1、菟仙海蚣膠囊對腺嘌呤致大鼠睪丸生精細胞凋亡及Bcl-2、P53表達影響 【摘要】 目的 探討菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸生精細胞凋亡及Bcl-2、P53表達的影響。方法 建立腺嘌呤誘導致生精細胞損傷大鼠動物模型，用流式細胞儀檢測菟仙海蚣膠囊對該模型大鼠生精細胞的凋亡率及Bcl-2、P53蛋白表達，同時檢測大鼠睪丸、附睪指數及精子數量、精子活率。結果 菟仙海蚣膠囊可明顯抑制大鼠睪丸生精細胞凋亡，升高睪丸組織細胞Bcl-2的表達，降低P53的表達，提高附睪指數，增加精子數量和精子活率。結論 菟仙海蚣膠囊治療少精、弱精癥的作用機理可能與抑制生精細胞凋亡、上調睪丸組織細胞Bcl-2的表達和下調野

2、生型P53表達，并作用于附睪，提高附睪指數，促進精子發育成熟，增強其活力有關。 【關鍵詞】 菟仙海蚣膠囊；細胞凋亡；Bcl-2、P53；睪丸、附睪 新藥菟仙海蚣膠囊，源于我們治療少精、弱精男性不育癥的驗方，由菟絲子等五味藥物組成，經現代制藥工藝加工而成，臨床應用多年，療效顯著1，前期研究表明菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸組織形態學有顯著的保護作用，其機理與降低睪丸組織中NOS活性和NO含量有關2。本研究觀察了菟仙海蚣膠囊對腺嘌呤致大鼠睪丸生精細胞凋亡、Bcl-2、P53基因表達及睪丸、附睪指數和精子數量、精子活率的影響，以期進一步揭示其作用機理，為臨床應用提供科學依據。1 材 料 1.1

3、實驗動物 SD大鼠，SPF級，雄性，體重280-320g，由甘肅中醫學院科研實驗中心提供，動物實驗設施使用證SYXK(甘)2004-0006，實驗動物質量合格證號SCXK(甘)2004-0006；動物分籠飼養，食固體SPF級飼料，由北京市科奧協力飼料有限公司提供，合格證號：京動許字(2000)第015號。食水自由，室溫20-25，相對濕度45%-52%。 1.2 實驗藥物 菟仙海蚣膠囊：處方由菟絲子、仙靈脾等五味藥物按一定的比例組成。由蘭州中藥現代化工程技術中心及甘肅中醫學院科研實驗中心監制，規格0.35g/粒（3.21g生藥/g膠囊），實驗室時用生理鹽水配置成相應濃度的溶液。 五子衍宗丸：北

4、京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國藥準字Z11020188，批號2009324。 1.3 試劑及儀器 羧甲基纖維素鈉（河北省文安縣盛源纖維素廠，批號20090227）；腺嘌呤（洛陽德勝化工有限公司，批號20080911）；Bcl-2和P53流式細胞免疫熒光檢測試劑盒（Santa Cruz公司產品，由上海坤肯生物化工有限公司代理購進）；戊巴比妥鈉（中國醫藥集團上海化學試劑公司，批號：20030816）。碘化丙啶（PI）試劑盒、RNAse消化酶均由Sigma公司提供。流式細胞儀（XL，BECKMAN，U.S.A）；放射免疫計數器（CG-911，科大創新股份有限公司中佳分公司）；顯微鏡（BH-2，

5、日本OLYMPUS）；低速冷凍離心機(KDC-2044，科大創新股份有限公司中佳分公司)。2 方 法 2.1 動物分組及給藥 參考文獻方法3，3個月齡SD雄性大鼠，280-320g，72只，自由進食飲水，適應3-4d后，將其隨機分為6組，即空白對照組、模型組、陽性對照組（五子衍宗丸）組、菟仙海蚣膠囊組（小劑量組、中劑量組、大劑量組），每組12只。菟仙海蚣膠囊劑量按50kg成人常規劑量折算后作為中劑量組(2.7g生藥/kg體重)，高劑量組為中劑量組放大一倍(5.4g生藥/kg體重)，小劑量組為中劑量組縮小一倍(1.35g生藥/kg體重)，陽性對照組按1.2g/kg灌胃。空白組灌胃0.5%羧甲基纖

