1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減桑枝總黃酮體外抗炎活性及機制研究（作者：單位：郵編：）作者：章丹丹 凌霜，張洪平，史海霞，薛永亮，楊曉露， 許錦文，卞卡【摘要】目的研究桑枝總黃酮的體外抗炎活性及其作用機制。方法IFN- 丫和LPS協同造成小鼠RAW264.細田胞炎癥模型；Griess反應測 定細胞上清液中NO產量;FRAP測定細胞總抗氧化能力;RT- PCR檢測 iNOS COX-2 HO-1、IL-1 B、IL-6、TNF-a mRNA表達;Western blot 檢測iNOS p-ERK蛋白表達水平。結果桑枝總黃酮呈劑量依賴性抑制 細胞上清液中NO含量并且無細胞毒性，提高細胞總抗氧化

2、能力，下 調 iNOS COX-2 IL-1 B、IL-6 mRNA和 iNOS p-ERK蛋白的表達， 上調HO-1mRN表達，但對TNF-a mRNA表達影響不大。結論桑枝總 黃酮部分通過MAP中的ERK信號轉導通路抑制iNOS基因和蛋白的表 達從而抑制NO的產量，提高細胞總抗氧化能力，同時下調COX-2IL-1 B、IL-6等炎癥介質和上調抗炎介質 HO-1的表達而發揮抗炎效 果。【關鍵詞】 炎癥；誘導型一氧化氮合酶；細胞因子；桑枝總黃酮； 作用機制Abstract : ObjectiveTo characterize anti-inflammativeeffectof total fl

3、avones from Morus alba L (TFM) on RAW264.7 macrophages stimulated withinterferon-丫 (IFN- 丫 ) /lipopolysaccharide (LPS). MethodsUsing IFN- 丫 plus LPS to stimulate RAW 264.7 macrophages as in flammatory cell model. Griess reacti on was used for n itric oxide measureme nt, MTT assay were used for cell

4、proliferatio n and viability, RT-PCR was used for assaying mRNAexpression and Western blot was used for protein expression. ResultsTFM dose-dependently inhibited both NOproduction and iNOSexpression in IFN- 丫 +LPSstimulated macrophages without inference on cell viability. The mRNA expression of infl

5、ammatory cytokines such as IL-13 and IL-6was sig ni fica ntly in hibited by TFM treatme nt. TFM suppressed gene expressi on of COX-2 while in creased HO-1 expressi on. The protein expression of iNOS and p-ERK was inhibited by TFM. Con clusi onOur study suggests that TFM may exert protective effects

6、aga inst in flammatio n damage through the mecha nism of in hibit ing excessive NO, reduc ing pro-i nflammatory mediators such as COX-2,IL-1 3 ,IL-6 , and increasing HO-1expression and enhancing total antioxidant ability. The inhibition of iNOSand COX-2 expression by TFM may be partially mediated th

7、rough extracellular regulated protein kin ases (ERK/MAPK) pathway.Key words : Inflammation; Nitric oxide; iNOS; Cytokines;Total flavones of Morus alba L.; Mechanism桑枝（Ramulus Mori）是桑科桑屬植物桑 Morus alba L.的一年生干燥嫩枝。味微苦、性平，歸肝經；具祛風濕、利關節、行水氣之功 效，適用于風寒濕痹、四肢拘攣、腳氣浮腫之病癥，臨床多用于治療 關節腫痛、手足麻木、癱瘓等多種疾病1。桑枝醇提物和石油醚、 醋酸

8、乙酯及正丁醇提取物處理動物炎癥模型有抗炎作用24。臨床使用經驗和現代藥理研究均提示桑枝具有較好的抗炎效果，但桑枝抗炎藥效的物質基礎和作用機制尚未闡明。過量的NO對炎癥的發生發展起著關鍵作用，對其誘導型合酶iNOS的調控有望成為治療炎癥的 新策略5。致炎因子的刺激將活化巨噬細胞 MAPK/ERK/NFk B信號 轉導通路，細胞因子大量表達，誘導型合酶iNOS/COX-2經誘導產生大量NO和PGs,炎癥介質推動級聯瀑布反應，造成細胞損傷使炎癥性 疾病進一步惡化。本文通過考察桑枝總黃酮（TFM）對RAW264.7炎癥細胞模型中NO 產量的影響，檢測總黃酮對炎癥中誘導型合酶iNOS COX-2 HO-

