量專用）考馬斯亮藍 G250： 100mg95乙醇 50ml磷酸 100ml蒸餾水至 1000ml配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。4）0.15 mol/L NaClNaCl（MW

7、58.44） 0.877g蒸餾水至 100 ml高溫滅菌后，室溫保存。5）100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白標準曲線時，用 0.15 mol/L NaCl 進行 100 倍稀釋成 1mg/ml，20保存。6）12%、10%分離膠； 4、5%濃縮膠12%分離膠 10分離膠 4濃縮膠 5%濃縮膠（兩塊膠，10ml）（兩塊膠，10ml）（兩塊膠5ml）（兩，5ml）超純水 3.2ml 4.85ml 3.16ml 3.5ml40Acr/Bic（37.5： 4.2ml 2.5ml 0.5ml 0.825ml1.5 mo

8、l/L TrisHCl（pH8.8） 2.5ml 2.5ml 1.0mol/LTrisHCl（pH6.8） 0.625ml0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） - 1.26ml 10SDS 100ul 100l 50l 50ul10%AP（過硫酸胺） 55ul 50l 25l 50ulTEMED 5ul 5l 5l 10ul加 TEMED 后，立即混勻即可灌膠。(為了加快凝膠，可以將AP和TEMED量加大，一般加至原來的2-3倍；分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外)，過濾后作為儲存液避光存放于4度，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時

9、溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘)，加入10%AP(0.70.8：100,分離 膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5：100)及TEMED(分離膠用0.4：1000，15%的可用到0.3：1000，濃縮膠用0.8：1000)即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到分子克隆建議濃度。)注：TEMED避光保存7）還原型 SDS（5X）上樣緩沖液（0.25mol/L TrisHCl pH6.8，0.5mol/L 二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚藍，50甘油）0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW15

10、4.5） 0.39gSDS 0.5g溴酚藍 0.025甘油 2.5ml混勻后，分裝于 1.5ml 離心管中，4保存。8）電泳液緩沖液 1X（25mmol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸，0.1 SDS）Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用 35 次。注意：1、 電泳液可以回收重復利用，一般將回收的電泳液加入垂直電泳槽的下半部分，上半部分最好用新鮮的電泳緩沖液2、可以配成10X的電泳緩沖液保存，稀釋10倍使用9）半干轉移緩沖液1X（48mmol/L Tris，39mmol/L 甘

11、氨酸，0.037 SDS，20甲醇）甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8gSDS 0.37g甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復使用 35 次。濕轉電轉液1X：甘氨酸（MW75.07） 11.25gTris（MW121.14） 2.375gSDS 0.375g 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后4保存，次溶液可重復使用35次注意：1、次溶液最好保存在4冰箱，最多使用5次左右，不然影響轉移效率。2、先用蒸餾水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后補足液體，如果先加甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比

12、較困難。3、可以配成2X轉移液進行保存，稀釋后使用10）10X 麗春紅染液麗春紅 S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml使用時將其稀釋 10 倍。11）TBS 緩沖液（100mmol/ L TrisHCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTrisHCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000ml12）TBST 緩沖液（含 0.05Tween20 的 TBS 緩沖液）20Tween20 1.65mlTBS 700ml混勻后即可使用，最好現用現配。13）封閉液（含 5脫脂奶粉的 TBST 緩沖液）脫脂奶粉（國產，安怡牌） 5gT

13、BST 100ml溶解后 4保存。使用時，恢復室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。14）洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巰基乙醇 700l（通風廚里加）SDS 2g0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml超純水至 100ml配制時，在通風廚內進行。4保存?？芍貜褪褂?1 次。15）顯影液（5X）自來水（加熱至 50） 375ml（以下藥品加到溫水中）米吐爾 1.55g亞硫酸鈉（無水） 22.5g碳酸鈉（無水）

14、33.75g溴化鉀 20.95g補水至 500ml配制時，上述藥品應逐一加入，待一種試劑溶解后，再加入后一種試劑。4保存。使用時用自來水稀釋至 1 倍。16）定影液自來水（5060） 700ml （以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸鈉 240g亞硫酸鈉（無水） 15g冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g鉀明礬 15g（水溫冷至 30以下時再加入）加水定容至 1000ml，室溫保存17）抗體用 TBST 稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml18）化學發光試劑購自北京中山公司，為 Santa Cruz 產品，分 A 和 B 兩種試劑。沒錢可用碧云天的ECL三、原理及簡介3.1，原理與S

