1、第十四章 細胞工程 細胞工程（細胞工程（cell engineering）:也稱細胞技術。指也稱細胞技術。指 在細胞水平上，采用細胞生物學、發育生物學、遺在細胞水平上，采用細胞生物學、發育生物學、遺 傳學及分子生物學等學科的理論與方法，按照人們傳學及分子生物學等學科的理論與方法，按照人們 的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得具有產業化的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得具有產業化 價值的細胞相關產品的一門綜合技術體系價值的細胞相關產品的一門綜合技術體系. 廣義細胞工程廣義細胞工程 微生物細胞工程微生物細胞工程 植物細胞工程植物細胞工程 動物細胞工程動物細胞工程 第一節 主要相關技術 基因操作基因操

2、作 細胞的遺傳修飾細胞的遺傳修飾 細胞的表型分析細胞的表型分析 工程化細胞的應用工程化細胞的應用 1）微載體（）微載體（microcarrier） 基質材料：交聯葡聚糖基質材料：交聯葡聚糖 1g 交聯葡聚糖提供交聯葡聚糖提供 6000cm2 附著面積附著面積 l 微載體是大規模培養方法中最有使用價值的支持物。微載體是大規模培養方法中最有使用價值的支持物。 一、一、 動物細胞大規模培養技術動物細胞大規模培養技術 ( (一一) )基本策略基本策略 1.1.增加培養容積增加培養容積 2.2.增加細胞的附著面積增加細胞的附著面積 2）中空纖維（）中空纖維（hollow fiber） 管壁半透性，細胞附

3、于管外壁，管內可供培養液管壁半透性，細胞附于管外壁，管內可供培養液 通過。通過。 l 有利于分泌型表達蛋白的純化，但不易放大培養。有利于分泌型表達蛋白的純化，但不易放大培養。 3）微膠囊（）微膠囊（microcapsule） 半透性膜囊，細胞長于內壁。微囊顆粒需要自行半透性膜囊，細胞長于內壁。微囊顆粒需要自行 制備，無商業購買途徑。制備，無商業購買途徑。 l 細胞密度大、產物在單位體積中濃度高、分離純細胞密度大、產物在單位體積中濃度高、分離純 化簡單。化簡單。 3 3、抑制細胞的凋亡、抑制細胞的凋亡 在生產特定蛋白質（如疫苗、抗體等）的大規模細胞培在生產特定蛋白質（如疫苗、抗體等）的大規模細胞

4、培 養中宜用無血清培養：養中宜用無血清培養： p 避免血清中的蛋白質對目的蛋白純化的影響。避免血清中的蛋白質對目的蛋白純化的影響。 p 延長延長G1期或促使細胞停于期或促使細胞停于G0期，使細胞較長時間維持期，使細胞較長時間維持 在高密度狀態，利于產生更多目的產物。在高密度狀態，利于產生更多目的產物。 p 降低細胞死亡率，避免死亡細胞的蛋白酶釋放至培養降低細胞死亡率，避免死亡細胞的蛋白酶釋放至培養 基導致目的蛋白降解。基導致目的蛋白降解。 4 4、無血清培養：、無血清培養： 延長延長G1期，或促使細胞停于期，或促使細胞停于G0期，細胞活力正期，細胞活力正 常，可有效抑制凋亡。常，可有效抑制凋亡

5、。 （二）基本培養系統（二）基本培養系統 傳統懸浮培養系統：不銹鋼發酵罐（高度：直徑傳統懸浮培養系統：不銹鋼發酵罐（高度：直徑 =1：1 3：1）和攪拌器，產生氣泡易引起機械）和攪拌器，產生氣泡易引起機械 損傷。損傷。 旋轉細胞培養系統：模擬失重狀態，有效降低機旋轉細胞培養系統：模擬失重狀態，有效降低機 械損傷，應用面廣。械損傷，應用面廣。 1. 懸浮培養系統懸浮培養系統 2. 氣流驅動培養系統氣流驅動培養系統 主要優勢在于簡化設計，因為不需要攪拌器中的主要優勢在于簡化設計，因為不需要攪拌器中的 發動機和攪拌裝置。發動機和攪拌裝置。 3. 微載體培養系統微載體培養系統：微載體與攪拌懸浮培養相結

6、合的：微載體與攪拌懸浮培養相結合的 培養系統。培養系統。 4. 灌注培養系統灌注培養系統：能自動地將：能自動地將“舊舊”的培養液排除，的培養液排除， 同時自動地將新的培養液以相同速率補入到細胞生長同時自動地將新的培養液以相同速率補入到細胞生長 的容器中。的容器中。 細胞的基本生長特征：細胞的基本生長特征： （三）影響大規模細胞生長的因素：（三）影響大規模細胞生長的因素： 潛伏期潛伏期對數生長期對數生長期平臺期平臺期 優化大規模細胞培養的營養量化評估指標：優化大規模細胞培養的營養量化評估指標： 1）考慮細胞密度、生存能力、有絲分裂指數、一）考慮細胞密度、生存能力、有絲分裂指數、一 般形態及破碎數