6、維素鈉1mL/100g，模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.5mL/100g，各給藥組按1mL/100g灌胃，40分鐘后各給藥組和模型組灌胃5%的腺嘌嘌呤混懸溶液0.5ml/100g（腺嘌呤溶液用0.5%羧甲基纖維素鈉配制，加熱情況下配制的混懸液濃度為5%）。各組均每天灌胃1次，連續40。 2.2 各組大鼠睪丸、附睪指數及精子數量、精子活率的變化 各組大鼠于末次給藥1h后稱重，用3%的戊巴比妥鈉45mg/kg麻醉，剖腹取兩側睪丸和附睪組織，稱重，計算睪丸和附睪指數；取一側附睪按照文獻4進行精子活率、精子計數觀察。 2.3 各組大鼠睪丸組織生精細胞凋亡率的檢測 取一側睪丸組織，PBS液沖洗干凈，

7、將組織煎碎，制成單細胞懸液，200目過濾網過濾。取單細胞懸液200l，逐滴加入的70%乙醇（預冷）500l固定，離心去除固定液，加PBS適量重懸5min，1500rmin離心5min，棄去PBS液，加入RNAse消化酶，37消化20min，200目過濾網過濾，加入PI染液1000l混合，于4避光保存30min，流式細胞儀檢測。 2.4 各組大鼠睪丸組織生精細胞Bcl-2和P53基因表達的檢測 以搓網法制備單細胞樣品，即將固定的標本生理鹽水沖洗后，將組織剪碎，放在搓網上用眼科鑷子輕搓組織，邊搓邊用鹽水沖洗，收集細胞懸液，500-800r/min離心沉淀2min，用生理鹽水離心洗滌2次，置入0-4

8、冰箱備檢，并以流式細胞儀免疫熒光標記法檢測樣品中抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因野生型P53的陽性表達，以上制備勻漿的過程于冰袋上進行。 2.5 統計學處理 采用SPSS13.0軟件統計，用t檢驗。計量資料以均數標準差(s)表示。3 結 果 3.1 各組大鼠一般情況的觀察 空白對照組大鼠精神體征正常，大鼠給與腺嘌呤溶液后出現明顯的腎陽虛癥狀，如精神萎靡，蜷臥、反應遲鈍、少動、進食減少、豎毛、瞇眼、眼瞼周圍浮腫、耳廓蒼白、多尿等類，且以上癥狀隨給藥天數的增加而加劇。菟仙海蚣膠囊大、小劑量組大鼠全身體征較單純模型組為輕。 3.2 各組大鼠睪丸、附睪指數及精子數量、精子活率的變化，結果，見表1。模型

9、組睪丸指數與空白組比較無顯著性差異（P0.05），附睪指數較空白組明顯降低（P0.01），精子活率和精子數量均明顯降低（P0.01）；菟仙海蚣膠囊各劑量組及陽性對照組睪丸指數無明顯變化，但可提高附睪指數（P0.01或P0.05）；菟仙海蚣膠囊各劑量組均可增加精子數量和精子活率（P0.01或P0.05）。 表1 各組大鼠睪丸、附睪指數及精子數量、精子活率的變化( s，n=12) 組別 劑量（g/kg） 睪丸指數（g/kg） 附睪指數（g/kg） 精子數量(109L-1) 精子活率(%) 正常對照組 - 0.650.036 0.280.022 20.591.77 92.92.9 模型對照組 0.2

10、5 0.620.038 0.200.021 12.651.53 72.76.5 五子衍宗組 1.20 0.610.025 0.250.027* 13.801.90 78.65.7* 菟仙海蚣大 5.40 0.630.028 0.290.019* * 19.631.83* * 90.06.8* * 菟仙海蚣中 2.70 0.630.041 0.270.032* * 16.892.11* * 89.75.3* * 菟仙海蚣小 1.35 0.620.027 0.260.028* 15.732.23* 78.46.1* 與空白組比較P0.05，P0.01，與模型組比較*P0.05，* *P0.01。

