1、第十三章第十三章檸檬酸發酵檸檬酸發酵檸檬酸檸檬酸n檸檬酸(Citricacid)分子式為C6H807。外觀為白色顆粒狀或白色結晶粉末，無臭，具有令人愉快的強烈的酸味，相對密度為1.6550。n檸檬酸易溶于水、酒精、不溶于醚、酯、氯仿等有機溶劑。商品檸檬酸主要是無水檸檬酸和一水檸檬酸，前者在高于36.6的水溶液中結晶析出，后者在低于36.6水溶液中結晶析出。它天然存在于果實中，其中以柑桔、菠蘿、檸檬、無花果等含量較高。n檸檬酸是生物體主要代謝產物之一。檸檬酸檸檬酸1784年由年由Scheels氏發現氏發現1893年前，主要用柑橘、菠蘿、檸檬等果實提取檸檬酸年前，主要用柑橘、菠蘿、檸檬等果實提取檸

2、檬酸1893年德國微生物學家年德國微生物學家Wehmer發現二種青霉菌可以生成檸檬發現二種青霉菌可以生成檸檬酸酸1917年年Currie使用黑曲霉淺盤發酵生產檸檬酸使用黑曲霉淺盤發酵生產檸檬酸1923年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的年美國科學家研究成功了以廢糖蜜為原料的淺盤法淺盤法檸檬檸檬酸發酵，并在比利時設廠生產。酸發酵，并在比利時設廠生產。1938年年Perquin和和1942年年Karrow進行了檸檬酸的深層發酵研究進行了檸檬酸的深層發酵研究 1951年美國年美國Miles公司首先以淀粉質為原料，經水解后深層發公司首先以淀粉質為原料，經水解后深層發酵大規模生產檸檬酸。酵大規模生產檸

3、檬酸。檸檬酸檸檬酸 檸檬酸檸檬酸n我國1953年采用淺盤法發酵生產檸檬酸，n1968年用薯干為原料采用深層發酵法生產檸檬酸成功，由于工藝簡單、原料豐富、發酵水平高，各地陸續辦廠投產，至20世紀70年代中期，檸檬酸工業已初步形成了生產體系。n我國檸檬酸行業：產量位居世界第一；從技術上，處于世界領先水平，并遠遠領先于其他國家，其優勢優勢在于：1.發酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能，當淀粉原料被液化后，即可進行發酵，不需要將淀粉水解成葡萄糖，n簡化了生產工藝，降低了生產成本。簡化了生產工藝，降低了生產成本。2.采用邊糖化邊發酵工藝，但發酵周期只有64小時，生產周期比國外要短。3.檸檬酸的產酸速度大

4、大高于國外水平。n平均產酸速率是國外的平均產酸速率是國外的2倍。倍。檸檬酸的消費領域：飲料行業占4045食品添加劑等占1520洗滌劑占2030醫藥占5其它占10我國有機酸行業發展的思考（2011年8月）我國檸檬酸年產能已經達到百萬噸，占世界的70左右；年產量達70余萬噸，約占世界的65；年出口量50萬噸，超過世界貿易總量的一半。我國是世界上最大的檸檬酸出口國，主要出口到印度、美國、歐洲、日本等地。但在1970年時，我國的檸檬酸年產僅有130噸我國檸檬酸發酵生產的回顧和展望n我國于五十年代初期開始檸檬酸淺盤發酵研究，n1968年輕工業部發酵研究所與黑龍江和平糖廠合作，首先完成了甜菜糖蜜淺盤表面發

5、酵并投入工業化生產。n1965年，上海市工業微生物研究所篩選出N558菌種，并與天津工業微生物研究所，南通發酵廠等合作，使之用于工業化生產，并在全國推廣，形成我國獨特的薯干直接深層發酵法生產檸檬酸。我國檸檬酸發酵生產的回顧和展望我國檸檬酸發酵生產的回顧和展望 n從七十年代到九十年代，我國一直致力于檸檬酸生產菌種的改進，n1990年，上海市工業微生物研究所完成國家七五攻關項目篩選出860菌種，發酵產酸達20，n上海市工業微生物研究所開始以薯渣為主原料，以黑曲霉為菌種，固體發酵法生產檸檬酸鈣的研究。并于1977年中試成功并投入生產，現在全國已有四十余個工廠，采用固體發酵法由薯渣生產檸檬酸及檸檬酸鈣

6、產品。n我國以石油原料發酵檸檬酸開始于1970年，先后在天津、上海、沈陽等地進行研究，并一度投入小規模試驗生產，是用正烷烴為原料，以解脂假絲酵母為菌種，發酵產酸達13以上，轉化率140以上，但因檸檬酸只占總酸的50%（另一半為異檸檬酸）而且由于成本較高及石油原料緊缺和食用安全性等原因，未能堅持研究和生產。n我國的發酵技木及生產水平，特別是菌種及發酵工藝均為世界領先水平。n薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深層發酵技術為我國所獨有。n國外發酵罐容積通常在200m3，并較早實現自動控制；我國的最大檸檬酸發酵罐為150m3一、檸檬酸在食品中的應用1)飲料與冰淇淋n檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲

