1、基因工程藥物概念性問題基因工程概念性問題 1、基因和基因組的概念 2、基因工程中常用的工具酶 3、基因工程克隆載體 4、基因治療與轉基因動物1、基因和基因組 基因：基因是染色體上呈直線按順序陳列的遺傳單位，基因是攜帶遺傳信息的構造單位，又是控制遺傳性狀的功能單位。基因除編碼序列外還應包括保證轉錄所必需的調控序列及位于編碼區(qū)上游5端的啟動子非編碼序列、內含子和位于編碼區(qū)下游3端的終止子非編碼序列。 編碼區(qū)是基因功能發(fā)揚的構造基因或稱功能基因，調控序列和啟動子起調控啟動作用，終止的非編碼區(qū)屬于調控基因。 染色體總長不到0.5m，而DNA分子總長可達數(shù)米。染色體上的基由于DNA分子。1、基因和基因組

2、 基因組是表示某物種單倍體的總DNA，對于二倍體高等生物，其配子的DNA總和即為一組基因組。 重疊基因overlapping genes：不同基因的核苷酸序列有時為相鄰的兩個基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因。 病毒基因組 細菌基因組 真核生物基因組病毒基因組的特點 構造簡單，無細胞構造。基因組由DNA或RNA組成，可為單鏈或雙鏈，亦可呈環(huán)狀或線狀。基因組小，含基因數(shù)少。 基因組中存在調控元件和轉錄單元。 有重疊基因存在。 以RNA為基因組的逆轉錄病毒。典型的逆轉錄病毒有三個基因，即由gag中心蛋白、pol逆轉錄酶和env包膜蛋白組成，其基因構造如下圖：病毒基因組的特點 RNA基

3、因組的兩端含有U3RU5兩個完全一樣的正向反復序列，從而在兩末端構成了長末端反復序列LTR。LTR為激活、加強和調理病毒復制的重要區(qū)段。因此LTR在人類基因組中的整合也可促進其下游基因的活化和表達，如原癌基因被激活后致癌。U3U3RRU5U5病毒DNALTRLTRgagpolenv35DNA+DNA35細菌基因組的特點 由一條雙鏈DNA組成，為無核仁、核膜的原核構造。 蛋白質基因通常是單拷貝基因。而rRNA基因那么是多拷貝的。 細菌中的構造基因中無內含子，無核膜，普通是邊轉錄邊在胞漿中直接合成蛋白質。 無基因重疊構造 DNA分子中有多種功能調控區(qū)，如復制起始區(qū)、復制終止區(qū)、轉錄啟動區(qū)及轉錄終止

4、區(qū)等，這些區(qū)域常具有反向反復序列。細菌基因組的特點 質粒plasmid是染色體以外的遺傳物質，是環(huán)狀的DNA分子。不同細菌中的質粒大小不一103105bp。在酵母和其它真菌中也發(fā)現(xiàn)有質粒。 質粒DNA的功能類型有三種：1F質粒F因子由稱性質粒。控制菌毛構成，利于定居，質粒可由性菌毛來進展質粒傳送和轉移；2R質粒抗藥性因子能編碼一種或幾種抗菌素的抗性物質；3col質粒大腸桿菌因子質粒中含有編碼大腸桿菌素的基因，編碼的大腸桿菌素可使近緣的細菌致死或抑制生長。有的可編碼毒素。真核基因組的特點 大而復雜，人的單倍體基因組為3109bp，比原核生物大數(shù)千倍，其體細胞基因組為雙倍體，即有2份同源的基因組。

5、 存在大量低度、中度和高度反復序列 基因組中功能基因大多是不延續(xù)的，為斷裂基因splitgene中間被不編碼蛋白質的插入序列內含子所隔開。 基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)，約占總DNA的90%。 基因組DNA大多與蛋白質結合構成染色體，其中DNA約占35%，RNA占5%，其他的60%為組蛋白和非組蛋白。真核基因組 C值和C值矛盾：一個單倍體基因組中的全部DNA量稱為該物種DNA的C值C value。 單拷貝序列：一部分與蛋白質及酶類表達有關 中度反復序列：通常是非編碼序列，與單拷貝基因間隔陳列，少數(shù)成串陳列在一個區(qū)域。 高度反復序列 多基因家族：、真核基因組中許多來源一樣、構造類似、功能相關的基因

6、在染色體上成串存在，這樣一組基因稱為基因家族gene family。基因的新概念 挪動基因movable gene又叫轉位因子transposable elements，可以在染色體基因組上挪動，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱騰躍基因jumping gene，后來稱其為insertion sequences如今普通叫IS elements。如今已發(fā)如今細菌中存在著三種類型的轉位因子，相對分子質量小于2000bp的普通叫插入序列IS，大于2000bp的稱為轉位子Transposon，Tn，第三種類型為噬菌體Mu和D108。2、基因工程中常用的工具酶 基因的重組與分別涉及一系列相互關聯(lián)的酶促反響

7、。在眾多的核酸酶中，限制性核酸內切酶又稱限制酶，restriction enzyme和DNA銜接酶ligase的發(fā)現(xiàn)和運用，才真正使分子的體外切割和銜接成為能夠。 限制性核酸內切酶是一類可以識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割雙鏈DNA雙鏈構造的核酸內切酶。它們主要是從原核生物中分別純化出來的。 在核酸內切酶的作用下，侵入細菌的“外源DNA分子被切割成不同大小的片段，而細菌本身的DNA由于修飾酶的維護作用，可免于本身限制酶的降解。限制性核酸內切酶分類和命名 分類：即、型酶主要特性型型型1、限制和修飾作用單一多功能的酶分開的核酸內切酶和甲基化酶具有一種共同亞基的雙功能酶2、限制酶