11、3.3 各組大鼠睪丸組織生精細胞凋亡率及Bcl-2和P53蛋白表達，結果，見表2。模型組睪丸生精細胞凋亡率明顯升高（P0.01），睪丸組織細胞bcl-2表達率明顯下降，P53表達率明顯升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P0.01）；菟仙海蚣膠囊各劑量組和五子衍宗組明顯降低睪丸生精細胞凋亡率，上調睪丸組織細胞Bcl-2的表達，下調P53表達，與模型組比較具有統計學意義（P0.01或P0.05）。 表2 各組大鼠睪丸生組織生精細胞凋亡率及Bcl-2、P53蛋白 表達( s，n=12) 組別 劑量 （g/kg） 凋亡率 (%) Bcl-2 （%） P53 （%） 正常對照組 - 9.064.33

12、75.877.96 20.821.85 模型對照組 0.25 21.787.59 66.215.72 30.702.50 五子衍宗組 1.20 15.174.12* 68.997.08* 29.963.16* * 菟仙海蚣大 5.40 9.153.75* * 74.753.58* * 20.583.05* * 菟仙海蚣中 2.70 10.250.68* 72.466.02* 23.232.52* 菟仙海蚣小 1.35 11.360.61* 67.435.93 29.432.06 與正常對照組比較P0.05，P0.01；與模型組比較*P0.05，* *P0.01；與五子衍宗組比較P0.05。4

13、討 論 男性少精、弱精癥病因復雜，而少精、弱精又是造成男性不育或生育力低下的重要原因，尤其是特發性的精子減少或特發性弱精子原因不明。祖國醫學認為：“腎藏精”，“主生殖”，腎之陰精是化生精液的物質基礎，其化生過程又賴腎陽的氣化作用，氣血條暢是腎之陰陽正常升降的前提。故腎虛精瘀是男性少精、弱精男性不育癥的重要病機，而溫腎益精，活血通精法則為其防治的基本治法。菟仙海蚣膠囊由菟絲子、蜈蚣等組成，組方嚴謹，藥少力專，功能溫腎益精，活血通精，使精出有源、精行通暢。研究表明，腺嘌呤可誘導腎陽虛型睪丸功能損害，抑制精子的發生、發育與成熟3。 細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是指在體內外諸多因素誘導下，由基因嚴格

14、調控而發生的自主性細胞有序死亡。在人體的正常生精過程中，也存在著生精細胞的凋亡，這是機體清除受損生精細胞、調節自身平衡的重要途徑。若生精細胞的凋亡超過了正常范圍，則可導致睪丸生精功能障礙而致不育5。生精細胞的凋亡受多種基因的調控。與凋亡相關的基因包括凋亡促進基因和凋亡抑制基因，野生型P53是凋亡促進基因，可誘導細胞凋亡，研究表明p53在性成熟前的睪丸中表達量非常高，在成年睪丸中，其水平則大大降低。Bcl-2則屬于凋亡抑制基因，過分表達Bcl-2的轉基因大鼠，會出現精原細胞增生，并且生精細胞凋亡的機會也減少6。本研究結果表明，菟仙海蚣膠囊治療少精、弱精癥的作用機理可能與抑制生精細胞凋亡、上調睪丸組織細胞Bcl-2的表達和下調野生型P53表達，并作用于附睪，提高附睪指數，促進精子發育成熟，增強其活力有關。 參考文獻 1 張銀川，徐瑛瑛，李蕊娜，等.菟仙海蚣膠囊治療少精、弱精癥的臨床觀察J.甘肅中醫，2010，23(4)：37-38. 2 張銀川，劉喜平.菟仙海蚣膠囊對生精細胞損傷大鼠睪丸生精功能保護作用研究.中醫研究，2011，24(2)：16-19. 3 楊阿民，李曰慶，李海松，等.補腎生精丸對腺嘌呤所致生精細胞損傷模型大鼠的干