7、料以及軟飲料n檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協調，形成適宜的口味和風味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩定性，防止氧化作用。2)果醬與釀造酒n檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進風味，并使產品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。n當葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時，可以用檸檬酸調節，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護色素的作用，以保護果汁的新鮮感和防止變色。n3)腌制品各種肉類和蔬菜在腌制加工時，加入或涂

8、上檸檬酸可以改善風味，除腥去臭，抗氧化。n4)罐頭食品加入檸檬酸除了調酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。n5)豆制品及調味品用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便于后續加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋白、葵花子蛋白的水解，生產出風味別致的調味品。它也可以用于成熟調味品（醬油等）的調味。n6)其它檸檬酸在醫藥、化學等其它工業中也有一定的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補血劑；檸檬酸鈉可用作輸血劑；檸檬酸可制造食品包裝用薄膜及無公害洗滌劑。二、檸檬酸發酵微生物n1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形態特征目前生產上

9、常用產酸能力強的黑曲霉作為生產菌。n在固體培養基上，菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區域為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細胞的菌絲體，無色或有色，有足細胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產生一串串分生孢子。二、檸檬酸發酵微生物n2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征n黑曲霉生產菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養基上生長、產酸。n生長最適pH因菌種而異，一般為pH37；產酸最適pH為1.82.5。n生長最適溫度為3337，產酸最適溫度在2837，溫度過高易形成雜酸；n斜面培養：麥芽汁4Be的培養基。二、檸檬酸發酵微生物n黑

10、曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強的酶系，能利用淀粉類物質，并且對蛋白質、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。二、檸檬酸發酵微生物n黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、邊發酵產酸的方式生產檸檬酸。三、檸檬酸發酵機理n關于檸檬酸發酵的機制有多種理論，目前大多數學者認為它與三羧酸循環有密切的關系。n糖經糖酵解途徑(EMP途徑)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脫羧形成C2化合物，兩者縮合形成檸檬酸。檸檬酸的溢出代謝檸檬酸的溢出代謝： 多種微生物均能因受刺激而過量合成檸檬酸。研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定環境條件下累積檸檬酸，是因為在這種環境條件下代謝

11、途徑前段的運轉速率大于后段的運轉速率。檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生化機制與培養條件共同起作用的結果。引起溢出代謝的原因原因包括以下三個方面三個方面：高水平的檸檬酸合成能力。這個能力由3個因素構成。第一：是在有高濃度草酰乙酸（OAA）的情況下對AcCoA具有高度親和力的組成型的檸檬酸合成酶（CS）的存在；第二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反應的高水平的組成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；第三：是在缺少錳的條件下，蛋白質分解或蛋白質合成受阻造成的銨的高濃度能解除檸檬酸（CTA）對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，檸檬酸的分泌，降低其胞內濃度。較低的降解檸檬酸的能力。這能

12、力由兩個因素構成。第一：是低水平的-酮戊二酸脫氫酶（KD）影響TCA環運行的暢通程度，使TCA環前半部的中間產物積壓；第二：在錳缺乏的條件下，順烏頭酸酶（AE）和異檸檬酸脫氫酶（ID）的活性降低，從而使檸檬酸的累積比其它幾種酸（順烏頭酸、異檸檬酸和-酮戊二酸）更明顯。在檸檬酸過量合成階段，培養基的pH值顯然會影響細胞膜對目的產物檸檬酸的跨膜輸送；檸檬酸的分泌也會影響培養基的pH值。錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出GG-6-P(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)檸檬酸檸檬酸,NH4I+A1.6二磷酸果糖二磷酸果糖 丙酮酸丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸乙酰乙酰CoA

13、檸檬酸檸檬酸順烏頭酸順烏頭酸異檸檬酸異檸檬酸-酮戊二酸酮戊二酸(丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶)(檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶 )-酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶順烏頭酸酶順烏頭酸酶順烏頭酸酶順烏頭酸酶TCA循環在檸檬酸積累中的調節n1)大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關鍵；n2)丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調節的控制或極微弱;n3)TCA循環的阻斷或微弱(即順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶和酮戊二酸脫氫酶活力降低)，導致檸檬酸積累。而且，當檸檬酸濃度超過一定水平，就抑制異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。回補途徑回補途徑TCA循環重要功能除產能外，為一些氨基酸循環重要功能