15、outhern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。3.2 Western Blot 優點1，高分辨率的電泳技術2，特異敏感的抗原-抗體反應3

16、，1-5 ng 中等大小的靶蛋白Western Blot 結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種優點，可檢測到低至 15 ng（最低可到 10100 pg）中等大小的靶蛋白。3.3 Western Blot 應用1，目的蛋白的表達特性分析2，目的蛋白與其它蛋白的互作3，目的蛋白的組織定位4，目的蛋白的表達量分析四 Western Blot 成功要素實驗步驟影響western Blot 成功的要素電泳分離蛋白蛋白抽提；蛋白定量；樣品制備；電泳轉膜膜的選擇；膜的確認；特許處理封閉封閉液的選擇；封閉條件的優化漂洗漂洗液的配制與選擇抗體孵育抗體選擇；抗體稀釋倍數優化底物孵育恰當的發光或

17、顯色底物曝光曝光時間掌控；X-光片；顯影定影試劑后 Western Blot 選擇抗體剝離緩沖液（蛋白印跡膜再生液），底片背景去除劑五 Western Blot基本流程解析（一），蛋白的提取1，A,通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法：針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質。稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑 。有機溶劑提取法：對于分子中非極性側鏈較多的蛋白質可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。B，通過層析或電洗脫法制備目的蛋白2,裂解酶的選取細胞及哺乳動物的組織：目前提取與純化蛋白質最經典的方法是RIPA強、中、弱系列的裂解液及NP-40裂解

18、液、SDS裂解液、哺乳動物蛋白抽提試劑，組織蛋白抽提試劑。這幾種裂解液裂解原理相似，但作用效果不同，實驗者需要根據自身實驗需求來選取合適的裂解方式，例如RIPA（強）裂解液與SDS裂解液是作用效果很強的裂解液，可以使樣本充分裂解，獲取足夠多的蛋白質，使蛋白質充分變性不具有蛋白質活性且較多的基因組等也伴隨著提取出來了。RIPA中、弱裂解液及NP-40裂解液、哺乳動物蛋白抽提試劑、組織蛋白抽提試劑則較之溫和，其缺點就是樣本可能裂解不充分，核、膜蛋白可能提取不完全。具體的選擇可以通過下附表進行選擇。細菌樣本：細菌蛋白抽提試劑、包涵體蛋白溶解液。酵母樣本：酵母蛋白抽提試劑。植物樣本：植物蛋白抽提試劑。

19、細胞樣本：細胞漿/核/膜蛋白抽提試劑盒。Western Blot實驗主要是對蛋白質表達進行相對定量檢測，如果有研究者需要對其進行細胞結構中蛋白質組分定位檢測就需要用到此方法提取蛋白質，此方法是通過裂解液的裂解強度不同來分別提取同一細胞樣本中不同結構的蛋白，這對于研究目的蛋白主要存在細胞于哪個結構中提供必要的技術。在蛋白的提取過程中，因為實驗樣本如細胞、組織中本來就存在的各種蛋白酶在裂解過程中被液釋放出來降解相應的蛋白質，所以在提取過程中不可避免的要使用到蛋白酶抑制劑，目前蛋白酶抑制劑的種類很多，最常用的是PMSF，最有效的是蛋白酶抑制劑混合物，其包含多種蛋白酶抑制劑，可以有效的防止蛋白在提取過

20、程中蛋白的降解。附表：產品名稱Western及IP細胞裂解液RIPA裂解液（強）RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NP-40裂解液SDS裂解液有效裂解成分Triton X-100Triton X-100 deoxycholateSDSNP-40deoxycholate, SDSNP-40deoxycholateNP-40SDS裂解強度溫和強中溫和溫和強對膜蛋白的提取一般很好較好一般一般很好對胞漿蛋白的提取很好很好很好很好很好很好對核蛋白的提取較好很好較好較好較好很好胞漿磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好很好細胞核轉錄因子提取很好很好很好很好很好很好主要用途WB IP,co-IPWBIPW

