1、第8章 細胞重組與細胞融合細胞重組：是指從活細胞中分離出細胞器及其組分，在體外進行重新裝配成為具有生物活性的細胞的一種技術。核體：是與細胞質分離后得到的帶有少量細胞質并包有質膜的細胞核，也稱為小型細胞。胞質體：是除去細胞核后由質膜包裹的無核細胞。第一節 細胞質工程細胞質工程：是研究真核細胞的核-質關系以及細胞器、細胞質基因轉移的技術。一 細胞破碎1 細胞破碎技術：是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內容物釋放出來的技術。2 細胞破碎方法超聲波破碎法反復凍融法高速組織搗碎法化學裂解法生物酶解法超聲波破碎法 利用超聲波振蕩器發射的15-25khz的超聲波探頭處理細胞懸浮液，由發生器和換能器組成。

2、反復凍融法 將細胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。高速組織搗碎法 借助高速組織搗碎機使細胞被高速旋轉的葉片打碎。化學裂解法 通過化學藥品改變細胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法 利用溶解細胞壁的酶處理細胞，破壞細胞壁，使細胞內含組分釋放。二 細胞器及細胞組分分離分離方法差速離心法密度梯度分離法n在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉速度逐漸提高，樣品按大小先后沉差速離心差速離心差速離心差速離心在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞

3、器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復23次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。密度梯度離心用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心速度沉降（速度沉降（velocity sedimentationvelocity sedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質密度較低，介質的最

4、大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細胞或細胞器）在十分平緩的密度梯度介質中按各自的沉降系數以不同的速度沉降而達到分離。等密度沉降（等密度沉降（isopycnic sedimentationisopycnic sedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續梯度的介質中經足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。介質的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。第二節 細胞融合一細胞融合的發展1838

5、-1875年：在血液組織中發現有多核細胞；20世紀50年代：日本科學家發現仙臺病毒可以引起細胞的融合；1965年：英國的科學家海利斯成功得到了融合細胞；1964年：hat選擇培養基應用于融合細胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學家高國楠發現聚乙二醇（peg）能夠促使 植物的原生質體融合；1982年：出現了電融合技術；近20年：從細胞融合的理論和實踐兩個方面進行了大量研究，細 胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。二 細胞融合的定義 細胞融合(cell fusion)：又稱體細胞雜交，是指使用人工方法使兩個或兩個以上的體細胞合并形成一個細胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術。人工方法

6、：是指在外力使用誘導劑或促融劑、電場、磁場、超聲波、重力、激光等因素的作用。無性方式：是區別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細胞卵子和精子相互接觸會發生細胞融合的現象。 細胞融合過程：異核體階段異核體階段：異核體是指在融合細胞內含有來自兩個親本的細胞核。雜種細胞形成階段雜種細胞形成階段：當異核體同步進入有絲分裂后，核膜崩潰，來自兩個細胞核的染色體結合在一起。三 細胞融合的意義改造細胞遺傳物質 生產抗腫瘤疫苗 生產單克隆抗體 用于基因定位用于動物育種 有利于基礎理論研究雜種細胞保留的人染色體 1 2 3 4 5 6 7 a + + + + - - - b + + - - + + - c +

7、- + - + - + 選擇3個都保留有4條人染色體的雜種細胞克隆，但染色體各不相同。如果某一表型特征只出現于克隆a、c而不見于b，就可決定該特征的基因只能在3號染色體上。a、b而不見于c，就可決定該特征的基因只能在2號染色體上b、c而不見于a，就可決定該特征的基因只能在5號染色體上四 細胞融合基本原理1 細胞膜表面親水性結構糖蛋白 細胞融合的關鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無糖蛋白覆蓋的區域，使兩個細胞的脂雙層能緊密結合。 引起細胞膜表面的蛋白起作用細胞相互凝集膜蛋白質分子重排脂類分子重排打開質膜細胞融合2 病毒促進細胞融合 很多病毒都具有凝集細胞的能力，其原理大致如下：病毒的一

8、邊黏接在一個細胞表面，該病毒的另外一邊黏接在另一個細胞表面，從而使兩個細胞在病毒的作用下靠近發生凝結。 仙臺病毒促進細胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（hana蛋白質和f蛋白質）可和細胞膜表面的糖蛋白發生作用，相互結合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面之間產生一些微小的細胞質橋。3 化學誘導細胞融合（聚乙二醇peg）peg含有醚鍵、帶負電性 可與細胞表面正的極性集團相連引起細胞膜表面的蛋白起作用細胞相互凝集膜蛋白質分子重排脂類分子重排打開質膜細胞融合peg和水之間的氫鍵相結合，使溶液中的自由水消失，導致細胞脫水而發生膜結構的變化細胞相互凝集膜蛋白質分子重排脂類分子重排打開

9、質膜細胞融合 4 電場誘導細胞融合 低壓交流電場中，細胞聚集成串珠狀緊密排列相互接觸的細胞膜之間會出現無蛋白顆粒的脂質區當受到電擊時，這個區域就會被擊穿，產生脂雙層膜孔，導致細胞之間的細胞質連通發生細胞融合。細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內，這一現象稱為電穿孔。 五 雜種細胞特性的表現形式互補作用：親本細胞的性狀同時在雜種細胞中表現。激活作用：親本細胞的不活動基因在雜種細胞表達。 如只能合成rna而不能合成dna的小鼠巨噬細胞，與hela細胞融合，融合后的細胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細胞的性狀在雜種細胞中消失。 如金黃倉鼠的黑色素瘤細胞可產生黑色素，小鼠的成纖維細胞不能產生黑色素，它們的雜種細胞不能產生黑色素。同時具有激活和消失作用 如小鼠的胸腺細胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發育早期t12基因表達，h2基因不表達，在成年小鼠中h2基因表達，t12基因不表達，而在成年小鼠的胸腺細胞與小鼠胚胎性瘤細胞融合的雜種細胞中，h2基因不表達，卻激活了t12基因，使其表達。六 細胞融合的影響因素動物細胞融合1 細胞種類和性質 細胞表面性質細胞表面性質 細胞種類2 環境條件的影響 溫度：溫度： ph：最適為7.4-7.8 氧氣含量：氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3 離子強度及離子種類 細胞融合時需要ca 2，最適為