9、1的影響，同時檢測細胞因子及細胞總抗氧化能力的變化，檢測iNOSp-ERK蛋白水平的表達，來探討其抗炎機制。1材料與儀器1.1藥物與試劑桑枝Morus alba L.，購自上海養和堂中藥飲片 有限公司（批號：040707-8）;D- 101 樹脂購自天津南開大學化工廠； 蘆丁標準品，購自上海中藥標準化研究中心；RAW264.7細胞，購自ATCC公司;RPMI 1640、胎牛血清，購自Gibco公司。二甲基亞砜(DMSO)脂多糖(LPS)、TRIzol RNA提取試劑、陽性對照藥L- NIL、 TPTZ Griess反應試劑，均購自Sigma公司;Bio- rad 蛋白測定試 齊I、PVDF膜、

10、100bp DNA梯度標準品購自Bio- rad公司；鼠重組IFN- 丫，購自chemicon公司。蛋白梯度標準品，購自Progema公司;iNOS、 p-ERK B -actin 抗體和二抗購自 Cell Signal 公司和 Santa Cruz 公司。ECL檢測試劑購自GE公司。反轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒購 自北京博大泰克公司；引物由上海生物工程服務有限公司合成。其他 試劑均為分析純。1.2 儀器Rotavapor R- 220旋轉蒸發儀，瑞士 Buchi公 司;MODUL YOD- 23齡凍干燥儀，美國 Thermo 公司;Spectra MAX190 酶標儀，美國MD公司Q27853

11、2高速冷凍離心機，德國 Hettich 公 司;UV21700紫外分光光度計，日本島津公司；超聲波細胞粉碎機，寧 波新芝生物科技股份有限公司；PCR擴增儀，德國Biometra公司;GIS 凝膠圖像分析系統，上海天能科技有限公司；單向電泳系統，美國Bio-rad公司;sMPIC2600C自動X線膠片洗片機，上海申貝。2方法2.1桑枝總黃酮制備桑枝飲片由上海市食品藥品檢驗所檢驗為 桑枝(報告書編號：20080324)。全草加熱回流(70%乙醇，80C)提取 3次，濾液減壓濃縮后揮干乙醇后，獲得醇提浸膏。繼石油醚脫脂后 取適量浸膏分散在蒸餾水中，乙酸乙酯萃取，獲得的乙酸乙酯提取物 用D- 101大

12、孔樹脂柱吸附，以蒸餾水、稀乙醇預洗脫后，收集70%乙醇洗脫液，濃縮干燥獲得總黃酮，以蘆丁-硝酸鋁比色法測定其純度為61.38%。總黃酮冷凍真空干燥后-80 C保存，臨用前配制。2.2細胞培養 RAW 264.7細胞株培養于含10%臺牛血清的 RPMI1640培養基中，置于 CO2培養箱中，在37C和5%CO2條件下培養。2.3檢測指標2.3.1 Griess reaction 考察總黃酮干預后細胞上清液中亞硝酸鹽含量的變化細胞懸液以每孔 1X 105/100卩l接種于96孔板，培 養過夜。空白組采用含 0.1%DMSO勺RMPI 1 640培養細胞。模型組 采用 LPS(100 卩 g - L

