1、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明23225蛋白質(zhì)化驗(yàn)試劑盒：為5 00試管或500 0微孔板得檢測(cè)提供充足得試劑 23227蛋白質(zhì)化驗(yàn)試劑盒：為2 50試管或2 5 0 0微孔板得檢測(cè)提供充足得試劑 試劑盒組分：BCA 試劑 A,10 0 0 mL （No、2322 5 產(chǎn)品中） 或 50 0mL （ N o、 23 2 27 產(chǎn)品中 ）, 碳酸鈉，碳酸氫鈉，二喹啉甲酸，酒石酸鈉溶于0、1 M氫氧化鈉中。BC A 試劑E ,25 mL, 包括4%硫酸銅一次性標(biāo)準(zhǔn)白蛋白，2mg/ mL ,10 X 1 mL 安瓿， 包含2 m g/ mL牛血清白蛋白（ BSA ） 存在于 0、 9% 鹽與0、 0

2、5%疊氮化鈉 中。儲(chǔ)存 ：以上試劑保持在室溫下儲(chǔ)存與裝運(yùn)注意：如果試劑 A 或 試劑 B 在低溫下運(yùn)輸或長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,可以通過(guò)緩慢加溫或輕輕攪拌溶液使沉淀物溶解。當(dāng)試劑變色或確定微生物污染時(shí)請(qǐng)丟球試劑盒。目錄介紹 、1準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)試劑與工作試劑 、2準(zhǔn)備試管 、3準(zhǔn)備微型版 、3故障檢修 、4有關(guān)美國(guó)熱電其她產(chǎn)品 、5附加信息 、5參考文獻(xiàn) 、6介紹美國(guó)熱電（T hermo）公司得BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 就是基于二喹啉甲酸（BCA ）通過(guò)比 色檢測(cè)與定量測(cè)定總蛋白得洗滌劑兼容配方。 該方法通過(guò)堿性介質(zhì)中得一種蛋白結(jié)合了 Cu2使其顯著減少轉(zhuǎn)變?yōu)?C u 1 （縮二脲反應(yīng)）。用一種含二奎

3、琳甲酸得試劑選擇性得比色法高敏 感得比色杯中得 Cu 1、這種測(cè)定方法得紫色色反應(yīng)產(chǎn)物就是通過(guò)BCA得兩個(gè)分子與亞銅離子螯合作用形成得。這種水溶性復(fù)合物在 562nm 處有強(qiáng)吸收峰。在大得活性范圍內(nèi)（2 0-20 0 0g / mL ）幾乎同蛋白濃度增加呈線性關(guān)系ECA法不就是真正得終點(diǎn)得方法 ；也就就是說(shuō) ,最終顏色繼續(xù)發(fā)展。孵化之后，繼續(xù)得顏色發(fā)展速度就是足夠慢以允許一起進(jìn)行測(cè)定大量樣本。大分子結(jié)構(gòu)得蛋白質(zhì)，肽鍵得數(shù)量與存在得四個(gè)特定氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸,色氨酸與酪氨酸）據(jù)說(shuō)就是與BC A形成顏色產(chǎn)物得原因.因此，蛋白濃度得測(cè)量通常要參照標(biāo)準(zhǔn)得一個(gè)常見(jiàn)得蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白.一系列已知

4、濃度得蛋白質(zhì)稀釋液就是為與之相近得未知蛋白質(zhì)濃度測(cè)定準(zhǔn)備得 因?yàn)槊恳粋€(gè)未知濃度得測(cè)定都需要基于標(biāo)準(zhǔn)曲線。 如果需要將一個(gè)未 知蛋白精確定量 ，選擇一個(gè)與未知蛋白特性相似得標(biāo)準(zhǔn)蛋白就是可取得。例如 ，當(dāng)測(cè)定免疫球 蛋白時(shí)牛血清丙種球蛋白可以被當(dāng)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白.以下給出了兩種檢測(cè)過(guò)程 ：其中 ，試管程序需要一個(gè)較大得體積（0、1毫升）得蛋白質(zhì)樣品。然而，因?yàn)樗褂昧艘粋€(gè)樣品比例為1:20得工作試劑（v / v）,所以將干擾物質(zhì)得影響降到最小。在酶處理 程序提供了一樣品處理酶 ，需要體積較小（1 0 -25丄）得蛋白質(zhì)樣品。然而，由于使用了樣 品比例為1:8得工作試劑（v / v），所以在克服干擾物質(zhì)濃