21、BIPWBIPco-IPWBIPco-IPWBChIP根據檢測蛋白位置選擇合適的裂解液蛋白位置推薦裂解液全細胞NP-40 或 RIPA胞漿（可溶性蛋白）Tris-HCl胞漿（骨架結合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40 or RIPA核蛋白RIPA or 核蛋白提取試劑盒線粒體蛋白RIPA or 線粒體分離試劑盒3,蛋白樣品的定量目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford 法（考馬斯亮藍法）、Lowry 法（Folin-酚試劑法） BCA、法等。但各有優缺點，大家可以根據具體情況選取。按相應蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量

22、一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據具體情況選取。Bradford 法（考馬斯亮藍法）: 考馬斯亮藍 G-250 有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結合后形成藍色化合物，該化合物在 595 nm 處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。 該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質之間差異大，且標準曲線線性差。高濃度的 Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑對測定有干擾。緩

23、沖液濃度過高時，改變測定液 pH 值會影響顯色。 Lowry 法（Folin-酚試劑法）: 福林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理是：首先在堿性條件下蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅復合物，該復合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍色復合物。在一定條件下，藍色強度與蛋白質量成正比，蛋白質濃度范圍約在 25250 g/mL。 雖然該法是測定蛋白質濃度應用最廣泛的方法之一，但其缺點也很明顯，專一性較差，干擾物質多（如Tris 緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化物、酚類、檸檬酸等），標準曲線的直線關系不特別嚴格。因此在其應用過程中有很多新的修正。 BCA 法（二喹啉甲酸法）: 二喹啉甲酸

24、(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry測定法的一種改進方法，是近來廣為應用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性條件下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結合形成穩定的紫藍色復合物，在 562 nm處有高的光吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，據此可測定蛋白質濃度。 與 Lowery 法相比，BCA 蛋白測定方法操作更簡單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性更好，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度高（微量檢測可達到 0.5 g/ml），應用

25、更加靈活。與 Bradford 法相比，BCA 法的顯著優點是不受去垢劑的影響。 BCA 法與 Lowry 法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度最高，且與一系列干擾 Lowry，BCA 反應的還原劑（如 DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。（二），SDA-PAGF1，蛋白樣品變性1.1 SDS陰離子去污劑、變性劑；氨基酸側鏈與 SDS 充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 膠束；蛋白質-SDS 膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異；與強

26、還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質分子線性化。蛋白質-SDS 膠束的特點：具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒；平均1g蛋白質結合14Gsds;短軸對不同的蛋白質亞基-SDS膠束基本上是相同的；長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。1.2 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）1.2.1 SDS-PAGE 基本原理1. SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入 SDS 和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS 是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。2. 強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。

27、使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側鏈與 SDS 充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 復合物。3. 蛋白質分子結合 SDS 陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質之間所帶凈電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。1.2.2 PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 (polyacrylamide gel) 是 由 單 體 丙 烯 酰 胺 （ acrylamide ， 簡 稱 Acr ） 和 交 聯 劑（crosslinker)N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacyl

28、amide，簡稱 Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素 AP）和加速劑（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠?；瘜W惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質。 聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基（free radicals）的催化，使體系發生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學催化（AP-TEMED）和光化學催化（核黃素-TMTED）體系。 1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠分類PAGE 分為連續系統和不連續系統兩大類。連續系統電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中的相同。帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩

29、效應。不連續系統中帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。 不連續電泳不連續系統的濃縮效應：凝膠層的不連續性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。緩沖液離子成分和pH的不連續性：HCl易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在最前面，故稱為快離子或前導離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH6.8 的緩沖液中解離度很小，僅為 0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子

30、或尾隨離子。蛋白質均帶負電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介于快慢離 子之間，于是蛋白質就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區帶。當進入pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由于分子量大，被留在后面，然后分離成多個區帶。（三），轉膜（Trarsmembran）1，轉膜的定義將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如 NC 膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操作容易，轉移效率高；而

31、后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。2，轉移膜的選擇2.1 雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。用于 Western blot 的轉移膜主要有兩種：硝 酸 纖 維 素 （ Nitrocellulose, NC ） 膜 和 聚 偏 二 氟 乙 烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似,主要用于核酸雜交。2.2 NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環境下，大

32、多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的 NC 膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用 0.45 m 和 0.2 m 兩種規格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 m 的膜小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 m 的膜了，如用 0.45 m 的膜就會發生“Blowthrough”的現象。PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和 1-5 秒鐘

