1、概述n實質：高效液相色譜儀n填料：強酸型陽離子交換樹脂n檢測器：可見或熒光分光光度計選擇性好、準確度高分析速度快，靈敏度高概述n20世紀40年代，開始探求色譜法分析氨基酸；n提高洗脫流速、改良柱直徑、填料粒度，提高分析速度；n20世紀80年代，鍵合反相分配色譜、柱前衍生技術的發展；n目前，配合微機控制程序和處理數據，成為氨基酸最準確可靠的分離測試方法。概述n本章主要內容1、傳統離子交換色譜專用氨基酸分析儀2、柱前衍生反相高效液相色譜的氨基酸分析第一節 基本原理n先將氨基酸混合物在離子交換樹脂柱上進行分離，然后按照分離后的氨基酸衍生。根據衍生產物的特性，選擇適當的檢測器檢測并進行定性與定量分析。

2、1.1 離子交換樹脂1.填料：磺酸型強酸陽離子交換樹脂2.苯乙烯為主體；3.離子交換的活性基團：磺酸根（連接在苯乙烯中乙烯基的對位上）；4.與二乙烯基苯交聯，形成不溶的高分子骨架，易吸水溶解。5.交聯劑所占比例決定網狀結構的孔徑大小（氨基酸：8%12%的交聯度）。6.na+型（蛋白質水解液中的氨基酸分析），li+型（全部氨基酸的分析）7、考慮磺化程度、交聯劑純度和類型、粒度大小（510um）。1.2 氨基酸在色譜柱中的分離xo3-na+ h3n+chrcoohxso3-h3n+chrcooh + na+ph減小ph增大ph小于氨基酸的等電點時，氨基酸帶正電荷，可被磺酸基團吸引，隨著ph升高或離

3、子強度增大，氨基酸所帶正電荷減少，吸引力下降乃至消失而被洗脫下來。1、不同的氨基酸，其等電點、極性及相對分子質量大小不同，其洗脫順序不同；2、一般先后順序： 酸性和帶羥基的氨基酸（最早） 中性氨基酸（其次） 堿性氨基酸（最后）3、同類氨基酸中，短鏈氨基酸先被洗脫；4、碳數相同的氨基酸，有支鏈的比無支鏈的先洗脫出來。1.2 氨基酸在色譜柱中的分離n氨基酸的分離影響因素： 離子交換樹脂的型號、粒度、交聯度； 柱長、直徑、柱溫； 洗脫液的陽離子類型、ph值、離子強度、洗脫梯度、流速及其中有機溶劑含量。1.2 氨基酸在色譜柱中的分離1、3 衍生及檢測n多數氨基酸無生色基團，在紫外可見光區無吸收（phe

4、、trp、lyr例外），需要將它們衍生，成為具有紫外、可見光吸收或能產生熒光的物質才可以檢測。衍生方式：衍生方式：1、柱前衍生法：、柱前衍生法：將將aa混合物先衍生后，在用反相混合物先衍生后，在用反相 分配分配色譜法分離，測定其紫外吸收或產生的色譜法分離，測定其紫外吸收或產生的熒光強度。熒光強度。1、3 衍生及檢測2、柱后衍生法：、柱后衍生法：將將aa混合物用離子交換色譜法分離，在混合物用離子交換色譜法分離，在把分離后的氨基酸衍生為具有可見吸收把分離后的氨基酸衍生為具有可見吸收或產生熒光的物質，然后測定。或產生熒光的物質，然后測定。n常用的衍生方法：1、3 衍生及檢測（1）茚三酮法）茚三酮法多

5、數氨基酸與水合茚三酮在弱酸條件下共多數氨基酸與水合茚三酮在弱酸條件下共熱，引起熱，引起aa的氧化脫氨、脫羧反應，水的氧化脫氨、脫羧反應，水合茚三酮與氨合還原茚三酮反應，生成紫合茚三酮與氨合還原茚三酮反應，生成紫色色dyda，最大吸收，最大吸收570nm（脯氨酸與羥（脯氨酸與羥脯氨酸例外，生成黃色化合物，最大吸收脯氨酸例外，生成黃色化合物，最大吸收440nm）。）。最后根據吸光度與峰面積的關系定性定量最后根據吸光度與峰面積的關系定性定量分析。分析。1、3 衍生及檢測第二節 氨基酸分析儀的結構性能 見圖38-7 （p181）洗脫裝置色譜柱（控溫）混合室反應器檢測器工作站衍生液第二節 氨基酸分析儀的

6、結構性能（1）輸液系統）輸液系統組成：組成：泵、切換閥或梯度洗脫裝置；泵、切換閥或梯度洗脫裝置；作用：作用：輸送緩沖液、衍生試劑、輸送緩沖液、衍生試劑、 再生液；再生液；要求：要求：流量恒定、流速穩定、較高的輸出流量恒定、流速穩定、較高的輸出壓、輸出流量范圍大。壓、輸出流量范圍大。第二節 氨基酸分析儀的結構性能（2）進樣分離系統）進樣分離系統組成：進樣器、色譜柱組成：進樣器、色譜柱aa最佳分離溫度：最佳分離溫度：3070度，度，需恒溫，一般柱溫升高，出峰時需恒溫，一般柱溫升高，出峰時間縮短。間縮短。（3）檢測系統）檢測系統第二節 氨基酸分析儀的結構性能取決于取決于aa衍生的方式衍生的方式:茚三

7、酮法，柱后衍生。茚三酮與分離后的茚三酮法，柱后衍生。茚三酮與分離后的aa混合并在混合并在100左右的水浴中反應左右的水浴中反應15min，最后由紫外檢測儀檢測。最后由紫外檢測儀檢測。opa法，分離柱流出液與法，分離柱流出液與naclo混合，再混合，再與與opa混合，生成熒光衍生物，采用熒光混合，生成熒光衍生物，采用熒光光度計分析測定。光度計分析測定。第二節 氨基酸分析儀的結構性能常見的儀器的主要性能：見表38-4（p183）第三節 試樣的前處理方法3、1 上機分析試樣液的要求試液澄清透明無可見雜質，放置或離心不產生試液澄清透明無可見雜質，放置或離心不產生沉淀；沉淀；試液無色或略帶淺黃色，否則需脫色處理（活試液無色或略帶淺黃色，否則需脫色處理（活性炭對芳香族性炭對芳香族aa有吸附，導致檢測結果偏有吸附，導致檢測結果偏低）；低）；含鹽量要低；含鹽量要低；無蛋白質或肽類物質（水解充分）；無蛋白質或肽類物質（水解充分）；以以ph2。2為宜；為宜；aa濃度以濃度以0。144mg/ml（110ng/50ul）為）為宜。宜。第三節 試樣的前處理方法（1）酸水解）酸水解鹽酸水解法鹽酸水解法 被破壞的：被破壞的：met、trp； 不易水解：不易水解：ile、leu、val。過甲酸氧化法過甲酸氧化法（2）堿水解法第三節 試樣的前處理方法（3