1、實(shí)驗(yàn)九 總糖和還原糖的測定(二)3,5二硝基水楊酸法一、目的要求：掌握還原糖和總糖的測定原理，學(xué)習(xí)用比色法測定還原糖的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5 二硝基水楊酸(DNS )與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量 的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在 540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與 光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。OH NO 2OH NH 2HOOC+還原糖HOOCNO 2NO2(DNS)(3 氨基5硝基水楊酸)？黃色桔紅色三、試劑和器材1試劑(1) 1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg

2、,加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為 1.0mg/ml。(2) 3,5二硝基水楊酸試劑：稱取 6.3 g 3,5 二硝基水楊酸并量取 262 ml 2mol/L NaOH 加到酒石酸鉀納的熱溶液中(182 g 酒石酸鉀納溶于500 ml水中)，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到1000 ml貯于棕色瓶中。(3) 碘碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。(4) 6N NaOH ：稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。(5) 0.1%酚酞指示劑。(6) 6 mol/L HCl 溶液2、材料小麥淀粉或玉米淀粉。3、

3、器材分光光度計(jì)，天平，水浴鍋，電爐，試管若干等。四、操作方法1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取8支15mM 180mm試管，按下表加入 1.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水。AvV 口呂號(hào)試劑012345678葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.4水楊酸溶液（ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫,再向每管加入21.5 ml蒸餾水，搖勻。入=540

4、nm處測定吸光度以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品中還原糖的提取準(zhǔn)確稱取0.5g小麥（淀）粉，放在 100ml燒杯中，先以少量蒸餾水 （約2 ml）調(diào)成糊狀，然后加入 40ml 蒸餾水，混勻，于50C恒溫水浴中保溫20min，不時(shí)攪拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。3、樣品總糖的水解及提取準(zhǔn)確稱取0.5g小麥（淀）粉，放在錐形瓶中，加入 6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱 0.5h， 取出12滴置于白瓷板上，加 1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈

5、現(xiàn)藍(lán)色。水解畢，冷 卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。4、樣品中含糖量的測定試劑空白還原糖總糖樣品溶液（ml）01.01.0蒸餾水（ml）2.01.01.0水楊酸（ml）1.501.501.50將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5 ml蒸餾水，搖勻。入=540nm處測定吸光度樣品溶液中還原糖和總糖測定后，取樣品的光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。五、結(jié)果處理按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：還原糖以葡萄糖計(jì)）=竺冬其100ffixlOOO總糖（以葡萄糖計(jì)）=丄二稀釋倍數(shù)X 0.9 x 100ffiXlODO式中：C 原糖或總糖提取液的濃度， mg/ml ;V 原糖或總糖提取液的總體積，ml;m樣品重量，g;1