33、。2.3 硝酸纖維素（nitrocellulose, NC）膜：NC 與蛋白質靠疏水作用結合，無需預先活化，對蛋白質的活性影響??；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結合在 NC 上的小分子蛋白質在洗滌時易丟失； NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋白質親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。2.4 膜的選擇主要根據： a，膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b，不影響后續的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法

34、，信噪比好）；c，如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜。幾種膜的比較（四），封閉（Blocking）1， 雜交膜上有很多非特異性的蛋白質結合位點，為防止這些位點與抗體結合引起非特異的染色和背景，般用惰性蛋白質或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點來降低抗體的非特異性結合。封閉劑應該封閉所有未結合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。最常見的封閉劑是 BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。5%脫脂奶粉或 BSA（室溫孵育 1 h）West

35、ern Blot 膜封閉液（生物試劑公司）Tween-20 的作用：Tween-20 是一種非離子型去污劑，有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。在做 westen blot 時，用惰性蛋白質或非離子去污劑封閉膜上的未結合位點可以降低抗體的非特異性結合。Tween 這種非離子型去污劑在乳化蛋白時，不破壞蛋白的結構，可減少對蛋白質之間原 有的相互作用的破壞。離子型去污劑如 SDS 則破壞蛋白的結構。2，封閉劑選擇的特殊情況：a，脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標記的抗體一起使用，因為脫脂奶粉含有糖蛋白和生物素b，如果封閉劑中含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因為磷酸酶與印

36、記膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化。C,檢測磷酸化抗體時，不能使用酪蛋白/脫脂奶粉作為封閉劑。3,一般封閉條件為室溫或者 37緩慢搖蕩 12 h，特殊情況也可 4過夜。根據結果情況調整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰地背景。（五），一抗、二抗孵育(Antibody incubation)1，一抗孵育(Primary antibody incubation)參考一抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋一抗。吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗，室溫或 4在搖床上緩慢搖動孵育 12 小時。如果一抗孵育一小時效果

37、不佳，可以在 4緩慢搖動孵育過夜。（注意：抗體濃度過高會導致背景較深，過低會導致和抗原結合不充分，出現假陰性 ）?；厥找豢?。然后加入 Western 洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。2，二抗孵育(Secondary antibody inucubation)參考二的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋標記的二抗吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫4在搖床上緩慢搖動孵育 12 小時?；厥斩谷绻豢狗跤恍r效果不佳，可以在 4緩慢搖動孵育過夜。然后加入 Weste

38、rn 洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。前 2 步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結合，減少背景。同時短時間多次的洗膜（如 5-6 次，每次 3 分鐘）比長時間少次數的洗膜更有效。第 3 步 TBS 洗滌是為了洗去膜上的 Tween-20，因為它可以阻礙底物的沉積。注意事項1. 抗體保存注意事項：收到抗體后按要求離心后再打開

39、管蓋進行分裝和保存！對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20 。分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于 10 ul 每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在 40，避免再凍起來！絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。大部分抗體收到后 40短暫保存 1-2 周對抗體活性是沒有影響的。長期保存，加入疊氮納，防止細菌污染。2. 一抗/二抗使用問題：一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背

40、景；還要注意一抗二抗的匹配。3. 天然和非還原樣品問題： 有些抗體只能識別的表位是非連續氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質一級結構中彼此不連續，但是在空間結構中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結構狀態（抗體說明書中會有特殊說明）。對于緩沖液和凝膠中就不能含有 SDS，并且不能夠對蛋白進行加熱變性。 有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態如氧化狀態，對此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑 DTT和 beta-巰基乙醇去除。（六）蛋白檢測（Detection of proteins）顯影酶促反應比同位素安全且快速，已經成為 Western Blot 的主流檢測方法。酶促反應可以搭配不同的底

41、物從而實現不同的顯色方法：化學發光和底物顯色，前者靈敏度很高，已經達到皮克級別，甚至還有飛克級別的，靈敏度超過了同位素；而后者由于直接顯色而操作簡便且成本低。 大家最為熟悉熟悉當數辣根過氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶 AP（AlkalinePhosphatase） 此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶，（Glucose Oxidase） 半乳糖苷酶和（-Galactosidase）。 在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物 5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉化為藍色的產物；而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物

