1、logo精氨酸激酶精氨酸激酶(ak)的表達及其純化的表達及其純化目錄目錄研究背景研究背景1實驗材料實驗材料2實驗方法實驗方法3結果及分析結果及分析4蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化v蛋白質的分離純化是對蛋白質進行研究的一項必蛋白質的分離純化是對蛋白質進行研究的一項必需的和基礎的工作。目前常使用的分離純化的方需的和基礎的工作。目前常使用的分離純化的方法或技術都是在了解蛋白質性質和結構特點的基法或技術都是在了解蛋白質性質和結構特點的基礎上建立的。目標蛋白質的分離決不是一件輕而礎上建立的。目標蛋白質的分離決不是一件輕而易舉的事情，因為要把它與性質、大小和結構十易舉的事情，因為要把它與性質、大小和結構

2、十分相似的其他蛋白質分離開來存在許多困難。有分相似的其他蛋白質分離開來存在許多困難。有些目標蛋白質在組織細胞內的含量很低，這無疑些目標蛋白質在組織細胞內的含量很低，這無疑將增加獲取足量蛋白質的難度。將增加獲取足量蛋白質的難度。 目標蛋白質的分離純化程序主要包括目標蛋白質的分離純化程序主要包括: : 材料的選擇；材料的選擇；組織勻漿和破碎細胞獲取粗提取液；組織勻漿和破碎細胞獲取粗提取液；蛋白質初步提純；蛋白質初步提純；選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白, ,直至完全直至完全 純化；純化；目標蛋白的鑒定。用于研究目的蛋白質通常應保目標蛋白的鑒定。用于研究目的蛋白質

3、通常應保持它的生物活性。因此，在目標蛋白質的整個分離持它的生物活性。因此，在目標蛋白質的整個分離純化過程中要在較低溫度下純化過程中要在較低溫度下(0(04)4)操作，注意使操作，注意使用蛋白酶用蛋白酶( (使蛋白質降解的酶使蛋白質降解的酶) )的抑制劑，避免使用的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質特定的折疊結構受到破壞。劇烈條件，以免蛋白質特定的折疊結構受到破壞。 一、蛋白質是兩性電解質一、蛋白質是兩性電解質 根據蛋白質的分子結構，很容易得出構成蛋根據蛋白質的分子結構，很容易得出構成蛋白質的兩性解離的基礎是氨基酸殘基的側鏈可解離的白質的兩性解離的基礎是氨基酸殘基的側鏈可解離的基團。基團。 作

4、為兩性電解質，每種蛋白質都有其等電點作為兩性電解質，每種蛋白質都有其等電點(pi) (pi) ，這與它所含的氨基酸種類和數量有關。，這與它所含的氨基酸種類和數量有關。 所有的蛋白質，不管它具有什么樣的功能，所有的蛋白質，不管它具有什么樣的功能，都能在細胞內起一定的緩沖作用。都能在細胞內起一定的緩沖作用。1. 1. 蛋白質的電泳分離蛋白質的電泳分離 凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。用凝膠電泳是目前常用的一種生化方法。用于蛋白質分離的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠，該凝于蛋白質分離的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺配制膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺配制而

5、成，其最大的特點是凝膠的孔徑可根據需要進行而成，其最大的特點是凝膠的孔徑可根據需要進行選擇。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進行非變性選擇。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進行非變性電泳和變性電泳。電泳和變性電泳。1 透析透析2 層析原理層析原理3 凝膠過濾凝膠過濾4 離子交換層析離子交換層析5 親和層析親和層析6 電泳電泳主要內容1 透透 析析按照分子大按照分子大小進行分離。小進行分離。分離取決于分離取決于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液濃縮的蛋白濃縮的蛋白混合樣品混合樣品 透析袋透析袋 開始透析開始透析處于平衡狀態處于平衡狀態 層析也稱之色譜，基本原理是分析樣品作層析也稱之色譜

6、，基本原理是分析樣品作為流動相流過固相時，由于樣品中的各個成分為流動相流過固相時，由于樣品中的各個成分與固相相互作用不同使得樣品中的各個成分通與固相相互作用不同使得樣品中的各個成分通過固相的速率產生了差別，從而達到分離樣品過固相的速率產生了差別，從而達到分離樣品中各個成分的目的。中各個成分的目的。 層析因固相介質不同又分為層析因固相介質不同又分為、和和等各種層析。等各種層析。2 2 層析原理層析原理 將作為固相成分的將作為固相成分的不溶性基質，例如葡不溶性基質，例如葡聚糖凝膠、纖維素、聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。用平衡液平衡。 然后加樣品，再然后加樣