8、的蛋白構造3種不同的酶單一的成分2種不同的亞基3、限制造用所需輔助因子ATP、mg2+、S- 腺苷甲硫氨酸mg2+ATP、mg2+S- 腺苷甲硫氨酸4、切割位點能夠隨機切割位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3端2426bp5、序列特異性的切割不是是是6、在DNA克隆中的用途無用非常有用有用限制酶的命名 1用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母，組成的3個字母的略語表示寄主菌的物種稱號。例如大腸桿菌escherichia coli用Eco表示，流感嗜血菌haemophilus influenzae用Hin表示。 2用一個寫在右下方的標注字母代表菌株或型，例如 EcoR。假設限制和修飾體系在

9、遺傳上是由病毒或質粒引起的，那么在縮寫的寄主菌的種名右下方附加一個標注字母，表示為染色體外成分。例如EcoR I, EcoP I。 3假設一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體系，那么以羅馬數(shù)字。如流感嗜血菌Rd菌株的幾個限制與修飾體系分別表示為Hind I、Hind II、Hind III等。 4原先的命名如今得到簡化，原那么為：把一切略語字寫成一行；命名酶稱號不再特別標出限制酶或修飾酶，即略去R與M字母。II型限制性核酸內切酶的根本特性 1在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子構成鏈的斷裂； 22個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的； 3斷裂的結

10、果構成的DNA片段，也往往具有互補的單鏈延伸末端，但平末端例外。 絕大多數(shù)的II型限制酶都能識別由4、5、6或7個核苷酸組成的特定核苷酸序列。該序列稱為識別序列。切割位點C-C-G-C-G-G切割位點G-G-C-G-C-C5335對稱軸DNA銜接酶和DNA分子的體外銜接 目前知有3種方法可以用來在體外銜接DNA片段：第一種是用DNA銜接酶銜接具有粘性末端的DNA 片段；第二種方法是用T4DNA銜接酶直接將平末端的DNA片段加上PolydA-Poly(dT)尾巴之后，再用DNA銜接酶將它們銜接起來；第三種是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物，使之構成粘性末端之后，再用DNA銜接酶銜接。其它

11、工具酶 1大腸桿菌DNA聚合酶IE. Coli DNA Pol I DNA聚合酶I由兩種亞基組成，帶有3種酶活性。它的大亞基相對分子量為7900，帶有聚合活性和3外切核酸酶活性，小亞基只需5外切核酸酶的活性。其它工具酶 2DNA聚合酶I大片段klenow酶 klenow酶的相對分子量為7600。是經過Subtillisin枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亞基，只保管大亞基部分。所以這種酶具有DNA聚合酶的活性和3外切酶的活性，但是沒有5外切核酸酶活性。其它工具酶 3T4DNA銜接酶 此酶是從噬菌體T4感染的E. coli中分別的，和klenow大片段一樣，具有5-3聚合酶活性和

12、3-5外切酶活性。其外切酶活性比E. coli DNA聚合酶I的活性高200倍，此外，T4聚合酶有第三種活力取代反響。其它工具酶 4逆轉錄酶 這是一種有效的轉錄RNA為DNA的酶。又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。其產物DNA又稱為cDNA，即互補DNA。最普遍運用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒AMV的逆轉錄酶，由和兩條亞基組成，其相對分子質量分別為65000和95000，這種酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。外切活性：如從DNA-RNA雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進而保管新合成的DNA鏈。其它工具酶 5末端脫氧核苷酰轉移酶 從小牛胸腺或髓細胞中分別得到的，它催化DNA片段上的3-OH端加接脫氧

13、核苷酸。合成的方向是從底物的5端向3端進展。 6核酸酶S1 是從半曲霉菌中分別得到，可以降解單鏈DNA和RNA，產生5磷酸化單核苷酸或寡聚核苷酸。又稱單鏈特異的核酸酶。其它工具酶 7核酸酶BAL31 從乳白短桿菌細胞中分別的。它能以漸進的方式從線型DNA分子的3、5兩邊同時降解，構成小的寡聚核苷酸片段或單核苷酸。 在基因工程中可被用于組建DNA的物理圖譜以及呵斥克隆DNA分子的末端缺失。其它工具酶 8外切核酸酶III 從大腸桿菌中分別得到，功能是將帶有3-OH末端的雙鏈DNA從3到5端方向切除，產生5單核苷酸。此外該酶還帶有內切核酸酶活性、RNaseH活性和3磷酸酶活性。 在基因工程中制備單鏈

14、DNA，以便用作DNA聚合酶反響的DNA模板； 在基因工程中制備對DNA有特異性的探針。其它工具酶 9T4多聚核苷酸激酶 此酶能將ATP上的位磷酸轉移到DNA或RNA的5-OH上，酶作用底物是 單鏈或雙鏈帶有5-OH末端的DNA或RNA。其它工具酶 10堿性磷酸酶 從細菌中分別得到的堿性磷酸酶稱為BAP酶，從小牛內臟中分別制備的酶稱為CAP酶。該酶的功能是以單鏈或雙鏈DNA、RNA為基質，將DNA或RNA片段5端的磷酸切除。其它工具酶 11甲基化酶 大部分大腸桿菌菌株中含有兩種與DNA甲基化作用有關的酶，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。3、基因克隆載體 基因工程中所用的載體，主要有5類：a、質粒，主要指人工構建的質粒；b、噬菌體的衍生物；c、cosmid；d、單鏈DNA噬菌體M13；e、動物病毒。 載體的本質是DNA少數(shù)為R