42、，將 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將 4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發光，在化學增強劑存在下光強度可以增大 1000 倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。 HRP 標記二抗用 DAB 顯色，按順序依次將 DAB 三種劑各取 3 滴于 5 ml 蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色 5-15min 終止反應，對照 Marker 記錄實驗結果， NC 膜晾干掃描保存。將HRP的生色底物顯色有 DAB、4-CN、CN/D

43、AB、AEC 和 TMB 等。HRP 化學發光反應底物主要有 Luminol、ECL 和 SuperSignal 系列?？芍苯訌墓举徺I試劑盒，操作比較簡單，原理如下（二抗用 HRP 標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到 HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。 AP顯色底物生成的產物主要是藍紫色，成像性好容易拍照。 AP的底物顯然更穩定，不像HRP那樣需要 新 鮮 配 制 的 H2O2 一 類 的 不 穩 定 成 分 ， 作 為 試 劑 盒 可 以 保 存 時 間 更 長 。 常 用 顯 色 底 物 的 是 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 -Indolyphosph

44、ate p-Toluidine Salt) ， NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。 底物發光法：將兩種顯色底物 1:1 等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來， 馬上在暗室中將 X 光片覆蓋在膜的上面（時間根據光的亮度來衡量），顯影、定影。（注意：發光法檢測的時候曝光時間要恰到好處，過短會導致曝光不徹底，影響條帶亮度，過長會導致熒光信號衰弱，也會使背景顏色加深）除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗（可通過紫外燈產生熒光）；生物素結合的二抗等等。關于磷酸化蛋白檢測的注意事項： 保持待測

45、蛋白處于磷酸化狀態，在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標本時刻保持在冰浴中。 使用 5%的 BSA 作為封閉試劑，不能使用脫脂奶粉（因為脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現很高的背景）。 請謹記蛋白的磷酸化是需要誘導的，當信號低或者無信號時有可能是磷酸化誘導不充分！確保使用陽性對照。八，膜的重復利用(Membrane recovery)8.1a，膜解析的方法. 通過加熱和去污劑進行解吸，原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學發光底物系統。b，酸解吸，原理：使用低 pH 改變抗體結構從而使結合位點失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學發光底物系統。兩

46、種方法都不能去除由顯色檢測系統產生的有色沉淀物（例如 BCIP、4-CN、DAB 和 TMB）。然而，仍可以用針對不同靶蛋白的特異性抗體分析印跡膜。重要提示：在各次免疫檢測之間不應使印跡膜干燥。印跡膜干燥將會使任何剩余抗體與膜永久性結合。8.2通過加熱和去污劑進行解吸：儀器和溶液：解吸液：100 mM 2-巰基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH6.7，磷酸鹽緩沖液（PBS）：10 mM 磷酸鈉，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl，淺托盤，大小足以將膜放入其中。操作：a. 在通風櫥中，將印跡膜放入解吸液中在 50下振搖 30 分鐘。b. 將印跡膜放入緩沖液中振

47、搖 10 分鐘。用新緩沖液重復漂洗兩次。c. （可選）重復起始檢測方法（忽略一抗步驟），確保已滅活抗體或已從膜上解吸抗體。d. 將印跡膜放入緩沖液中振搖 10 分鐘。e. 繼續下一輪檢測的封閉步驟。2. 酸解吸儀器和溶液：解吸液：25 mM 甘氨酸- HCl，pH2，1%（w/v）SDS，磷酸鹽緩沖液（PBS）：10 mM 磷酸鈉，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl，淺托盤，大小足以將膜放入其中。操作：a. 將印跡膜放入解吸液中振搖 30 分鐘。b. 將印跡膜放入緩沖液中振搖 10 分鐘。用新緩沖液重復漂洗。c. 繼續下一輪檢測的封閉步驟。九 ，操作詳細步驟（一）， 蛋白樣品制備（1） 單

48、層貼壁細胞總蛋白的提取：1.培養的細胞(定性)： 去培養液后用溫的PBS沖洗23遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。 對于6孔板來說每孔加200300l，6080的1×loading buffer。 100，1min。 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 23次。 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置于0后在1400016000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 待樣品恢復到室溫后上樣。2.培養的細胞(定量)： 去培養液后用溫的PBS沖洗23遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上1020min。 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲(100200w)3s，2次。 12000g