13、-1)和 IFN- y (1 X 104U- L-1)協同刺激細胞。總黃酮采用50，100, 200 mg - L-1 3個劑量和預刺激6 h(-6 h)、總黃酮預處理6 h(+6 h)和同時加入(0 h)3個處理時間處理細胞。刺 激維持24 h后，吸取96孔板中的培養液100卩l，加入等體積的 Griess反應試劑，室溫反應10 min，酶標儀540 nm處讀取光吸收 值。計算總黃酮各劑量在不同處理時間對細胞上清液中亞硝酸鹽抑制 率。抑制率(%)=(模型組吸光值-各劑量干預組吸光值)/(模型組吸光 值-空白對照組吸光值)X 100%2.3.2 MTT法觀察總黃酮對細胞活力的影響總黃酮各劑量處

14、理組 吸取96孔板中的培養液100卩l用于Griess反應后，加入MTT用 PBS溶解為5 g L-1)溶液10卩l，繼續37C培養4 h，加入50卩l 三聯劑(0.01 mol L-1 鹽酸含 10%SDS 0.04 mol L-1 異丙醇)過 夜，用酶標儀讀取570 nm和630 nm光吸收值，以空白對照為100% 計算總黃酮各劑量對細胞活力的影響。233 FRAP法考察總黃酮對細胞總抗氧化能力的影響 FRAP容液 以 0.3 mol/L 醋酸鹽緩沖鹽（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ溶于 40 mmol/L HCI）和2 mmol/L FeCI3以10： 1 ： 1（V/V）混

15、合。取5卩I總黃酮干 預后的蛋白樣品加入245卩l FRAP溶液，并做空白對照靜置10 min 后，在酶標儀593 nm處測吸光度。2.3.4 RT- PCR考察總黃酮對 iNOS COX-2 HO-1、IL-1 B、IL-6、 TNF-a mRNA表達的影響RAW264.7細胞培養于30 mm細胞培養皿中， 總黃酮100、200 mg - L-1劑量預處理1 h，用IFN- 丫和LPS繼續 處理4 h后，力口 TIR試劑1 ml，按說明書提取 RNA所用RNA的 A260/A280均在1.82.0之間。按RT試劑盒說明逆轉錄合成模板 cDNA后，按PCR試劑盒說明應用PCR儀進行聚合酶鏈反應

16、，目的基 因引物序列如下：iNOS sense primer :5 -gcctcatgccttgattcat-3 ;iNOS antisense primer :5 -gagggtgaattccaga-3 ;IL-6:5 -tgaacaacg sense primoratgatgcacttgc-3 ,IL-6:5 -cgtagagaacaantisenseprimeragcataagtc-3 ,COX-2 sense primer 5-gatacgtgttgacgtccaga-3 COX-2 antisense primer 5 -gtctgtctagagtttcaccg-3 ;IL-1 3s

17、ense primer 5 -cctgtggccttgggcctcaa-3 ; IL-1 3 antisenseprimer5 -ggtgctgatgtaccagttggg-3 ; TNF- a sense primer 5-ccctcacactcagatcatcttctcaa-3 , TNF- a antisense primer5 -tctaagtacttgggcaggttgacctc-3 ; 3 -actin sense primer 5-ccaaggccaaccgccgc-3 ;3 -actin antisense primer 5 -agggtacatggtgccgcc-3 。PCR

18、產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠 掃描儀觀察拍照。2.3.5 Western blot 檢測總黃酮對iNOS p-ERK蛋白表達的影 響RAW264.7細胞培養于30 mm細胞培養皿中，總黃酮100,200 mgL-1 劑量預處理1 h后用IFN- 丫和LPS繼續處理，用冰PBS洗滌，加 入蛋白酶抑制劑后收集細胞，超聲破碎，離心(3 000Xg,15 min,4C)， 取蛋白上清液進行蛋白含量測定。每孔加入 25卩g的蛋白上樣，在 7.5%和12%勺SDS-PAG凝膠中電泳，蛋白轉移到 PVDF膜上，10%兌 脂牛奶封閉，分別用一抗 iNOS(1 ： 1 000)、p-ERK(1 : 1 0

