1、發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用 發(fā)酵工程在現(xiàn)代發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用生物技術(shù)中的應(yīng)用 發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n生物技術(shù)：應(yīng)用自然學(xué)和工程學(xué)生物技術(shù)：應(yīng)用自然學(xué)和工程學(xué)的原理，依靠生物作用劑的作用的原理，依靠生物作用劑的作用將生物物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品將生物物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品和為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)。和為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代以后，以年代以后，以DNADNA重組技重組技術(shù)的建立為標(biāo)志，形成了一個(gè)以術(shù)的建立為標(biāo)志，形成了一個(gè)以基因工程為主導(dǎo)，發(fā)酵工程為中基因工程為主導(dǎo)，發(fā)酵工程為中心，包括細(xì)胞工程和酶工程的現(xiàn)心，包括細(xì)胞工程和酶工

2、程的現(xiàn)代生物技術(shù)體系。代生物技術(shù)體系。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 基因工程菌發(fā)酵基因工程菌發(fā)酵一、基因工程技術(shù)一、基因工程技術(shù) 通過(guò)對(duì)核酸分子的插入、拼通過(guò)對(duì)核酸分子的插入、拼接和重組而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新接和重組而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，借助載體將重組的目的基組合，借助載體將重組的目的基因轉(zhuǎn)移新的宿主細(xì)胞體系，并使因轉(zhuǎn)移新的宿主細(xì)胞體系，并使目的基因在新的宿主體系細(xì)胞中目的基因在新的宿主體系細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增和表達(dá)所需的目的進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增和表達(dá)所需的目的產(chǎn)物。產(chǎn)物。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用基因工程菌的制備基因工程菌的制備n一、目的基因的制備一、目的基因的制備 1.1.鳥(niǎo)槍法

3、鳥(niǎo)槍法 選用合適的內(nèi)切酶，在選用合適的內(nèi)切酶，在Mg2+Mg2+的激活的激活下，切開(kāi)供體下，切開(kāi)供體DNADNA鏈獲得目的基因，根據(jù)鏈獲得目的基因，根據(jù)酶切末端特點(diǎn)分為酶切末端特點(diǎn)分為a a、b b兩類。兩類。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用基因工程菌的制備基因工程菌的制備 2.cDNA 2.cDNA法法 又稱反轉(zhuǎn)錄法，從細(xì)胞內(nèi)提取目的又稱反轉(zhuǎn)錄法，從細(xì)胞內(nèi)提取目的基因的基因的mRNAmRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)的cDNAcDNA。 3.3.人工合成人工合成 在電腦控制下通過(guò)合成儀合成獲得在電腦控制下通過(guò)合成儀合成獲得的的DNAD

4、NA片段。片段。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n二、載體的準(zhǔn)備二、載體的準(zhǔn)備 目前常用的基因克隆載體：目前常用的基因克隆載體： 1.1.質(zhì)粒：嚴(yán)密性質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒質(zhì)粒：嚴(yán)密性質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒 2.pBR322 2.pBR322和和pUCpUC：去除原有質(zhì)粒的非：去除原有質(zhì)粒的非必須功能，引入選擇標(biāo)記和在適宜的位必須功能，引入選擇標(biāo)記和在適宜的位置設(shè)置限制酶單一切點(diǎn)。置設(shè)置限制酶單一切點(diǎn)。 3.3.噬菌體載體噬菌體載體 有有噬菌體和噬菌體和M13噬菌體噬菌體發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n三、基因與載體的連接三、基因與載體的連接 外源外源DNADNA與載體與載體DNADNA之間連接方式：之間連

5、接方式： 1.1.粘性末端連接粘性末端連接 先用一種酶切割外源先用一種酶切割外源DNADNA并將擬插入并將擬插入的那個(gè)片段用凝膠電泳分離出來(lái)，再用的那個(gè)片段用凝膠電泳分離出來(lái)，再用同一種酶去切載體同一種酶去切載體DNADNA，這樣可以通過(guò)粘，這樣可以通過(guò)粘性末端連接起來(lái)。性末端連接起來(lái)。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用 2. 2.平末端連接平末端連接 3.3.在在DNADNA片段末端加上均聚寡核苷酸片段末端加上均聚寡核苷酸后連接：末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化后連接：末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化DNADNA末末端的端的3 3 -OH上添加單核苷酸的反應(yīng)，形成上添加單核苷酸的反應(yīng)，形成 寡聚核苷酸連，如果在一個(gè)

