1、淺探轉基因顯微注射中的基因裝液方法改良摘要：目前常用的轉基因動物制備方法有顯微注射法、逆轉錄病毒感染法、精子載體法、胚胎干細胞介導法、人工酵母染色體法及電轉移法等1 r。其中 顯微注射仍是最可靠、最廣泛使用的一種方法，因其外源基因整合效率高，對目的 基因無大小限制，且可以直接獲得純系樣 廠，但其過程煩瑣且要求嚴格，將基因 液裝入微注射針是其成功的關鍵前提910J。當前各實驗室普遍使用可編程微量注射儀,該儀器要求將基因液面倒吸至注射針的直管部以獲得穩定平衡壓力，但僅用其吸入功能無法達到，導致培養液倒吸，基因液被稀釋，從而大大影響了轉 基因成功率。筆者建立一種簡單有效的方法以克服這一缺點。關鍵詞：

2、 動物 遺體修飾 小鼠 轉基因 顯微注射 基因轉移技術1 材料與方法儀器和材料卩1 30拉針儀，肝9血煅針儀，則可編程微量注射儀（日本Narishige公司）；倒置顯微鏡,顯微操作儀（日本 Olympus公 司），；1川薄壁毛細玻璃管（1 x 90 mm日本Narishige公司）或叫 也薄壁 毛細玻璃管（X 100 mm北京正天易科貿有限責任公司），玻璃管（x 200 mm北 京正天易科貿有限責任公司）,一次性培養平皿（美國BDFALCO公司）,顯微注 射用基因液,M2培養液，石蠟油（M8410,美國Sigma公司）。儀器參數注射針拉針儀：主磁61,副磁23;溫度70 C；煅針儀：彎針溫度2

3、025 C。可編程微量注射儀In put : 60100 psi （1 psi= kPa ）; CLR 6070 psi, s ; BALN psi ; FILL : 60 psi,60 s ; INJ :psi, s 。方法注射針制備 設定對應的拉針儀參數，裝上毛細玻璃管，用固定旋鈕固 定好,按下拉針儀開關，將其拉制成開口小于1卩m的注射針；取下注射針裝在煅 針儀的持針架上，將注射針移至玻璃球側面，使其內徑20卩m處靠近玻璃球，設定 好煅針儀的溫度參數，點壓加熱開關,將其彎成25。微載管制備用兩把鑷子夾住直徑為mm的玻璃管兩端，將其中部置于酒精燈火焰上灼燒，待其軟化后，快速向外拉伸。在距肩部

4、約910 cm處用砂 輪裁斷細部，將細部的尖端在鍛針儀上鍛燒，使開口邊緣變光滑。這樣制備的微載 管外直徑約200400卩m,用于將石蠟油裝入顯微注射針。基因液的裝載及比較將相同參數下制備的注射針分成 2組,每組3根，分別按照下面2種方法將基因液裝入針內。針尖倒吸法（A法）將注射針裝到顯微操作儀持針器上，并與可編程微量注射儀相連接，調好可編程微量注射儀各部分參數，打開“ BALN功能；在培 養皿蓋子上作一個3卩L基因液液滴，覆蓋上石蠟油，將其置于倒置顯微鏡的載物 臺上,調整注射針角度，使其進入基因液滴，按下注射儀的“ FILL”按鍵,將基因 液倒吸進入注射針，按下注射儀的“ FILL”按鍵數次，

5、觀察注射針內液面的變化。改良法（B法）用微載管吸取少量（約510卩L）滅菌石蠟油并從顯微注射針的背部注入，直到液面到達注射針的直管部（圖1）,小心取出微載管， 通過橡膠管將注射針背部與注射器相連，按壓注射器活塞對石蠟油輕輕施壓，使 得針內液面向針口緩慢移動，最終充滿整個注射針尖部；后續操作同。圖1顯微注射針各部分示意圖（略）Fig 1Represe ntati on of each part ofmicroinjectio n pipette顯微注射模擬及比較平衡壓力的觀察保持顯微注射儀所有參數不變，將M2培養液裝填于mm培養皿蓋并置于倒置顯微鏡的載物臺上，調整注射針角度，驅動顯微操作臂使 其

6、緩緩下降進入M2培養液中,在倒置顯微鏡20X物鏡下調節焦距至基因液液面 清晰,觀察注射針內基因液液面的位置變化，以判斷此時顯微注射儀提供的平衡 壓力是否能夠抵消培養液的虹吸效應，產生使基因液緩慢外流的正壓。模擬注射后液面變化保持顯微注射儀所有參數不變，調好注射儀的“INJ”功能,反復按壓“ INJ”按鍵模擬顯微注射過程30次后,按壓“ CLR 按鍵10次,在倒置顯微鏡20X物鏡下觀察注射針內液面變化情況。液面變化數值統計學處理調節焦距至基因液液面清晰，記錄此時基因液液面在目鏡測微尺上的刻度（起始位置）,10 min后再次觀察并記錄液面在 目鏡測微尺上的刻度（終止位置）。將2組注射針內基因液液面