19、00)、B - actin(1 : 800)與膜 4 C孵育過夜,PBST溶液洗膜 3X 15 min，IgG- HRP二抗(1 : 2 0001 : 5 000)與膜孵育1 h，PBST溶液洗膜3X 15 min，膜控干后加ECL試劑，X線顯影、定影。2.4計學方法實驗數據用士 s表示，差異顯著性檢驗采用t檢驗。 3結果3.1桑枝總黃酮對細胞中NO產量的影響IFN- y和LPS協同誘導 RAW264.7產生大量的NQ細胞上清中NO產物亞硝酸鹽含量顯著提高 (P0.01)。桑枝總黃酮呈劑量依賴性抑制細胞上清液中亞硝酸鹽的積 累(P0.01)，而對靜息細胞的NC產量沒有影響，總黃酮和刺激物同時

20、加入的處理時間抑制效果最好(表1)。表1桑枝總黃酮對激活及靜息 細胞中NO產量的影響3.2桑枝總黃酮對激活和靜息細胞的活力影響桑枝總黃酮呈劑 量依賴性提高刺激細胞的活力恢復到接近空白對照組，呈一定的細胞保護作用，在靜息細胞中呈劑量依賴性提高細胞活力，促進細胞增殖。結果見表2。3.3桑枝總黃酮對細胞總抗氧化能力的影響經LPS和IFN- 丫誘導后，細胞的總抗氧能力從(43.01 士 11.57),下降到(29.21 士 6.28)(P0.05),說明炎癥過程中存在著氧化應激。桑枝總黃酮處理后， 細胞總抗氧化能力較模型組有了不同程度的提高(P0.05)。結果見表3。表2桑枝總黃酮對激活和靜息細胞活力

21、的影響表3桑枝總黃酮對細胞總抗氧化能力的影響3.4桑枝總黃酮對誘導型合酶 iNOS COX-2 HO-1和炎性介質 IL-1 B、TNF-a、IL-6 基因表達的影響對照組 iNOS, COX-2 HO-1mRNA 都為低表達。而經誘導物刺激后，同屬于誘導型合酶的iNOS, COX-2 HO-1都高表達，上調量分別為各自對照組的71.93倍(P0.01)，16.62 倍(P0.01)，4.19倍(P0.05)。總黃酮2個劑量干預后iNOS表達較模 型組下調了 2.60%(P0.05)，47.26%(P0.01)，COX-2表達較模型組下 調了 0.52%(P0.01)，7.22%(P0.01)

22、， 100 mg- L-1 劑量對 HO-1 微弱 下調，而200 mg - L-1劑量較模型組表達提高了 8.2%(P0.05)。經誘導物刺激后的模型組中IL-1 B、TNF-a、IL-6都顯著提高， 各自為對照組的 1129.17%(P0.01)，59.91%(P0.05)，12.99%(P0.05)。200 mg - L-1劑量干預后IL-1 B較模型組下調表達24.40%(P0.01)， 2個劑量干預后IL-6較模型組表達下調了 23.78%(P0.05)， 26.99%(P0.05)。總黃酮對TNF-a表達無影響(圖1)。3.5桑枝總黃酮對iNOS和p-ERK蛋白的影響經誘導物刺激后

23、, iNOS蛋白高表達，是對照組的 80.09%(P0.01)。2個劑量下調iNOS 較模型組下調3.28%和15.38%(P0.05)。iNOS蛋白變化與iNOS mRNA 變化一致。p-ERK在模型組中也表達提高，較對照組提高了 70.25%(P0.01)。p-ERK蛋白表達量總黃酮干預后較模型組分別下調 5.93 %和 13.59%(P0.01)。4討論NOS是NO生物合成的關鍵限速酶，用分子氧和還原型輔酶H (NADPH使 L-精氨酸轉化為L-胍氨酸，同時產生NO其家族分為2 類3種，包括內皮型合酶(eNOS)神經元型合酶(nNOS)和誘導型合酶 (iNOS)，內皮型合酶和神經元型合酶