14、除產能外，為一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中間產物；和其它化合物的合成提供了中間產物；生物合成中所消耗的中間產物若得不到補充，生物合成中所消耗的中間產物若得不到補充，循環就會中斷；循環就會中斷；回補方式：回補方式：通過某些化合物的通過某些化合物的CO2固定作固定作用，用， 一些轉氨基酶所催化的反應也一些轉氨基酶所催化的反應也能合成草酰乙酸和能合成草酰乙酸和 -酮戊二酸，酮戊二酸， 通過乙醛酸循環通過乙醛酸循環通過某些化合物的通過某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循環的中固定作用使三羧酸循環的中間產物得到回補：間產物得到回補：丙酮酸羧化酶：丙酮酸羧化酶： CO2+丙酮酸丙酮酸+ATP+H2O

15、 Mg+ 草酰乙酸草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶: CO2 +PEP+ H2O 草酰乙酸草酰乙酸+H3PO4蘋果酸酶蘋果酸酶: CO2 +丙酮酸丙酮酸+NADPH+H+ 蘋果酸蘋果酸+ NADP+ 為了能夠在己糖或戊糖的中間代謝物上進行好氧生長，為了能夠在己糖或戊糖的中間代謝物上進行好氧生長，異養微生物異養微生物至少要具備上述幾種酶之種的一個酶。至少要具備上述幾種酶之種的一個酶。CO2固定作用補充TCA環的中間產物轉氨基作用轉氨基作用n定義：定義：-氨基酸的氨基通過酶的催化，轉移到-酮酸的酮基上，生成相應的氨基酸；原來的-氨基酸則轉變成相應的-酮酸。R1 C

16、HNH2 + COOHR2 C=O COOHR1C=O +COOHR2CHNH2 COOH轉氨酶轉氨酶轉氨基作用幾點說明：轉氨基作用幾點說明：（1 1）可逆反應，）可逆反應，（2 2）轉氨酶的輔酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆）轉氨酶的輔酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺胺（3 3）重要的轉氨酶：）重要的轉氨酶： 丙氨酸轉移酶（丙氨酸轉移酶（ALTALT）/ /谷丙轉氨酶（谷丙轉氨酶（GPTGPT） 天冬氨酸轉移酶（天冬氨酸轉移酶（ASTAST）/ /谷草轉氨酶谷草轉氨酶 (GOT)(GOT) ALTALT常用于肝疾患（肝炎等）輔助診斷、常用于肝疾患（肝炎等）輔助診斷、 AST AST 用于心肌疾患（心肌梗塞

17、等的輔助診斷）用于心肌疾患（心肌梗塞等的輔助診斷） CH3 H-C-NH2 + COOH COOH （CH2）2 C=O COOH 丙氨酸丙氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 丙酮酸丙酮酸 谷氨酸谷氨酸ALT：谷丙轉氨酶，急性肝炎時血清谷丙轉氨酶，急性肝炎時血清ALT 活性顯著增高。活性顯著增高。ALT CH3 C=O + COOH COOH （CH2）2 H- C-NH2 COOH COOH CH2 +H-C-NH2 COOH COOH （CH2）2 C=O COOHAST 天冬氨酸天冬氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸 谷氨酸谷氨酸AST：谷草轉氨酶，心肌梗塞時血清含量明顯增高谷草轉氨酶，心

18、肌梗塞時血清含量明顯增高. COOH CH2 + C=O COOH COOH （CH2）2 H-C-NH2 COOH乙醛酸循環乙醛酸循環草酰乙酸草酰乙酸檸檬酸檸檬酸琥珀酸琥珀酸異檸檬酸異檸檬酸蘋果酸蘋果酸延胡索酸延胡索酸乙醛酸乙醛酸乙酰乙酰CoA乙酰乙酰CoA乙酸乙酸乙酸乙酸乙醛酸循環乙醛酸循環能夠利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸轉變為乙酰CoA；然后在異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶的作用下進入乙醛酸循環。乙醛酸循環的主要反應乙醛酸循環的主要反應： 異檸檬酸異檸檬酸 琥珀酸琥珀酸 +乙醛酸乙醛酸 乙醛酸乙醛酸 + 乙酸乙酸 蘋果酸蘋果酸 琥珀酸琥珀酸 + 乙酸乙酸 異檸檬酸異檸檬酸

19、 凈反應：凈反應：2乙酸乙酸 蘋果酸蘋果酸檸檬酸發酵機理n大量的胞內NH4+和呼吸活性提高，使通過糖酵解途徑的代謝得到加強。葡萄糖經EMP通路分解成為丙酮酸，進入三羧酸循環，在丙酮酸脫氫酶復合物作用下氧化成為乙酰CoA及CO2，然后在檸檬酸合成酶作用下與草酰乙酸縮合而形成檸檬酸，而異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸酶因受到抑制，而使檸檬酸得以積累。葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸 乙酰輔酶乙酰輔酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反應固定反應+草酰乙酸草酰乙酸順烏頭酸酶順烏頭酸酶檸檬酸檸檬酸異檸檬酸異檸檬酸異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸KGA（檸檬酸合成酶）（檸檬酸合成酶）檸檬酸發酵

