1、基于新一代測序的表觀遺傳學研究 no.g012-1308 表 觀 遺 基于新一代測序的表觀遺傳學研究 傳 學 研究目的 dna 甲基化是表觀遺傳學研究的重點，是基因調控的 通過酶切富集啟動子及 cpg 島區域，并進行 bisulfite 測序， 手段之一，在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發育 同時實現 dna 甲基化狀態檢測的高分辨率和測序數據的高 和腫瘤發生等方面起著至關重要的作用。基于不同的新一代 利用率。研究者進行了全基因組甲基化測序（bs）和 rrbs 測序研究方案，檢測表觀遺傳學變異尤其是基因組的甲基 的比較，發現 rrbs 在啟動子，cpg 島區域具有更高的覆蓋 化，探討甲

2、基化對于生物學功能的影響，并篩選可應用作為 倍數 如圖 1 所示），并且 rrbs 和 bs 具有很好的相關性（如 疾病早期診斷、分級和分型的分子標記。 圖 2 所示）。rrbs 可作為一種更高效經濟的研究方法，在大 規模臨床樣本的研究中具有廣泛的應用前景。 研究對象和取材 研究對象：各類腫瘤、發育、干細胞分化的不同階段。 取樣標準：腫瘤組織與正常組織有明顯區別，組織病理 切片分析腫瘤樣品中腫瘤細胞的比例在 80% 以上；正常樣 品中幾乎不含有腫瘤細胞，或以血液作為正常對照。 新一代測序方案 rrbs（reduced representation bisulfite sequencing）基于

3、 msp| 酶切消化和 bisulfite 處理的高性 價比方法，可對基因組 promoter 區及 cpg 島區域的 dna 甲基化狀態進行樣品之間的比較分析。 圖 1. rrbs 和 bs 在 cpg 島平均覆蓋深度的比較，其中 rrbs 的測 mbd-seq（methylated dna binding domain 序 數 據 為 6g，bs 的 測 序 數 據 是 103.5g。（wang l, et al . j sequencing）由于在哺乳動物中甲基化一般發生在 cpg biotechnol. 2012） 的胞嘧啶 5 位碳原子上，所以可通過特異性結合甲基化 dna 的蛋白

4、mbd2b 富集高甲基化的 dna 片段，并結合 第二代高通量測序，對富集到的 dna 片段進行測序，從而 檢測全基因組范圍內的甲基化位點。 m e d i p - s e q （ m e t h y l a t e d d n a immunoprecipitation sequencing ）通過使用 5' - 甲 基胞嘧啶抗體富集高甲基化的 dna 片段，然后將富集后的 dna 進行高通量測序。 bs（bisulfite sequsencing）bisulfite 處理能夠將 基因組中未甲基化的 c 堿基與甲基化的 c 堿基區分開來， 因此成為表觀遺傳學研究的經典實驗方法。將 b

5、isulfite 處理 與高通量測序技術的結合的 bisulfite sequencing 能夠繪 制單堿基分辨率的 dna 甲基化圖譜，可用于研究特定 圖2 . r r b s 和 b s 甲 基 化 水 平 的 相 關 性 分 析 。 （ w a n g l , e t a l . j dna 區域甲基化與特定表型之間的關聯。 iotechnol. 2012） 案例解讀 案例（二）運用errbs甲基化測序研究前 列腺癌 案例（一）rrbs作為一種高性價比的甲基 化研究方法，在大規模臨床樣本的研究中具 研 究 者 通 過 enhanced reduced representation bis

6、ulfitesequencing（errbs）對 7 個局限性前列腺癌 有廣泛的應用前景 pca 組織樣本，7 個對應的良性前列腺 ben 組織樣本，6 rrbs 是一種準確、高效、經濟的 dna 甲基化研究方 個去勢抵抗前列腺癌 crpc 組織樣本進行了高通量測序。 法，通過酶切富集啟動子及 cpg 島區域進行 bisulfite 測序， 通過對三組樣本的分析，發現甲基化程度隨著疾病嚴重程度 no.g012-1308 的增加而增加，進一步的研究發現大部分的 pca 甲基化改 學 變發生在等位基因特異甲基化區域。 傳 遺 觀 a l a v i 表 v r u s l l a r e v o

7、days days 圖4. hist1h3c 和gnas的甲基化水平和總生存率以及無事件存活率 的相關性分析。u代表未甲基化的病例，m代表甲基化的病例。 （decock a, et al. genome biol. 2012） 案例（四）通過medip-seq檢測急性髓細 b 胞白血病特有的甲基化區域 研究者通過對 12 個急性髓細胞白血病（aml）病人和 4 個正常人的骨髓進行了 medip-seq。通過聚類分析，找 到 了 aml 的 特 有 的 甲 基 化 區 域。進 一 步 的 研 究 發 現， sphkap, dpp6, id4 這三個基因在 aml 中表達量很低， 用去甲基化的藥物

8、處理后，這些基因的表達量都有不同程度 的升高。 a.1 b.1 c.1 圖3. dna甲基化程度隨疾病嚴重程度增加而增加。a. 三組樣本 cpg島 和非cpg島區域的dna甲基化程度 b. 韋恩圖顯示從ben到pca sphkap dpp6 id4 和從pca到crpc的甲基化程度增加的cpg島區域的交集。（lin pc, et al. neoplasia. 7>2013） 案例（三）運用mbd-seq檢測神經母細胞 瘤預后甲基化生物標志 a.2 b.2 c.3 研究者通過 methyl-cpg-binding domain mbd-seq sphkap dpp6 id4 方法，對 8

9、個神經母細胞瘤細胞系進行了高通量測序。通過 高通量測序，初步篩查到了 43 個候選的生物標記。后期研究 者又通過在 89 個初級神經母細胞瘤樣本中進行進一步的 pcr 驗證，最后篩查出了 hist1h3c 和 gnas 的甲基化 圖5. sphkap, dpp6 和id4 在aml中的表達量。 a.1, b.1, c.1 分別 水平和總生存率以及無事件存活率相關，如圖 4 所示。 表sphkap, dpp6, id4 在aml和正常組織中的表達水平 a.2,b.2, c. 2 分別代表sphkap, dpp6, id4在 oci-aml2和cts細胞系 用dac處理前后的表達水平。（saied

10、 mh, et al. plos one. 2012） 參考文獻 1. wang l, sun j, wu h, et al. systematic assessment of reduced representation bisulfite sequ encing to human blood samples: a promising method for large- sample-scale epigenomic studies. j biotechnol. 2012; 157 1 : 1- 6. 2. lin pc, giannopoulou eg, park k, et al. ep

11、igenomic alterations in localized and advanced prostate cancer. neoplasia. 2013; 15 4 : 373- 83. 3. decock a, ongenaert m, hoebeeck j, et al. genome-wide promoter methylation analysis in neuroblastoma identifies prognostic methylation biomarkers. genome biol. 2012; 13 10 : r95. 4. saied mh, marzec j, khalid s, et al. genome wide analysis of acute myeloid leukemia reveal leukemia specific methylome and subtype specific hypomethylation of repeats. plos one. 2012; 7 3 : e33213. guangz