7、品，再用適當的溶劑洗脫。用適當的溶劑洗脫。 樣品中各種成分樣品中各種成分通過柱子取決于與固通過柱子取決于與固相成分的相互作用，相成分的相互作用，最后以不同速率被洗最后以不同速率被洗脫出來，達到將各個脫出來，達到將各個成分分離的目的。成分分離的目的。 凝膠層析是按照蛋凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠離的技術，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排過濾、分子篩層析或排阻層析。阻層析。 單個凝膠珠本身象單個凝膠珠本身象“篩子篩子”。不同類型凝。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。膠的篩孔的大小不同。1.2 凝膠過濾層析凝膠過濾層析帶網孔的帶網孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子進

8、入小分子進入葡聚糖珠內葡聚糖珠內大分子不大分子不能進入珠能進入珠內，經珠內，經珠之間縫隙之間縫隙流出流出凝膠過濾層析過程示意圖凝膠過濾層析過程示意圖凝膠過濾層析過程示意凝膠過濾層析過程示意圖圖小分子小分子大分子大分子凝膠基質凝膠基質凝膠凝膠珠珠蛋白質蛋白質mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白質白質濃度濃度洗脫體積（洗脫體積（ml）未知未知logmr洗脫體積與相對分子質量的關系andrews的經驗公式：的經驗公式：logmr=k1-k2(ve/vo)g-200g-100logmrkav如果被分離的樣品中各個成分受溶液如果被分離的樣品中各個成分受溶液ph的影響，有時帶的影響，有時帶正電荷，

9、有時帶負電荷，此時就可利用離子交換層析方法進行正電荷，有時帶負電荷，此時就可利用離子交換層析方法進行樣品的分離。樣品的分離。 離子交換層析的固相是離子交換層析的固相是離子交換體離子交換體，包括離子交換樹脂、，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。 帶有帶有so3 或或coo基團，通常以基團，通常以so3na 或或cooh形形式出現的叫做陽離子交換基式出現的叫做陽離子交換基；帶有帶有n（c2h5）基團通常以）基團通常以n（c2h5）cl出現的叫做出現的叫做陰離子交換基陰離子交換基。3 離子交換層析離子交換層析陽離子交換基陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂

10、強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素弱堿性，二乙氨乙基纖維素：蛋白質是由氨基酸聚合形成的聚合物，所：蛋白質是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質也存在等電點（以蛋白質也存在等電點（pi），蛋白質在溶液中帶電狀況），蛋白質在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的同氨基酸相同，取決于所處溶液的ph 值。值。當當pi ph時，蛋時，蛋白質帶凈正電荷。白質帶凈正電荷。已知蛋白已知蛋白x等電點為等電點為7，設計實驗利用陰離子交換

11、樹脂純化。，設計實驗利用陰離子交換樹脂純化。答案答案：建立陰離子交換柱，比如建立陰離子交換柱，比如q-sepharose。用。用ph8.5的緩的緩沖液平衡柱子，同時蛋白沖液平衡柱子，同時蛋白x溶解于溶解于ph8.5的緩沖液中，在此的緩沖液中，在此ph值下蛋白值下蛋白x帶有負電，將含有蛋白帶有負電，將含有蛋白x的混合液上樣，然后的混合液上樣，然后用起始液沖洗，蛋白用起始液沖洗，蛋白x會與此柱結合，然后鹽梯度洗脫。會與此柱結合，然后鹽梯度洗脫。陽陽離離子子交交換換層層析析過過程程離子交離子交換樹脂換樹脂蛋白質蛋白質高離子高離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗高離子高離子強度洗強度洗脫液洗脫液洗加加樣樣平平

12、衡衡液液洗洗收集收集依賴于蛋白質和它的配體（依賴于蛋白質和它的配體（ligand）之間的相互作用來分）之間的相互作用來分離的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結合（一般是離的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結合（一般是非共價結合）的分子、基團、離子、或原子。但在親和層析非共價結合）的分子、基團、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質結合，配體可以是酶結合的中，配體是通過共價鍵先與基質結合，配體可以是酶結合的一個反應物或產物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。一個反應物或產物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。 當蛋白質混合物通過裝有連接了配體的基質的親和層析當蛋白質混合物通過裝有

13、連接了配體的基質的親和層析柱時，只有靶蛋白可以特異地與基質結合，而其它沒有結合柱時，只有靶蛋白可以特異地與基質結合，而其它沒有結合的蛋白質首先被洗脫下來。特異結合在基質上的靶蛋白最后的蛋白質首先被洗脫下來。特異結合在基質上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下。所以有時只用親和可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下。所以有時只用親和層析就可使蛋白質的純化提高層析就可使蛋白質的純化提高1000至至10000倍。倍。4 親和層析親和層析含配體溶液含配體溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未結合的蛋白洗下未結合的蛋白混合蛋白樣混合蛋白樣品品平衡液平衡液帶有配體的樹脂帶有配體的樹脂珠（或膠粒）珠（或