20、機理檸檬酸發酵機理n按照正常的微生物菌體的代謝規律，上述途按照正常的微生物菌體的代謝規律，上述途徑并不能夠積累檸檬酸，而是進入徑并不能夠積累檸檬酸，而是進入TCA循環，循環，被徹底氧化，檸檬酸產生菌之所以能夠大量被徹底氧化，檸檬酸產生菌之所以能夠大量積累檸檬酸，其產生菌菌種必須具備一定的積累檸檬酸，其產生菌菌種必須具備一定的內在因素，也就是：檸檬酸后述的各種酶，內在因素，也就是：檸檬酸后述的各種酶，主要是，主要是，順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶 的的活性喪失或非常微弱，否則，合成的檸檬酸活性喪失或非常微弱，否則，合成的檸檬酸迅速被降解成其他物質。迅速被降解成其他物質。

21、檸檬酸生物合成中的代謝調節與控制追求檸檬酸的高產率n檸檬酸是微生物生長代謝過程中的一個中間性產物，在正常的微生物體內不能夠積累的，如果有積累的話，與檸檬酸合成有關的各種酶的活性，則會受到抑制或阻遏，那么，檸檬酸發酵過程中，這種抑制或阻遏是如何被克服的呢？1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調節n從葡萄糖檸檬酸的合成過程中，PFK是一種調節酶或者稱之為關鍵酶，其酶活性受到檸檬酸的強烈抑制，這種抑制必須解除，否則，檸檬酸合成的途徑就會因為該酶活性的抑制而被阻斷，停止檸檬酸的合成，n研究表明，微生物體內的NH4+，可以解除檸檬酸對PFK的這種反饋抑制作用，在較高的NH4+的濃度下，細胞可以大量形成檸檬酸

22、，那么NH4+濃度是如何升高的呢？ 在正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是 還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。 銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關系，正是由于細胞內銨離子濃度升高，使磷酸果糖激酶對細胞內積累的大量檸檬酸不敏感。1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調節n研究表明，檸檬酸產生菌黑曲霉如果生長在Mn+缺乏的培養基中，NH4+濃度異常的高，可達到25mmol/L，顯然，由于Mn+的缺乏，使得微生物體內NH4+濃度升高，進而解除了檸檬酸對PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不斷的合成大量的檸檬酸。Mn+ 缺乏如何

23、會使缺乏如何會使NH4+濃度升高呢濃度升高呢？n當培養基中Mn+缺乏時，NH4+濃度升高，同時微生物體內積累幾種氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），這些氨基酸的積累，意味著體內蛋白質的合成受阻，而外源蛋白質的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會升高，微生物體內蛋白質和氨基酸的代謝關系可以使用下圖示之：氨基酸氨基酸 合成合成 蛋白質蛋白質 分解分解 氨基酸氨基酸氨基化合成氨基酸氨基化合成氨基酸2.順烏頭酸酶活性的控制n該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環，大量生成檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產生菌體內該酶的活性本身就要求很弱，但在發酵過程中仍需要控制它的活性。由

24、于該酶的活性受到Fe2+的影響，控制培養基中的Fe2+的濃度，可以使該酶失活。因此，檸檬酸發酵要求采用不銹鋼反應器，目的就是控制培養基中的Fe2+的濃度。但是在檸檬酸發酵過程中，培養基中的Fe2+的濃度又要求不能夠低于0.1mg/L，原因目前尚沒有搞清楚。隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活(順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時失活)，更有利于檸檬酸的積累及排出細胞外。 順烏頭酸酶的活性：從理論上推測，順烏頭酸酶失活，三羧酸循環阻斷是累積檸檬酸的必要條件。 許多實驗指出順烏頭酸酶活力變化與檸檬酸累積有密切關系。 添加順烏頭酸酶抑制劑可促進檸檬酸積累。 鐵為順烏

25、頭酸酶的激活劑，用亞鐵氰化鉀除鐵，可以握高檸檬酸產率。n那么，解決了檸檬酸發酵過程中的上述幾個問題：，是不是就意味著可以將葡是不是就意味著可以將葡萄糖源源不斷的轉化成檸檬酸呢萄糖源源不斷的轉化成檸檬酸呢？ n提問：根據微生物代謝調節的基本理論，還需要解決什么問題？n菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經過EMP到檸檬酸整個代謝途徑需要暢通，在這個過程中：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分子的NADH經過呼吸鏈徹底氧化成H2O，并氧化磷酸化產生3分子的ATP，造成了微生物體內能荷能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關鍵酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝停止，怎么