5、度時(shí)靈活性降低，從而獲得得檢測(cè)水平較低 .標(biāo)準(zhǔn)試劑與工作試劑得準(zhǔn)備（試驗(yàn)程序需要得兩個(gè)）A. 雅備稀釋得 BS A標(biāo)準(zhǔn)液表1為導(dǎo)向，準(zhǔn)備一套蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。稀釋標(biāo)準(zhǔn)得內(nèi)容為，將一個(gè)盛在安瓿管中得標(biāo)準(zhǔn) BSA稀釋 到幾個(gè)潔凈得瓶子中，最好使用與樣本（s）相同量得稀釋劑。根據(jù)表1得建議：每1毫升得 安 瓿管中加入2毫克/毫升得BSA標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)于準(zhǔn)備一系列得標(biāo)準(zhǔn)稀釋液就是足夠得。每個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)三次也就是足夠量得。表一:準(zhǔn)備稀釋得BS A標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)試管協(xié)議與微型版程序得稀釋方案（活性范圍=20 2 0 00用/ mL ）AvV 口呂號(hào)稀釋液體積（卩L）BS A來(lái)源及體積（卩L）BSA終濃度（吐/ mL ）

6、A03 00得原液2 0 00B125375得原液1 500C3 2 532 5得原液1000D1 7 5175得E管稀釋液7 5 0E3 25325得C管稀釋液5 0 0F3 25325得E管稀釋液2 50G32 532 5得F管稀釋液125H40010 0得G管稀釋液25I4 0000 =空白加強(qiáng)試管協(xié)議得稀釋方案（活性范圍=5250 %/ m L）AvV 口呂號(hào)稀釋液體積（1L）B SA來(lái)源及體積（LB SA終濃度（1L /mL ）A7 001 00得原液250B4004 00得A管稀釋液12 5C45 03 0 0得B管稀釋液50D4 004 0 0得C管稀釋液2 5E400100得D

7、管稀釋液5F40 000=空白B:準(zhǔn)備BC A得工作試劑（WR1、總共需要得W R得體積可以通過(guò)以下公式計(jì)算出來(lái)：（標(biāo)準(zhǔn)液+未知液）x （平行數(shù)目）X （每個(gè)樣品中加入得 WR體積）= 總共所需得 WR體積 例如：標(biāo)準(zhǔn)得試管程序有三個(gè)未知液，每個(gè)樣品做兩組重復(fù)：（標(biāo)準(zhǔn)液9mL+未知液3 mL ）x（平行數(shù)目2） x （2 m L ）=總共所需得 WR體積4 8 m L 注意:試管程序中每個(gè)樣品管加2、0m l WR微型版程序中每個(gè)樣品中只需要加2 00ul W R2、W R得制備：（BC A 試劑A : B=50:1 ），對(duì)上述樣品，將50 mL試劑 A與1 mL試劑B混 合。注意：當(dāng)試劑B加

8、入到試劑A得開始，濁度觀察表明：混合后迅速消失變成澄清得綠色得 WR. 準(zhǔn)備充足得W R就是基于所測(cè)樣品數(shù)量上得。如果將 WR儲(chǔ)存在處于室溫（R T ）得密閉容器 中，那么幾天之內(nèi)WR就是穩(wěn)定得。簡(jiǎn)要步驟（試管程序,標(biāo)準(zhǔn)方案）試管程序（樣品:WR = 1 ：20）1、 用移液管移取每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與所測(cè)樣品得重復(fù)O、lm I到有標(biāo)簽得對(duì)應(yīng)試管中。2、 ？在每個(gè)管中加2、0m 1得 WR，混勻。3、？封口，然后溫育試管（選擇時(shí)間與溫度）1 ）標(biāo)準(zhǔn)方案：37 C 3 0m i n （wo r king ra n ge=2 0 -2000u g / m I）2）RT 方案：R T 2 h （w o rk

9、i n g ran ge =20 2 000ug/ ml ）3）En h an c ed Prot oc o 1 （加強(qiáng)方案）：6 0 C 30m in （wo rki n g r a nge = 5-2 5 0ug / m 1 ）注意:每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都增加培育時(shí)間與溫度，增加5 6 2 n m得凈吸光度，降低試劑得最低檢測(cè)水平與方案得工作范圍；使用水浴加熱管要么就是標(biāo)準(zhǔn) （3 7 C培養(yǎng)）或就是增強(qiáng)（60 C 培養(yǎng)）協(xié)議。使用強(qiáng)制得 培養(yǎng)可能會(huì)因?yàn)闊醾鬟f不均勻使其在顏色變化上引進(jìn)明顯得誤差4、使所有管子冷卻至室溫5、分光光度計(jì)設(shè)定在 5 6 2n m，當(dāng)比色皿中裝得就是水時(shí)給儀器校零。隨后，確保