14、膠粒）親和層析過程親和層析過程his- tag所用層析凝膠的基質所用層析凝膠的基質上連接了一個上連接了一個nta（=nitrilotriacetic acid 氮基氮基三乙酸），可以與三乙酸），可以與ni離子結合，離子結合，而而ni離子與融合蛋白的離子與融合蛋白的6xhis氨基酸之間產生如圖的吸引力，氨基酸之間產生如圖的吸引力，從而將帶有從而將帶有his-tag組氨酸標簽組氨酸標簽的融合的融合 蛋白與其它蛋白區分蛋白與其它蛋白區分開來。開來。從圖中可以看到，組氨酸殘基從圖中可以看到，組氨酸殘基紅色紅色五元咪唑環是蛋白與五元咪唑環是蛋白與nini離離子作用的關鍵。子作用的關鍵。因此帶暴露的因此帶

15、暴露的his-6的蛋白能的蛋白能結合于固化結合于固化nini樹脂，用適當緩樹脂，用適當緩沖溶液沖洗去其他蛋白后，再沖溶液沖洗去其他蛋白后，再用可溶的競爭性螯合劑洗脫可用可溶的競爭性螯合劑洗脫可以回收靶蛋白以回收靶蛋白。電泳v 電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分電泳分離蛋白質是根據蛋白質在電場中的遷移的差別達到分離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要離目的的。蛋白質樣品加到一塊預先制好的凝膠介質上，只要在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣在凝膠的兩端加上電場，就可以達到分離蛋白質的目的，這樣的電泳稱之凝膠電泳（的電泳稱之凝膠電泳（gel ele

16、ctrophoresisgel electrophoresis）。凝膠可以是）。凝膠可以是淀粉凝膠（淀粉凝膠（starch gelstarch gel）、瓊脂糖凝膠（）、瓊脂糖凝膠（agarose gelagarose gel）和聚）和聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gelpolyacrylamide gel）。一般凝膠介質中的）。一般凝膠介質中的phph被維持在堿性區，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣被維持在堿性區，目的是使大多數蛋白質都帶有負電荷，這樣它們可以向陽極遷移。蛋白質的遷移與蛋白質的質量和帶電荷它們可以向陽極遷移。蛋白質的遷移與蛋白質的質量和帶電

17、荷的多少有關。的多少有關。電泳技術分類垂直板電泳垂直板電泳毛細管電泳毛細管電泳水平板電泳水平板電泳電電泳泳支支持持物物濾紙濾紙凝膠凝膠薄膜薄膜圓盤電泳圓盤電泳sdspage測定相對分子質量測定相對分子質量十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉原態蛋白質變性？磺酸基磺酸基 極性親水極性親水烷基烷基 親油親油（蛋白質疏水區）（蛋白質疏水區）遷移率與電荷和形狀無關，僅取決于遷移率與電荷和形狀無關，僅取決于相對分子質量相對分子質量巰基乙醇破壞二硫鍵研究背景研究背景 精氨酸激酶的簡介精氨酸激酶的簡介無脊椎動物的精氨酸激酶（arginine kinase, ak）（atp:n-精氨酸磷酸轉移酶e.c.2.7.3.3

18、）類似于脊椎動物中的肌酸激酶（creatine kinase ，ck）（atp:n-肌酸磷酸轉移酶e.c.2.7.3.3）， 是細胞代謝中的磷酸激酶，它將mg2+atp上的磷酸基轉移到精氨酸上，產生磷酸精氨酸和mg2+adp，在無脊椎動物的能量代謝中起著重要作用 。ak在體內催化反應方程式如下：arginineatpmgphosphatearginineadpmg22主要實驗儀器主要實驗儀器紫外分光光度計紫外分光光度計u4300，電腦恒溫層析柜、，電腦恒溫層析柜、 orion ph計、計、紫外檢測儀、冷凍離心機、紫外檢測儀、冷凍離心機、 超聲破壁儀超聲破壁儀 、雪山制冰機、雪山制冰機、超純水機

19、、低溫恒溫槽電泳儀、電子天平、振蕩培養箱、超純水機、低溫恒溫槽電泳儀、電子天平、振蕩培養箱、單人單面凈化工作臺、電熱恒溫鼓風干燥箱、高壓滅菌鍋單人單面凈化工作臺、電熱恒溫鼓風干燥箱、高壓滅菌鍋實驗內容實驗內容1 活化菌種活化菌種 取取50 50 l l表達菌種接入表達菌種接入6 ml6 ml的的lblb液體培養基（含有卡那液體培養基（含有卡那青霉素，其工作濃度為青霉素，其工作濃度為50 50 g/mlg/ml）中，于）中，于37 37 搖床振蕩搖床振蕩培養培養8-128-12小時。小時。 2 擴大培養擴大培養 將試管中活化的將試管中活化的3 ml3 ml菌液接種到菌液接種到100 ml lb1