26、能夠大量合成檸檬酸呢？3.能荷能荷調節對檸檬酸發酵的影響n如果NADH（還原型）不能夠快速的被氧化轉變成NAD（氧化型），則整個反應就會因為缺乏作為推動力的氧化型的NAD而停止，仍然不能夠合成檸檬酸。n檸檬酸產生菌可在有氧的條件下大量生成檸檬酸，也就是說，NADH即被氧化了，又沒有產生ATP。n為了解釋這種現象，有人提出了一種假設：該菌體內存在一條側系呼吸鏈，NAD(P)H經過該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒有氧化磷酸化生成ATP，能夠正常產生ATP的呼吸鏈稱之為標準呼吸鏈。解偶聯劑（解偶聯劑（uncoupler）?n使氧化和磷酸化脫偶聯，氧化仍可以進行，而磷酸化不能使

27、氧化和磷酸化脫偶聯，氧化仍可以進行，而磷酸化不能進行，解偶聯劑為離子載體或通道，能增大線粒體內膜對進行，解偶聯劑為離子載體或通道，能增大線粒體內膜對H+的通透性，消除的通透性，消除H+梯度，因而無梯度，因而無ATP生成，使氧化釋放生成，使氧化釋放出來的能量全部以熱的形式散發。動物棕色脂肪組織和肌出來的能量全部以熱的形式散發。動物棕色脂肪組織和肌肉線粒體中有獨特的解偶聯蛋白肉線粒體中有獨特的解偶聯蛋白(uncoupling proteins， UCPs)，與維持體溫有關。常用解偶聯劑主要有：，與維持體溫有關。常用解偶聯劑主要有：n質子載體：質子載體： 2，4-二硝基酚二硝基酚(DNP，圖，圖)，

28、羰基，羰基-氰氰-對對-三氟甲三氟甲氧基苯肼氧基苯肼(FCCP)。n質子通道：增溫素（質子通道：增溫素（thermogenin）。）。n其它離子載體：如纈氨霉素。其它離子載體：如纈氨霉素。n某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯，某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯，從而使體溫升高。從而使體溫升高。n實驗證明，在某些微生物體內確實存在側系呼吸鏈，該側系呼吸鏈中的酶系強烈需氧，如在檸檬酸的發酵中，發酵液的溶氧濃度在很低水平維持一段時間，或中斷供氧一段時間（20分鐘），則這一側系呼吸鏈不可逆的失活不可逆的失活，其結果是菌體不再產酸，而是產生了大量的菌體。n標準呼吸鏈的存在

29、使得菌體在代謝過程中產生了大量的ATP，用于菌體自身的生長上，這種現象，在生產上通常稱之為：只長菌不產酸只長菌不產酸，大量的葡萄糖被消耗了，卻沒有生產出檸檬酸，是一種失敗，（大型檸檬酸生產企業需要自己備用的發電系統）。n 理論可以指導實踐，反過來，通過實踐理論可以指導實踐，反過來，通過實踐可以推動理論研究，豐富理論研究成果。可以推動理論研究，豐富理論研究成果。 科學研究過程中的許多基本規律是相同科學研究過程中的許多基本規律是相同的，今天，我們在大學的學習，更多的的，今天，我們在大學的學習，更多的是學習一種方法或者說一種思維。通過是學習一種方法或者說一種思維。通過這個例子，我們可以學習到許多專業

30、以這個例子，我們可以學習到許多專業以外的知識外的知識首先為了解釋一種客觀想首先為了解釋一種客觀想象，提出一種假設，然后通過實驗來證象，提出一種假設，然后通過實驗來證明這種假設明這種假設CO2固定反應n通過CO2固定反應提供C4二羧酸n（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶n（2）丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶n以上兩種CO2固定反應所需要的輔酶都是生物素。檸檬酸發酵中，三個控制點檸檬酸發酵中，三個控制點 C6H12O6控制Mn+ NH4+濃度，解除檸檬酸對PFK的抑制（1）點：EMP暢通無阻控制溶氧，防止側系呼吸鏈失活丙酮酸 +

31、 丙酮酸（2）點：通過CO2固定反應生成C4二羧酸乙酰輔酶A + C4二羧酸 檸檬酸（3）點：檸檬酸后述的酶活性喪失或很低，控制培養基中的Fe2+ 的濃度檸檬酸發酵中，三個控制點檸檬酸發酵中，三個控制點第一個調節酶是磷酸果糖激酶（PFK） 檸檬酸和ATP對該酶有抑制 生產菌需要解除該抑制作用AMP、無機磷以及NH4+對該酶有活化作用NH4+有效解除檸檬酸和ATP對該酶有抑制 ，故生產上通過添加銨鹽來提高檸檬酸產量 Mn2+的影響：Mn2+缺乏菌體的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干擾蛋白質合成，導致蛋白質分解NH4+水平升高減少檸檬酸對該酶的抑制第二個調節點：CO2固定的酶活力高，保證草酰乙酸的