6、寡聚核苷酸連，如果在一個(gè)DNA片段的片段的3 3 -OH末端上添加寡聚末端上添加寡聚T，那么另一，那么另一DNA片片段的段的3 3 -OH 末端上一定添加與末端上一定添加與T T互補(bǔ)的互補(bǔ)的寡聚寡聚A A。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n四、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 取決于是否用合適的受體細(xì)胞、合適取決于是否用合適的受體細(xì)胞、合適的克隆載體和合適的基因轉(zhuǎn)移方法的克隆載體和合適的基因轉(zhuǎn)移方法發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用濕熱滅菌法濕熱滅菌法n煮沸滅菌法煮沸滅菌法 將要消毒的物品放入水中煮

7、沸將要消毒的物品放入水中煮沸（100）1520min，一般微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都可以殺死，但，一般微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都可以殺死，但不能殺死芽孢。不能殺死芽孢。n巴氏消毒法巴氏消毒法 法國(guó)微生物學(xué)家、化學(xué)家巴斯德首創(chuàng)的低溫法國(guó)微生物學(xué)家、化學(xué)家巴斯德首創(chuàng)的低溫消毒法。加熱到消毒法。加熱到6262，經(jīng)過(guò)，經(jīng)過(guò)3030分鐘，以殺死不耐分鐘，以殺死不耐高溫的物質(zhì)中的微生物和病原體的消毒法。高溫的物質(zhì)中的微生物和病原體的消毒法。 牛奶、啤酒、黃酒、醬油和醋等用此法消毒。牛奶、啤酒、黃酒、醬油和醋等用此法消毒。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用濕熱滅菌法濕熱滅菌法n間歇滅菌法間歇滅菌法 反復(fù)幾次的常壓蒸汽滅菌，以達(dá)

8、到殺死微反復(fù)幾次的常壓蒸汽滅菌，以達(dá)到殺死微生物營(yíng)養(yǎng)體和芽孢的目的。生物營(yíng)養(yǎng)體和芽孢的目的。 操作步驟：操作步驟：100，30-60min；37，1h；同上重復(fù)三次同上重復(fù)三次 適用于不宜高壓滅菌的物質(zhì)，如糖類明膠適用于不宜高壓滅菌的物質(zhì)，如糖類明膠牛奶培養(yǎng)基。牛奶培養(yǎng)基。 方法簡(jiǎn)單，但卻麻煩；工作周期長(zhǎng)。方法簡(jiǎn)單，但卻麻煩；工作周期長(zhǎng)。 發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用濕熱滅菌法濕熱滅菌法n高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法 使用密閉的高壓蒸汽滅菌鍋，使滅菌鍋使用密閉的高壓蒸汽滅菌鍋，使滅菌鍋內(nèi)蒸汽不外溢，增加壓力，由于壓力的增內(nèi)蒸汽不外溢，增加壓力，由于壓力的增高，溫度也隨之增高，從而提高殺菌力，

9、高，溫度也隨之增高，從而提高殺菌力，縮短滅菌時(shí)間。縮短滅菌時(shí)間。n最有效而廣泛應(yīng)用的滅菌方法最有效而廣泛應(yīng)用的滅菌方法n實(shí)驗(yàn)室常用的是實(shí)驗(yàn)室常用的是0.1MPa，121，1530min發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 培養(yǎng)基，水，發(fā)酵罐等其他不適培養(yǎng)基，水，發(fā)酵罐等其他不適合干熱滅菌的物品。合干熱滅菌的物品。n高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)：高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)：n完全排除鍋內(nèi)冷空氣完全排除鍋內(nèi)冷空氣n滅菌完畢后要緩慢減壓滅菌完畢后要緩慢減壓1.壓力降為零后打開(kāi)蓋子壓力降為零后打開(kāi)蓋子發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工

10、程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用四、臭氧滅菌四、臭氧滅菌n利用臭氧的氧化作用殺死微生物細(xì)胞。利用臭氧的氧化作用殺死微生物細(xì)胞。n氧化分解葡萄糖所必需的酶，從而直接氧化分解葡萄糖所必需的酶，從而直接破壞其細(xì)胞膜，從而將細(xì)菌殺死。破壞其細(xì)胞膜，從而將細(xì)菌殺死。n無(wú)污染消毒劑無(wú)污染消毒劑n對(duì)細(xì)菌、霉菌等殺菌效果好對(duì)細(xì)菌、霉菌等殺菌效果好n安全，殺菌效果明顯，安裝靈活等特點(diǎn)安全，殺菌效果明顯，安裝靈活等特點(diǎn)n用于潔凈室、凈化設(shè)備的消毒。用于潔凈室、凈化設(shè)備的消毒。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)