20、00 ml lb培養基，同培養基，同時加入卡那青霉素（終濃度時加入卡那青霉素（終濃度50 50 g/mlg/ml）培養基于）培養基于3737恒溫恒溫培養箱中培養培養箱中培養2-3 2-3 小時。小時。3 iptg誘導誘導ak的表達的表達 實驗中在不同的培養時間（用實驗中在不同的培養時間（用odod值表征菌體密度）加值表征菌體密度）加入入 iptgiptg誘導表達發現，當溫度為誘導表達發現，當溫度為22 22 ，od=0.6-0.8od=0.6-0.8時，時，iptgiptg終濃度為終濃度為0.5 mm0.5 mm時時akak的表達量達到最大。的表達量達到最大。4 蛋白質提取蛋白質提取（1 1）

21、將上述各管于）將上述各管于4 4 ，5000 r/m5000 r/m離心離心1010分鐘；分鐘；（2 2）棄上清，使沉淀物質重懸，每）棄上清，使沉淀物質重懸，每1 g 1 g 沉淀加沉淀加5 ml5 ml裂解裂解液；液；（3 3）在冰上進行）在冰上進行1010分鐘，間隔為分鐘，間隔為2 2秒鐘的超聲波破壁秒鐘的超聲波破壁, ,直直到沉淀變得澄清為止；到沉淀變得澄清為止；（4 4）于）于4 4 ，12000 rpm12000 rpm，離心，離心1010分鐘，取上清，得到分鐘，取上清，得到akak的粗提液。的粗提液。5 his-tag ni親和層析法純化融合蛋白親和層析法純化融合蛋白預處理：預處理

22、：(1)(1)用用2 m2 m鹽酸胍鹽酸胍10 ml10 ml與樹脂打散混合洗滌；與樹脂打散混合洗滌；(2)(2)用用stripping bufferstripping buffer洗洗2020分鐘；蒸餾水洗分鐘；蒸餾水洗3030分鐘；分鐘；(3)1.5 m(3)1.5 m鹽酸胍洗鹽酸胍洗3030分鐘，蒸餾水洗分鐘，蒸餾水洗3030分鐘；分鐘；(4)(4)用用1 m naoh1 m naoh洗洗1 1小時；用小時；用binding bufferbinding buffer洗洗2020分鐘；蒸餾分鐘；蒸餾水洗水洗3030分鐘；分鐘；(5)(5)用用1.5 m nacl1.5 m nacl洗洗1

23、1小時；用小時；用binding bufferbinding buffer洗洗2020分鐘；蒸分鐘；蒸餾水洗餾水洗3030分鐘；分鐘；(6)ni(6)ni柱再生：柱再生：150 ml 0.1 m niso4150 ml 0.1 m niso4洗洗蒸餾水洗（穿流液蒸餾水洗（穿流液無色）無色）binding bufferbinding buffer平衡。平衡。 平衡：平衡：6 6倍柱床體積倍柱床體積binding bufferbinding buffer（ph=8.0ph=8.0）平衡。）平衡。上樣：插上樣：插a280a280濾光片，調濾光片，調a a值（值（0 0）、）、t t值（值（10010

24、0）；打開采集）；打開采集器；打開電腦蛋白核酸檢測系統，保存文檔并按開始采集。器；打開電腦蛋白核酸檢測系統，保存文檔并按開始采集。將粗提液將粗提液45 ml45 ml上柱，流速約為上柱，流速約為1.6-1.8 ml/min1.6-1.8 ml/min。 洗脫：上樣完后，繼續用洗脫：上樣完后，繼續用binding buffer binding buffer （ph=8.0ph=8.0）淋洗。）淋洗。待雜蛋白峰回落走平之后開始用不同梯度的咪唑（待雜蛋白峰回落走平之后開始用不同梯度的咪唑（20 mm20 mm、40 mm40 mm、80 mm80 mm、100 mm100 mm、150 mm150 mm）洗脫。在）洗脫。在280 nm280 nm處進行連處進行連續紫外檢測，根據微電腦記錄儀顯示曲線。分別收集峰值的續紫外檢測，根據微電腦記錄儀顯示曲線。分別收集峰值的洗脫液根據波峰對每管收集蛋白測活并留樣、電泳檢測純化洗脫液根據波峰對每管收集蛋白測活并留樣、電泳檢測純化程度。程度。 6 ak的檢測sds-page電泳：電泳：（1 1）安裝雙垂直板電泳槽；）安裝雙垂直板電泳槽； （2 2）配）配12%12%的分離膠的分離膠5 ml5 ml，濃縮膠，濃縮膠3 ml3 ml；（3 3）制樣：取樣品）制樣：取樣品20 20 l l與樣品緩沖液與樣品緩沖液10