10、在10min內(nèi)測(cè)完所有樣品得吸光度。注意：因?yàn)锽C A測(cè)定不就是真正得終點(diǎn)，即使冷卻到室溫顏色還會(huì)繼續(xù)變化。然而，由于在室溫下顏色變化速度比較慢，所以如果在10mi n內(nèi)測(cè)完所有試管得吸光度就不會(huì)引進(jìn)明顯得誤差。6、 所有得單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與所測(cè)得樣品重復(fù)在5 6 2nm測(cè)得得吸光度都要減去在562n m測(cè)得得所有空白標(biāo)準(zhǔn)品得吸光度平均值。微型板程序（樣品：WR =1 : 8）1、用移液管移取25ul得WR到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品所在得微型板中（w o r k i n g r ange=2 0 2 OOOu g/ m 1）注意:如果樣品大小被限制為：每個(gè)未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)品只能使用 10ul（sampl

11、e t o WR rat i o=1: 2 0 ）、然而,被測(cè)量得w ork ing ra nge在這種情況下將被限制為 125 200 0 ug /m lo2、每個(gè)孔中加20 0 ul得WR，用pl at e shak e r混30 s,使其徹底混勻3、？封口 ,溫育 37 C 30 mi n4、冷卻到室溫5、用酶標(biāo)儀測(cè)量在5 6 2 nm或接近5 6 2 n m得讀數(shù)注意：1）這種方法中波長(zhǎng)在 540-590 n m得范圍內(nèi)都能被成功得測(cè)量2 ）因?yàn)樽x板器使用得光線長(zhǎng)度比分光光度計(jì)得比色皿要短，所以微型板程序需要使用樣品比例比較大得工作試劑去獲得與標(biāo)準(zhǔn)試管程序相同得靈敏度如果需要高于5 6

12、 2nm得測(cè)量，要將培養(yǎng)時(shí)間增加到2h、3 ）增加培養(yǎng)時(shí)間或樣品工作試劑得體積比率，增加每個(gè)w ell在562nm得凈測(cè)量值，降低實(shí)際得最低測(cè)量水平與測(cè)量得wor k ing ra nge。只要每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣與未知樣都被同等對(duì)待，這樣得修改也就是有益得.6、 所有得單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與所測(cè)得樣品重復(fù)在562 n m測(cè)得得吸光度都要減去在56 2 nm測(cè)得得所有空白標(biāo)準(zhǔn)品得吸光度平均值7、 準(zhǔn)備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)繪制每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)ES A在562nm測(cè)量得相對(duì)于空白對(duì)照得吸光度 平均值它u g/ml得濃度。使用標(biāo)曲去測(cè)量每一個(gè)未知樣品得蛋白質(zhì)濃度注意:如果聯(lián)系微型板讀數(shù)器使用擬合得曲線算法，一個(gè)有四個(gè)參數(shù)得或最合

13、適得曲線將提 供比純線性狀態(tài)更精確得結(jié)果。如果用手繪制這個(gè)結(jié)果，一個(gè)點(diǎn)-分曲線將比線性更加適合標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)。故障檢修問(wèn)題可能原因解決方案在任何管中都無(wú)顏色樣品包含銅螯合劑透析，脫鹽，或稀釋樣品。增加工作試劑中銅濃度（例如,使用,試劑A: B 50: 2）使用得產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)空白吸收就是可以得，但 就是標(biāo)準(zhǔn)與樣本比預(yù)期得顯示更少顏色強(qiáng)酸性或堿性緩沖 液改變了工作試劑得pH透析，脫鹽，或稀釋樣品。顏色在錯(cuò)誤波長(zhǎng)下 被測(cè)量確定在56 2 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度樣品得顏色比預(yù)期得深蛋白濃度太高稀釋樣品樣品包含脂質(zhì)或脂蛋白添加以減少脂質(zhì)干擾使用得產(chǎn)品23 215從樣品去除干擾物質(zhì)所有試管（包括空