32、供應第三個調節點：TCA環上調節檸檬酸合成酶： 許多細胞中該酶是TCA的調節酶，但在黑曲霉中此酶無調節作用順烏頭酸水合酶：理論上此酶失活TCA環阻斷積累檸檬酸順烏頭酸水合酶需要Fe2+故在發酵液中添加黃血鹽絡合Fe2+阻斷TCA環，積累檸檬酸檸檬酸生物合成途徑10ATPO2HOHCO23OHC9ATPO3HO23)H.3(NADHSH-CoAOHCOHCOOHHOOCCOCHSCoA-CO.CHCOOHHOOCCOCHATPCOOH.C)H(NADHCOSCoA-COCHSH-CoAOHC .)H2(NADH2ATPOH2COHC .278626126227862232234323343343

33、EMP6126總反應式：電子傳遞鏈檸檬酸合成酶丙酮酸羧化酶丙酮酸脫氫酶 檸檬酸的積累機制總結n1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白質合成，導致細胞內NH4濃度升高和有一條呼吸活力強的不產生ATP的側系呼吸鏈，這兩方面的原因分別解除了對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促進了EMP途徑的暢通；n2)由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調節控制，就源源不斷地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脫酸生成乙酰-CoA和CO2固定兩個反應的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調節，增強了合成檸檬酸能力。檸檬酸的積累機制總結n3)順烏頭酸水合酶在催化時建立以下平衡：檸檬酸 順烏頭酸 異檸檬酸90 3 7；n4)控制Fe2+含量，

34、順烏頭酸酶活力低，使檸檬酸積累；n5)一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制異檸檬酸脫氫酶活力，從而進一步促進了檸檬酸自身積累；n6)檸檬酸積累使pH值降低，在低pH值下，順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于檸檬酸的積累并排出體外。檸檬酸積累的理想條件：檸檬酸積累的理想條件：1 1、提高磷酸果糖激酶的活性、提高磷酸果糖激酶的活性2 2、提高丙酮酸羧化酶的活性、提高丙酮酸羧化酶的活性3 3、提高檸檬酸合成酶的活性、提高檸檬酸合成酶的活性4 4、抑制順烏頭酸酶的活性、抑制順烏頭酸酶的活性5 5、抑制異檸檬酸脫氫酶的活性、抑制異檸檬酸脫氫酶的活性6 6、抑制、抑制 - -酮戊二酸脫氫酶的活性酮戊二

35、酸脫氫酶的活性7 7、抑制異檸檬酸裂解酶的活性、抑制異檸檬酸裂解酶的活性檸檬酸發酵需要下述檸檬酸發酵需要下述環境條件環境條件n(1)磷酸鹽濃度低；n(2)氮源用NH4+鹽；n(3)pH值低（3.0）；n(4)溶氧量高；n(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量極低。檸檬酸發酵的產率n1.無CO2固定反應的產率192/(1801.5)=71.1%n2.通過CO2固定反應提供C4二羧酸（無碳原子損失）192/180=106.6%C6H12O6C6H8O7(C沒有增加)可見，CO2固定反應與檸檬酸發酵的重要性C6H8O7H2O理論轉化率：116.7%檸檬酸發酵實驗檸檬酸發酵實驗檸檬酸發酵檸檬酸發酵一、

36、一、菌種菌種：產生檸檬酸的菌種很多，以：產生檸檬酸的菌種很多，以霉菌霉菌為為主，又以主，又以黑曲霉黑曲霉產生檸檬酸的能力較強，并能產生檸檬酸的能力較強，并能利用多種碳源，故常是生產上使用的菌種。利用多種碳源，故常是生產上使用的菌種。二、發酵二、發酵機理機理：細胞內有三羧酸循環和乙醛酸：細胞內有三羧酸循環和乙醛酸循環；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或循環；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。檸檬酸發酵檸檬酸發酵三、三、工藝流程工藝流程：發酵液

37、的發酵液的pHpH值值對檸檬酸生成影響很大；對檸檬酸生成影響很大；pH23pH23時，發酵產物主要是檸檬酸；時，發酵產物主要是檸檬酸； pHpH值中值中性或堿性時，會產生較多草酸和葡萄糖酸；性或堿性時，會產生較多草酸和葡萄糖酸； 可往培養基中加入可往培養基中加入亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀或采取或采取育種育種手段手段改造菌種改造菌種，使，使烏頭酸酶烏頭酸酶或或異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶缺失或盡量降低活性，以缺失或盡量降低活性，以阻礙阻礙TCATCA循環循環的正常的正常進行，從而增加檸檬酸的積累。進行，從而增加檸檬酸的積累。四、檸檬酸發酵用原料n檸檬酸發酵的原料有三大類n糖質原料(甘蔗廢糖蜜、甜菜廢糖

38、蜜)、n淀粉質原料(主要是番薯、馬鈴薯、木薯等)1.正烷烴類原料。營養物濃度對發酵的影響n對生成量和組成都有影響n黑曲霉檸檬酸發酵n蔗糖濃度15%18%，蔗糖同化率97%n蔗糖濃度20%，只同化92%n蔗糖濃度低于10%，產檸檬酸少，積累草酸n蔗糖濃度低于2.5%，不產檸檬酸五、檸檬酸發酵工藝1)試管斜面菌種培養n察氏瓊脂培養基：NaNO33g，蔗糖20g，K2HPO41g，KCl0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，瓊脂20g，用水定溶至1000ml，pH自然。察氏-多氏瓊脂培養基：蔗糖30g，NaNO32g，MgSO4.7H2O0.5g，KH2PO41g，KCl0.

