1、重組人胰島素生產工藝重組人胰島素生產工藝重組人胰島素重組人胰島素p定義定義： 胰島素：胰島素：是由胰島是由胰島細胞受內源性或外源性物細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。的一種蛋白質激素。 重組人胰島素重組人胰島素（現階段臨床最常使用的胰島（現階段臨床最常使用的胰島素）：利用生物工程技術，獲得的高純度的生物合素）：利用生物工程技術，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。本身的胰島素完全相同。 結構結構： 胰島素由胰

2、島素由a、b兩個肽鏈組成。兩個肽鏈組成。a鏈有鏈有11種種21個氨個氨基酸，基酸，b鏈有鏈有15種種30個氨基酸，共個氨基酸，共26種種51個氨基酸組個氨基酸組成。其中成。其中a7(cys)-b7(cys)、a20(cys)-b19(cys)四四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使a、b兩鏈兩鏈連接起來。此外連接起來。此外a鏈中鏈中a6(cys)與與a11(cys)之間也存之間也存在一個二硫鍵。在一個二硫鍵。 3d structure of insulin胰島素二聚體（胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（胰島素六聚體（hexamer ）胰島素的性質胰島素

3、的性質 胰島素的功能胰島素的功能 胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。藥理作用藥理作用 治療糖尿病、消耗性疾病。胰島素的研究歷史胰島素的研究歷史 1921年年-從動物胰腺中提取出胰島素，開創了人類胰島素治療從動物胰腺中提取出胰島素，開創了人類胰島素治療的歷史。的歷史。1926年年-重結晶胰島素重結晶胰島素1930s-傳統中、長效動物胰島素傳統中、長效動物胰島素1970s-單峰胰島素和單峰胰島素和 單組分胰島素單組分胰島素 70年代末年代末-半合成胰島素半合成胰島素1982年年-采用基因重組技術生產的人胰島素正式上市。采用基因重組技術生產的人胰島素正式

4、上市。90年代至今年代至今-重組人胰島素類似物成功研發上市，包括超短效重組人胰島素類似物成功研發上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。和長效人胰島素類似物。 胰島素制備工藝胰島素制備工藝 以動物胰臟為原料提取胰島素以動物胰臟為原料提取胰島素 -酸醇提取法酸醇提取法 傳統胰島素傳統胰島素-豬、牛胰臟提取，只經一步重結晶豬、牛胰臟提取，只經一步重結晶 單峰胰島素單峰胰島素-凝膠過濾純化凝膠過濾純化 單組分胰島素單組分胰島素-凝膠過濾、離子交換純化凝膠過濾、離子交換純化 半合成胰島素半合成胰島素-以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組重組dnadna技術生產

5、人胰島素技術生產人胰島素 ab鏈合成：分別表達鏈合成：分別表達ab鏈，化學方法連接鏈，化學方法連接 逆轉錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素逆轉錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素重組重組dna技術制造人胰島素技術制造人胰島素 1. ab鏈合成法鏈合成法：以人工合成的人胰島素以人工合成的人胰島素a鏈和鏈和b鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融和基因，分別在大腸桿菌中表達和基因，分別在大腸桿菌中表達a鏈和鏈和b鏈，鏈，然后再通過化學氧化作用，通過二硫鍵連接然后再通過化學氧化作用，通過二硫鍵連接起來。起來。已被淘汰已被淘汰ins a鏈鏈ins b鏈鏈

6、轉化大腸桿菌轉化大腸桿菌發酵發酵a鏈鏈b鏈鏈純化純化二硫鍵二硫鍵活性胰島素活性胰島素ab鏈合成人胰島素鏈合成人胰島素ab鏈合成法鏈合成法2.反轉錄酶法：仿反轉錄酶法：仿照天然合成途徑照天然合成途徑 通過胰島素原通過胰島素原的的cdna合成，合成，表達產物是胰島表達產物是胰島素原，經工具酶素原，經工具酶切開，除去切開，除去c-肽肽得人胰島素。得人胰島素。n提取目的基因：既從人的dna中提取胰島素基因，可使用限制性內切酶將目的基因從原dna中分離。主要有如下4種方法：n （1）鳥槍法：用一大堆限制性核酸內切酶對附近基因進行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用dna分子雜交，即dna探針n （2）

7、人工合成法：根據轉錄蛋白或者mrna推導出基因序列，然后人工合成，沒有內含子。n （3）從基因文庫中提取：也就是事先已經提取完畢的拿來用n （4）pcr擴增技術：用于大量生產該段基因片段，用于商業化運作 n提取質粒：使用細胞工程,培養大腸桿菌，從大腸桿菌的細胞質中提取質粒，質粒為環狀。主要有如下2種方法：n （1）堿裂解法：此方法適用于小量質粒dna的提取，提取的質粒dna可直接用于酶切、pcr擴增、銀染序列分析。n （2）煮沸法 n基因重組：取出目的基因與質粒，先利用同種限制性內切酶將質粒切開，再使用dna連接酶將目的基因與質粒“縫合”，形成一個能表達出胰島素的dna質粒。 n將質粒送回大腸

8、桿菌：在大腸桿菌的培養液中加入含有ca+的物質，如cacl2,這使細胞會吸收外源基因，此時將重組的質粒也放入培養液中，大腸桿菌便會將重組質粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒能夠進入受體細胞，此時的細胞處于感受態（理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來dna的生理狀態）。n胰島素的產生：再大腸桿菌內，質粒通過表達轉錄與翻譯后，便產生出胰島素蛋白質。通過大腸桿菌的大量繁衍，便可大量生產出胰島素。（注意：大腸桿菌產出的是多肽鏈，因為原核生物沒有內質網、高爾基體等，不能進行多肽的折疊、修飾等，還需人為進行菌體外加工。）質質粒粒ins mrna反轉錄反轉錄ins cdna轉化大腸桿菌轉化大腸桿菌pcr連接連接胰島素原胰島素原活性胰島素活性胰