7、在10 min的位置 變化差值進行統計分析,并作配對資料t檢驗,采用MicroCal Origin軟件中的t 檢驗（two population/pared）,檢驗水準取 a =。2 結果基因液的裝載及比較用A法裝載基因液后，按壓“ FILL”按鍵，基因液倒吸入注射針內，當液面上升到注射針尖細部一定位置后，再按壓“ FILL”按 鍵多次,注射針內液面沒有明顯變化。而 B法的注射針內石蠟油與基因液界面仍 然可以上升，甚至到達注射針直管部。顯微注射模擬及比較平衡壓力的觀察分別使用2種方法裝載基因液后，將注射針緩緩下 降進入M2培養液中,在倒置顯微鏡20X物鏡下都觀察到注射針內基因液液面緩 慢向針尖

8、方向移動。模擬注射后液面變化 反復按壓“ INJ”按鍵模擬顯微注射過程30 次后,按壓“ CLR按鍵10次,在倒置顯微鏡20X物鏡下觀察，用A法裝載的基因 液液面緩慢上升,M2培養液倒吸進入注射針；用B法裝載的基因液界面仍然緩慢 下降。液面變化數值統計學處理A組注射針內基因液液面在10 min的位置變化為、，xs為土； B組為-、-、-,xs為-土（差值為正表示針內液面向 針尖方向移動，差值為負表示液面向針背方向移動）。兩組數據比較具有統計學意 義（P）。3 討論 ；原核顯微注射法制備轉基因小鼠是一個嚴格而煩瑣的過程，其中將基因液裝入注射針是顯微注射之前必不可少的關鍵一步。目前完成該步

9、驟的方法有3種：針背虹吸法、針背填充法以及針尖倒吸法。前2種方法均需要特殊的毛細管， 且操作過程中極容易污染基因液，每次操作基因液的用量大，成本較高。而針尖倒 吸法是利用可編程微量注射儀的“ FILL ”功能將基因液直接從注射針針口倒吸 進入注射針。該法將基因液從針口倒吸進入注射針，既不需要使用昂貴的微載管， 且每次只須1卩L的基因液,可以很大程度地節約基因液的用量；另外，每次吸 取少量基因液做成基因液滴的方法可以很大程度地保持基因液的純度，在操作過程中也不會對基因液造成污染。因此，使用倒吸法裝載基因液是最經濟、簡便的 一種方法。A法的缺陷筆者使用A法進行轉基因動物實驗的過程中發現,按壓“ F

10、ILL按鍵，當液面上升到注射針尖細部一定位置后，再按壓“ FILL”按鍵多次，注射針 內液面沒有明顯變化，表明A法不能通過人為控制吸入足夠量的基因液。裝好基 因液的注射針下降進入培養液后，在顯微鏡下可以觀察到針內液面緩慢下降，說 明顯微注射儀提供的平衡壓力能夠抵消培養液的虹吸效應，產生使基因液緩慢外流的正壓。而在模擬顯微注射過程中，連續按壓數次顯微注射儀的“ INJ”和“CLR鍵后,在注射儀提供的平衡壓力不變的情況下，針內液面開始緩慢上升， 說明原來的平衡壓力已經不能抵消虹吸效應，使得培養液倒吸進入注射針，從而 稀釋針內的基因液，影響轉基因動物制備的成功率。注射針的內徑越小，其虹吸效 應就越強

11、，當基因液液面處于針的尖細部時，隨著注射過程進行，液面不斷向針尖 方向移動,抵消虹吸效應所需的平衡壓力就越高，這就需要在注射過程中時時調 節“ BALN的壓力，這既增加了顯微注射的困難度，而且實際上也不大可能實現。 并且，使用該法僅能倒吸入少量基因液，在注射過程中，需要經常按壓“ CLR鍵 ( 10次)來保證注射針口的通暢，在這個過程中會損失大量的基因液，導致吸 入的基因液不足以完成一盤受精卵(2030個)的注射量，增加了裝載基因液的 頻率,亦會大大影響轉基因實驗的成功率。B法的改良本實驗采用先從注射針背部裝入適量石蠟油的方法(即B法)解決以上問題。在基因液裝載的過程中發現，按壓“ FILL”

12、按鍵數次，石蠟油 與基因液的交界面仍然可以上升，表明B法可以通過增加“ FILL”的次數來裝入 足夠量的基因液，以保證順利完成一盤受精卵的注射，從而節約注射時間。而在模 擬顯微注射過程中,連續按壓數次顯微注射儀的“ INJ”和“ CLR鍵后,在注射 儀提供的平衡壓力不變的情況下，針內液面仍然緩慢下降，這說明只要石蠟油的 上液面仍然處于注射針的直管部，即使基因液面在細管部移動，仍然不會影響抵 消虹吸效應所需的平衡壓力,因此連續按壓數次顯微注射儀的“ INJ”和“ CLR 鍵后,原來設定的平衡壓力仍然能夠產生使基因液緩慢外流的正壓，消除了壓力不穩定給轉基因動物實驗帶來的影響因素。此外，由于石蠟油穩

13、定、無毒、非親水的特性，已被廣泛應用于細胞培養的實驗中，相對于高度提純的基因液來說，石 蠟油更加經濟且易于獲得。由于石蠟油的非親水性，在基因液后端裝上石蠟油可 以防止溶液蒸發導致基因濃度升高，保持基因注射過程中基因液的正常濃度。且 由于該操作的簡便、無菌,在顯微注射過程中可以重復裝載基因液，毋需更換新的 注射針,減少注射針使用量。用于裝載石蠟油的微載管可以反復使用，也減少其用 量。【參考文獻】Koo B C,Kwon M S,Choi B R, et al .rns 111M飛gonetran sfer and expressio n of EGFP in chicke n J. Mel Re

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