39、5g，FeSO4.7H2O0.01g，溴甲分綠0.4g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH自然。1)試管斜面菌種培養蔗糖合成瓊脂培養基：蔗糖140g，NH4NO32g，KH2PO42g，MgSO4.7H2O0.25g，FeCl3.6H2O0.02g，MnSO4.4H2O0.02g，麥芽汁20ml，瓊脂20g，用水定溶至1000ml。米曲汁瓊脂培養基：一份米曲加四倍質量的水，于55保溫糖化34小時后煮沸，濾液用水調整濃度至10Bx，并用堿液將pH調制到6.0，接著添加瓊脂2%。確認所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉孢子懸液0.1ml，于32培養45d。2)種子擴大培養二級擴大培養na培養基有

40、瓊脂固體培養和液體表面培養兩種方法，前者的培養基組成與斜面培養基相同，后者的組成如下：麥芽汁7BX，氯化銨2%，尿素0.1%，2)種子擴大培養二級擴大培養nb培養固體培養時，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養基，250ml茄子瓶裝50ml瓊脂培養基。滅菌后擺成斜面，凝固后的斜面至37下培養24h。確認無雜菌污染即可使用。液體培養時，將液體培養基裝入三角瓶中，使液層深度達45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌15min。按無菌操作接種。培養溫度32。液體表面需710d，瓊脂固體培養需67d。三級擴大培養n可采用麩曲固體培養、液體表面培養或瓊脂固體培養。所用培養基如下：na麩曲培養基：新鮮小麥麩皮1k

41、g，加水1.11.3L。液體培養基與第二級擴大培養基所用液體培養基相同。nb瓊脂固體培養基：與斜面培養基相同。n現代工業化大生產主要采用深層通風發酵法。n日本約15的檸檬酸產品是利用固態發酵法生產的，n淺盤發酵法在前蘇聯、印度、捷克波蘭、保加利亞、阿根廷等國家主要使用，n我國、美國及西歐共同體國家則主要采用液體深層發酵法進行生產3） 發酵生產發酵生產 工藝流程工藝流程 n以薯干粉為原料的液體深層發酵工藝流程以薯干粉為原料的液體深層發酵工藝流程： 斜面菌種斜面菌種麩曲瓶麩曲瓶種子種子 薯干粉薯干粉調漿調漿滅菌滅菌(間歇或連續式間歇或連續式)冷卻冷卻發酵發酵發酵液發酵液提取提取成品成品 無菌空氣無

42、菌空氣 n薯渣為原料的固體發酵工藝流程薯渣為原料的固體發酵工藝流程： 試管斜面試管斜面三角瓶菌種三角瓶菌種種曲種曲 薯渣薯渣粉碎粉碎蒸煮蒸煮攤涼接種攤涼接種裝盤裝盤發酵發酵出曲出曲提取提取成品成品 米糠米糠 3） 發酵生產發酵生產 工藝流程工藝流程 檸檬酸的深層液體發酵工藝薯干原料檸檬酸深層發酵工藝米曲汁斜面米曲汁斜面 茄子瓶茄子瓶種子罐菌絲培養（也可以孢子接種）種子罐菌絲培養（也可以孢子接種）發酵培養（發酵培養（3232，5 55.55.5天）天）成熟的發酵液成熟的發酵液（或（或10102020 麥芽汁麥芽汁 0.1%KH0.1%KH2 2POPO4 4）1616的薯干粉，的薯干粉，-淀粉酶

43、液化淀粉酶液化液體發酵a不置換法n培養液一次加入，發酵結束后棄去菌蓋，發酵液用來提取檸檬酸。n具體操作：接種后，培養溫度維持在35，這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右，以促進孢子發芽及菌體發育。當溫度逐漸下降時，必須通人約50的空氣以維持35的培養溫度，通風量為35m3/m2.h。接種后20h左右可出現灰白色、很薄的菌膜，72h時菌膜已完全形成，菌膜相當厚且有皺褶。n48h起由于菌體耗氧增加，可開動另一組風管向盤層之間通汽，進汽溫度為40左右，風量為7m3/m2.h，進汽濕度為75%以上，以防培養液水分蒸發過快。n接種后72h起進入產酸期，這時菌體代謝速率高，耗糖快，發酵液酸度急劇升高