11、用表表 3 3- -6 6 各各種種滅滅菌菌方方法法的的特特點(diǎn)點(diǎn)及及適適用用范范圍圍 滅菌方法 原理及條件 特點(diǎn) 適用范圍 火焰滅菌法 利用火焰直接把微生物殺死。 方法簡(jiǎn)單、 滅菌徹底、但適用范圍有限。 適用于接種針、玻璃棒、試管口、三角瓶口等滅菌 干熱滅菌法 利用熱空氣將微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)氧化進(jìn)行滅菌 滅菌后物料可保持干燥，方法簡(jiǎn)單，但滅菌效果不如濕熱滅菌 適用于金屬或玻璃器皿的滅菌。 濕熱滅菌法 利用高溫蒸汽將物料的溫度升高使微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性進(jìn)行滅菌 蒸汽來(lái)源容易、潛熱大、穿透力強(qiáng)、滅菌效果好、 操作費(fèi)用低、有經(jīng)濟(jì)快速的特點(diǎn) 廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌。 射線滅菌法 用射線穿透

12、微生物細(xì)胞進(jìn)行滅菌 使用方便，但穿透能力較差，適用范圍有限 一 般 只 適 用 于 無(wú) 菌室，無(wú)菌箱搖瓶間和器皿表面的消毒 化學(xué)式劑滅菌法 利用化學(xué)試劑對(duì)微生物的氧化作用或損傷細(xì)胞等進(jìn)行滅菌 使用方法較廣，可用于無(wú)法用加熱方法進(jìn)行滅菌的物品 常用于環(huán)境空氣的滅菌及一些表面的滅菌 過(guò)濾除菌法 利用過(guò)濾介質(zhì)將微生物菌體細(xì)胞過(guò)濾進(jìn)行除菌 不改變物性而達(dá)到滅菌目的，設(shè)備要求高 常用于生產(chǎn)中空氣的凈化除菌，少數(shù)用于容易被熱破壞的培養(yǎng)基的滅菌 發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的濕熱滅菌培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的濕熱滅菌n一、滅菌條件的選擇一、滅菌條件的選擇 選擇的原則：達(dá)到滅菌的目的，

13、同時(shí)選擇的原則：達(dá)到滅菌的目的，同時(shí)使培養(yǎng)基成分破壞減至最小。使培養(yǎng)基成分破壞減至最小。1、滅菌溫度和滅菌時(shí)間的選擇滅菌溫度和滅菌時(shí)間的選擇 為什么選擇為什么選擇高溫快速高溫快速滅菌？滅菌？ 溫度升高，反應(yīng)速率升高，溫度升高，反應(yīng)速率升高，微生物死亡速微生物死亡速率遠(yuǎn)大于營(yíng)養(yǎng)成分的的破壞速率率遠(yuǎn)大于營(yíng)養(yǎng)成分的的破壞速率滅菌程度與滅菌時(shí)間的影響滅菌程度與滅菌時(shí)間的影響 微生物的熱死規(guī)律微生物的熱死規(guī)律對(duì)數(shù)殘留定律對(duì)數(shù)殘留定律發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n滅菌程度與滅菌時(shí)間的滅菌程度與滅菌時(shí)間的影響影響 微生物的熱死規(guī)律微生物的熱死規(guī)律對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)殘留定律殘留定律n微生物受熱死亡的主要原因是高微生物

14、受熱死亡的主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)可熱能使蛋白質(zhì)變性，這種反應(yīng)可認(rèn)為是單分子反應(yīng)，死亡速率可認(rèn)為是單分子反應(yīng)，死亡速率可視為一級(jí)反應(yīng)，即與殘存的微生視為一級(jí)反應(yīng)，即與殘存的微生物數(shù)量成正比。物數(shù)量成正比。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用KteNNttNNKNdtdN000,積分得：初始條件：式中式中 N經(jīng)時(shí)間經(jīng)時(shí)間t后殘存的活菌濃度（個(gè)后殘存的活菌濃度（個(gè)/L)， N0開(kāi)始滅菌時(shí)原有活菌濃度（個(gè)開(kāi)始滅菌時(shí)原有活菌濃度（個(gè)/L)；t滅菌時(shí)間（滅菌時(shí)間（s,min）K滅菌速率常數(shù)或比死亡速率常數(shù)（滅菌速率常數(shù)或比死亡速率常數(shù)（s-1,min-1）它的大小與微生物的它的大小與微生物的種類