24、統稱為結構型合酶 (cNOS),其產 生的生理濃度量的NQ參與神經信息傳遞、胃腸保護、免疫調節等 生理功能，而在炎性因子或微生物、理化刺激下，誘導型一氧化氮合 酶(iNOS)將在短時間內合成過量的 NQ NO與游離氧結合，生成強氧 化劑過氧亞硝酸陰離子(ONOO-，導致氧化應激7，8。桑枝總黃酮 呈劑量依賴性抑制NO穩定產物亞硝酸鹽含量，對炎癥損傷后的細胞 有保護作用，并無顯示細胞毒性，并能提咼細胞總抗氧化能力。C-對照組M-模型組100,200分別為：桑枝總黃酮100卩g/ml ,200卩 g/ml劑量組圖1桑枝總黃酮對誘導型合酶及炎癥介質基因水平的影 響C-對照組M-模型組100，200分

25、別為：桑枝總黃酮100卩g/ml， 200卩g/ml劑量組圖2桑枝總黃酮對iNOS和 p-ERK蛋白表達的影響絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs信號轉導途徑是細胞外信號引起細 胞核內反應的通道之一，可參與細胞的凋亡、分化及生長增殖等多種過程，包括細胞外信號調節激酶(extra cellular regulated protein kinases, ERK)、JNK、P38禾口 ERK5共 4條通路。炎癥反應時，內毒 素、促炎細胞因子及活性氧等能同時或順次激活MAPKS路，其中細胞外調節蛋白激酶包括 ERKl和ERK2磷酸化激活的ERKl/2由胞質 轉位到核內，進而介導NF-k B、Ap-1、c-f

26、os和c-Jun等的轉錄活化9。而NF-k B為調節iNOS COX2等炎癥介質的樞紐。在 COX2和 iNOS基因啟動子上游的5區域含NF-k B的結合位點10。iNOS和 COX-2在對照組中均低表達，受LPS和IFN- 丫誘導后高表達，以及經 桑枝總黃酮處理后同時下調，驗證了兩者的共同表達和協同致炎的關 系。HO/CO和 NOS/NOI有密切的聯系。NO的產生可誘導HO-1表達的 上調，而HO-1的上調是具有細胞保護，其產物膽紅素、鐵蛋白、CO起抗炎作用，且HO-1可通過ERK途徑下調iNOS,而達到降低NO產 量的效果11。桑枝總黃酮通過細胞內調節體系起作用，一方面下調iNOS和COX

27、-2表達，一方面上調HO-1表達，產生抑制致炎系統和上 調抗炎體系的雙向調節作用，使機體內環境恢復平衡。IL-1 B、TNF- a、IL-6在炎癥急性期都高表達，桑枝總黃酮能下調IL-1 B和IL-6的基因表達，但對TNF-a影響不大。綜上可知，桑枝總黃酮是桑枝抗炎活性組分之一， 其抗炎作用機 制是部分通過抑制MAPK/ER信號途徑中p-ERK的蛋白表達，從而抑 制iNOS COX-2靶基因及蛋白的表達，進而控制NO產量和氧化應激， 抑制致炎細胞因子表達的同時提高抗炎介質 HO-1表達而發揮抗炎效【參考文獻】1 國家藥典委員會.中國藥典，H部S.北京：化學工業出 版社,2005:210.2 劉

28、明月，牟英，李善福,等.桑枝95沱醇提取物抗炎作 用的試驗研究J.山西中醫學院學報，2003,4(2):13.3 王蓉,盧笑叢,王有為.桑枝提取物及抗炎作用研究J. 武漢植物學研究，2002,20(6):467.4 陳福君,林一星,許春泉,等.桑的藥理研究-桑葉桑枝桑白皮抗炎藥理作用的初步比較研究J.沈陽藥科大學學報，1995,64(3):222.5 Bryan NS, Bian K, Murad F. Discovery of the nitric oxide sig nali ng pathway and targets for drug developme ntJ.Fro nt Biosci, 2009, 1(14):1.6 Kleinert H, Pautz A, Linker K,