44、，并釋放出大量熱，最高時可達1000kJ/(m2.h)，此時應加強通風措施，嚴格將發酵溫度控制在2628，以利檸檬酸的形成。n因此，一般在進入產酸期前8h左右需增大風量至1518m3/m2.h，且降低進汽溫度在25以下，濕度仍在75%以上。160h以后發酵結束。b置換法n置換法一般是采用糖濃度低而營養較豐富的培養液先培養菌蓋，待菌蓋形成之后再更換發酵培養基。可更換1次也可數次，發酵液用來提取檸檬酸。n培養菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質量再補充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢子后，室溫保持在3436，培養液品溫為3234，使孢子發芽，正常情況下40h即可形成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形

45、成后，放掉培養基，更換發酵培養基(即第1次置換)，并將室溫降至3032，待發酵4860h后再放掉發酵液，加入新培養液即進行第2次置換。如此重復，一般可置換培養基810次，總發酵周期為1420d，n收集起來的發酵液，用來提取檸檬酸。n置換法的優點是節省了大量培菌時間，發酵速度快，而且原本不適宜長菌的原料都可用作發酵培養基。n但為了保持菌蓋的高活性，不能將發酵液殘糖控制得很低，這樣一來就造成替換出來的發酵液其殘糖量較高，給后道提取檸檬酸帶來困難。c不置換法影響表面發酵的因素na)培養液層厚度培養基液層厚度大，發酵產物總的生成量就大。如果原料質量好，預處理方法得當，曲霉菌絲體活力強，那末可適當增加液

46、層厚度;相反，就應減少液層厚度。c不置換法影響表面發酵的因素nb)糖濃度用于表面發酵的糖蜜濃度，質優的糖蜜濃度(以蔗糖濃度計)為18%22%較適宜，而質劣的糖蜜一般采用14%。n在表面發酵中，大約80%的糖被用于合成檸檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%2%的糖用于合成副產物。nc)溫度n黑曲霉生長最適溫度33-37，積累檸檬酸的最適溫度在32n黑曲霉適宜產酸溫度是2628。溫度高，容易形成雜酸等副產物且菌體易衰老；溫度低，發酵周期被延長。nd)pH值黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產酸的最適pH在2.52.0。因此，應該注意的是：菌蓋形成之后，只是在菌蓋下

47、面有一個低pH區域，菌體合成檸檬酸的活動都是在這低pH區域內進行的，所以不應該攪動發酵液，避免低值區域的pH值上升而長菌不產酸。n黑曲霉發酵檸檬酸，pH3.0以下積累檸檬酸，pH3.0以上積累草酸，pH5.0容易積累葡萄糖酸n與不同碳源有關，黑曲霉在合成培養基上產檸檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯干粉4.5ne)通風表面發酵是氣相傳氧，因此傳氧效率較高，所以只要保持發酵室內有適當空氣流通就可以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會影響菌體的生長和降低產酸能力。一般將CO2控制在3%以下。固體發酵a淺盤發酵n將曲置于曲室內培養，室溫可按需要調節。在孢子發芽和菌絲生長期，由于產生的熱量少，品溫會

48、逐漸下降，在入室后自18h內，應維持品溫在2731。培養1848h期間，由于發酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應采取措施，不得讓品溫超過43n菌體活力下降，所以品溫會下降，此時應維持在35左右，直至發酵結束。固體發酵a淺盤發酵n為了克服上、下曲盤的溫差，在發酵40h左右時應將曲盤上下對調。整個發酵期間不必翻曲。曲室相對濕度在85%90%。n發酵終點根據酸度來判定，從48h開始測量酸度，以后每隔12h測定1次，自72h以后則每隔4h測定1次，在酸度達到最高時即出料，否則時間延長，檸檬酸反而被菌體消化。b 厚層通風發酵厚層通風發酵n與淺盤發酵明顯不同的是，在物料鋪攤厚度上，厚層發酵的曲醅厚度在50c

49、m左右，比淺盤發酵的1520cm要大出許多。n為了給曲霉菌提供氧，在培養過程中需要進行機械通風。b 厚層通風發酵厚層通風發酵n培養過程中的溫度控制與淺盤發酵的溫度管理相似，但最高品溫不能超過40。溫度和濕度主要靠通風來調節，因為物料厚度大，所以培養過程中需要翻料。n厚層發酵比淺盤發酵優越之處在于：占地面積少，污染雜菌可能性小，機械化程度高。六、固定化黑曲霉發酵玉米生產檸檬酸n用固定化黑曲霉細胞發酵玉米生產檸檬酸的最適溫度是35,玉米糖液濃度10Bx。在最適條件下檸檬酸產量可達到96g/L,一般穩定在89g/L。六、固定化黑曲霉發酵玉米生產檸檬酸n固定化黑曲霉可連續使用24d(約8批次)。黑曲霉細胞固定化后,產酸活力與降糖能力均與游離細胞水平相近。但在連續分批發酵中,固定化黑曲