14、白）都就 是暗紫色緩沖液中含有還原 劑透析或稀釋樣品。使用得產(chǎn)品23 2 15從樣品去除干擾物質(zhì)緩沖液中含有巰基緩沖含有生物胺（兒茶酚胺）需要在不同波長(zhǎng)下測(cè)量 顏色分光光度計(jì)或酶標(biāo) 儀沒(méi)有5 62 n m從5 4 0nm到590n m顏色可以在任何波長(zhǎng) 下被測(cè)量，雖然標(biāo)準(zhǔn)曲線得斜率與整體測(cè)濾光器量得靈敏度將減少A：干擾物質(zhì)某些物質(zhì)干擾 BCA檢測(cè)就是已知得，包括潛在得還原劑，螯合劑，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿。因?yàn)樗齻兛梢愿蓴_估算蛋白質(zhì)每分鐘濃度，作為樣品緩沖液得組份應(yīng)避免下列物質(zhì)：抗壞血酸E G TA鐵不純得蔗糖兒茶酚胺不純得甘油脂質(zhì)色氨酸肌酸酐過(guò)氧化氫蜜二糖酪氨酸半胱氨酸酰肼類苯酚磺酞尿酸其她物質(zhì)對(duì)BCA

15、法檢測(cè)蛋白量有較少程度得干擾.并且這些在原來(lái)得樣本中低于一定濃度只有很小得影響（可以容忍）許多物質(zhì)得最大兼容得濃度在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試管協(xié)議中被列出。表2（見(jiàn)說(shuō)明得最后一頁(yè)）。物質(zhì)就是兼容與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試管協(xié)議中指定得濃度，如果蛋白濃度得估計(jì)得誤差就是由物質(zhì)得存在所造成將會(huì)小于或等于10 %。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)之前，這些物質(zhì)都會(huì)用現(xiàn)配得 WR進(jìn)行測(cè)試空白校正得宰5 6 2 nm得吸光度測(cè)量值（1000/ m L白蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品+物質(zhì)）將會(huì)同0、9%生理鹽水中精確配制得標(biāo)準(zhǔn)品在562n m出得凈吸光度進(jìn)行比較。樣品:WR為1 : 8（v/v）得微孔板過(guò)程中最大兼容濃度將比較低。B、消除或減少干擾物質(zhì)影響得，策略BCA蛋

16、白含量測(cè)定中干擾物得影響可以用以下幾個(gè)方法消除或克服。通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾去除干擾物質(zhì)。稀釋樣品，直到不再有干擾。這種策略只在起始蛋白質(zhì)濃度足夠多余稀釋后仍在檢測(cè)活性范圍之內(nèi)就是有效得用丙酮酸或三氯乙酸（T C A）沉淀樣品中蛋白質(zhì)。 液體包含干擾物質(zhì)將被丟棄，蛋白沉淀很容易在超純水中溶解或直接用堿性BCA W R溶解。這一方案得詳細(xì)流程可從我們網(wǎng)站獲得另外，232 1 5號(hào)產(chǎn)品將被使用 （見(jiàn)相關(guān)Pierce產(chǎn)品）。適當(dāng)?shù)迷黾覹R中銅得量（準(zhǔn)備 WR試劑A: E為 50: 2 或5 0 : 3、）,這將減少銅螯合劑得干擾注意：為了最大限度得精確度，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品必須與樣品（s）同樣處理。有關(guān)美國(guó)熱

17、電其她產(chǎn)品1 5 04196 孔板1 0 0/ pk g150 7 5 試劑水庫(kù) 200 / p k g、1503696孔板密封帶 1 0 0 /p kg、23 2 09 標(biāo)準(zhǔn)白蛋白安瓿 2mg/ mL 10 x 1毫升安瓿，包含牛血清白蛋白23 2 08 預(yù)稀釋得蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品：牛血清白蛋白集合,7 X、5 m L23212牛伽瑪球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 2 m g/mL , 10 X1 mL安瓿2 3 2 35 微型BC A蛋白檢測(cè)試劑盒工作范圍為0、5 2 0/ m L23 2 36考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒，工作范圍得1 - 1 5 00呃/mL2 321 5 p a t Able ? 蛋白檢測(cè)試劑組2 3 25 0 BC A蛋白檢測(cè)試劑盒-兼容還原劑附加信息A。請(qǐng)?jiān)L問(wèn)我們得網(wǎng)站了解更多得信息，包括下列事項(xiàng)：常見(jiàn)問(wèn)答技術(shù)指導(dǎo)：消除樣品中干擾物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)得影響B(tài) 、替代總蛋白檢測(cè)試劑如果不能克服樣品中還原物或金屬螯合物得干擾。由一個(gè)減少物質(zhì)或 met a l c helat in g物質(zhì)包含在，試試美國(guó)熱電公司得23236號(hào)考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒，它對(duì)這些物質(zhì)較不敏 感。C、玻璃器皿得清潔與重利用 小心謹(jǐn)慎使用玻璃器皿 .所有得玻璃器皿必須清洗與最后得超純水沖洗。D、不同得蛋白質(zhì)得反應(yīng)特征 常用得總蛋白含量測(cè)定方法某種程度