15、種類和加熱和加熱溫度溫度有關(guān)。在同等有關(guān)。在同等溫度下，其值小，微生物的耐熱性強(qiáng)。溫度下，其值小，微生物的耐熱性強(qiáng)。從上式得出：從上式得出：t, N之間的關(guān)系為對(duì)數(shù)之間的關(guān)系為對(duì)數(shù)式中式中N/N0菌體存活率，而菌體存活率，而N0/N為滅菌度。為滅菌度。t=（2.303/K）(N0/ N)發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用二、培養(yǎng)基的滅菌方法二、培養(yǎng)基的滅菌方法發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用n缺點(diǎn)缺點(diǎn) 不適用于黏度大或固形物含量高的培不適用于黏度大或固形物含量高的培養(yǎng)基的滅菌；增加了一套連續(xù)滅菌設(shè)備，養(yǎng)基的滅菌

16、；增加了一套連續(xù)滅菌設(shè)備，增加了操作環(huán)節(jié)，增加了染菌的概率。增加了操作環(huán)節(jié)，增加了染菌的概率。n按設(shè)備和工藝條件分按設(shè)備和工藝條件分 （1）蒸汽直接加熱）蒸汽直接加熱 （2）蒸汽間接加熱）蒸汽間接加熱發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用1、蒸汽直接加熱連續(xù)滅菌系統(tǒng)、蒸汽直接加熱連續(xù)滅菌系統(tǒng) 定義：定義：蒸汽通入培養(yǎng)基中，蒸汽通入培養(yǎng)基中，快速加熱至殺菌快速加熱至殺菌溫度，維持一段時(shí)間，后冷卻至發(fā)酵溫度的過(guò)溫度，維持一段時(shí)間，后冷卻至發(fā)酵溫度的過(guò)程。分兩種形式：程。分兩種形式：（1）由連消塔、維持罐和冷卻器組成）由連消塔、維持罐和冷卻器組成配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70，防止培養(yǎng)基在殺

17、菌時(shí)，防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。連消塔使培養(yǎng)基迅速連消塔使培養(yǎng)基迅速(20s)升溫升溫(126-132)。維持罐：使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。維持罐：使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。2-7min.冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到冷卻管：將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50 ，輸送到滅菌，輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)后的發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用（2 2）噴射加熱連續(xù)滅菌流程）噴射加熱連續(xù)滅菌流程由噴射加熱、維持罐和真空冷卻器組成的連續(xù)由噴射加熱、維持罐和真空冷卻器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)。滅

18、菌系統(tǒng)。蒸汽直接噴入待滅菌的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液急劇升蒸汽直接噴入待滅菌的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液急劇升溫到預(yù)定的滅菌溫度，培養(yǎng)基在該溫度送入維溫到預(yù)定的滅菌溫度，培養(yǎng)基在該溫度送入維持管維持一段時(shí)間后，通過(guò)一膨脹閥進(jìn)入真空持管維持一段時(shí)間后，通過(guò)一膨脹閥進(jìn)入真空冷卻器冷卻。冷卻器冷卻。保證培養(yǎng)基先進(jìn)先出，避免過(guò)熱或者滅菌不徹保證培養(yǎng)基先進(jìn)先出，避免過(guò)熱或者滅菌不徹底底升溫快、營(yíng)養(yǎng)損失小升溫快、營(yíng)養(yǎng)損失小隨著蒸汽的冷凝使培養(yǎng)基稀釋隨著蒸汽的冷凝使培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用2 2、蒸汽間接加熱連續(xù)滅菌系統(tǒng)、蒸汽間接加熱連續(xù)滅菌系統(tǒng)n蒸汽不直接與培養(yǎng)基接觸，而是通過(guò)熱交換器蒸汽不直接與培養(yǎng)基接觸，而是通過(guò)熱交換器對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行加熱。n熱交換器有板式和螺旋板式兩種熱交換器有板式和螺旋板式兩種n螺旋板式交換器的特點(diǎn)：流道寬，流速快，可螺旋板式交換器的特點(diǎn)：流道寬，流速快，可減少熱交換器表面結(jié)垢現(xiàn)象。適用于含有固行減少熱交換器表面結(jié)垢現(xiàn)象。適用于含有固行懸浮物的培養(yǎng)基的滅菌。懸浮物的培養(yǎng)基的滅菌。n板式交換器的特點(diǎn)：適用于含有少量固行懸浮板式交換器的特點(diǎn)：適用于含有少量固行懸浮物的培養(yǎng)基的滅菌。物的培養(yǎng)基的滅菌。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中