7、量的信息；般形態及破碎數量的信息； 2）采用檢測生化指標來判斷。）采用檢測生化指標來判斷。 葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養液的質量葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養液的質量 情況；乳酸脫氫酶可以判斷細胞損傷或破碎情情況；乳酸脫氫酶可以判斷細胞損傷或破碎情 況。況。 利用顯微注射裝置，將一個細胞的核移植入另一利用顯微注射裝置，將一個細胞的核移植入另一 個去核細胞中，已得到重組細胞。是克隆的關鍵個去核細胞中，已得到重組細胞。是克隆的關鍵 技術。技術。 二、二、 細胞核移植（細胞核移植（nuclear transfer） （一）技術路線（一）技術路線 1. 細胞質的選擇：細胞質的選擇： 受精卵、處于

8、受精卵、處于M II期的卵母細胞，可以使植入細胞期的卵母細胞，可以使植入細胞 核的基因組行為發生重編程（核的基因組行為發生重編程（regrogramming），）， 從而去分化恢復全能性狀態。從而去分化恢復全能性狀態。 2. 供核細胞的選擇供核細胞的選擇： 胚胎細胞、未分化的原始生殖細胞、胚胎干細胞、胚胎細胞、未分化的原始生殖細胞、胚胎干細胞、 胎兒體細胞、成體體細胞。胎兒體細胞、成體體細胞。 分化程度分化程度 ，克隆效率，克隆效率 。 3. 去核：去核： （1）紫外線照射去核）紫外線照射去核 通過破壞通過破壞DNA去核。損傷較大，基本棄用。去核。損傷較大，基本棄用。 （2）盲吸法去核）盲吸法

9、去核 依據依據M II期卵母細胞中第一極體與細胞核的期卵母細胞中第一極體與細胞核的 對位關系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質，對位關系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質， 成功率約成功率約80%。 （3）蔗糖高滲處理去核法）蔗糖高滲處理去核法 先經高滲蔗糖（先經高滲蔗糖（0.30.9mol/L）處理，使核）處理，使核 微凸，以去核針去除。微凸，以去核針去除。 （4）透明帶打孔去核法）透明帶打孔去核法 先以顯微針在透明帶打孔，以細胞松弛素處先以顯微針在透明帶打孔，以細胞松弛素處 理后去核，提高卵母細胞存活率。理后去核，提高卵母細胞存活率。 （5）超速離心法）超速離心法 4. 重構胚的構建：重構

10、胚的構建： 直接將供核細胞移植到直接將供核細胞移植到 M II 期卵母細胞期卵母細胞/受精卵透明帶下受精卵透明帶下 ，經細胞融合實現重組，經細胞融合實現重組已已 應用于多種家畜。應用于多種家畜。 取供核細胞核直接注入已去取供核細胞核直接注入已去 核的受體細胞質核的受體細胞質多用于克多用于克 隆小鼠。隆小鼠。 5. 重構胚的激活重構胚的激活 （1）化學激活）化學激活 （2）電激活）電激活 p 處理后能夠卵裂則表明激活成功。處理后能夠卵裂則表明激活成功。 6. 重構胚的培養與移植重構胚的培養與移植 培養發育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。培養發育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。 （二）不同供核

11、細胞的核移植（二）不同供核細胞的核移植 1. 胚胎細胞核移植：胚胎細胞核移植： 童第周（童第周（1902-1979） 中國的中國的“克隆先驅克隆先驅” Megan & Morag from English 目前核移植已成功：兩棲類、魚類、昆蟲、哺乳動物目前核移植已成功：兩棲類、魚類、昆蟲、哺乳動物 目前核移植未成功：爬行類、鳥類目前核移植未成功：爬行類、鳥類 2. 體細胞核移植：體細胞核移植： 1962，非洲爪蟾，非洲爪蟾 Dolly，1997， Roslin Institute 體細胞核移植的成功，證明高度分化的成體細胞體細胞核移植的成功，證明高度分化的成體細胞 核仍具發育全能性，能在成熟卵

12、母細胞中實現重核仍具發育全能性，能在成熟卵母細胞中實現重 編程，發育為完整個體。編程，發育為完整個體。 M II 期的卵母細胞中含大量期的卵母細胞中含大量MPF，可誘導供體核，可誘導供體核 發生一系列早熟變化，尤其易使發生一系列早熟變化，尤其易使S期細胞核出現期細胞核出現 染色體異常，對染色體異常，對G1期染色體損害較小。期染色體損害較小。 選取選取G0或或G1期細胞為核供體，選期細胞為核供體，選MPF水平低時水平低時 的卵母細胞為受體。的卵母細胞為受體。 三、三、 基因轉移基因轉移 目的基因需通過特目的基因需通過特 定載體（如質粒、定載體（如質粒、 病毒載體等）攜帶病毒載體等）攜帶 進入細胞

13、。進入細胞。 （1）電穿孔法）電穿孔法：以脈沖電場使細胞膜產生細小空：以脈沖電場使細胞膜產生細小空 洞，使外源洞，使外源DNA進入細胞質。進入細胞質。 （2）顯微注射法）顯微注射法：將：將DNA直接注入細胞，多用于直接注入細胞，多用于 制備轉基因動物。制備轉基因動物。 優點優點：不含病毒基因組片段：不含病毒基因組片段 缺點缺點：基因隨機整合于染色體，易導致受體細胞：基因隨機整合于染色體，易導致受體細胞 基因滅活或轉化基因不表達。基因滅活或轉化基因不表達。 1. 物理轉化法物理轉化法 2. 化學轉化法化學轉化法 （1）脂質體包埋法）脂質體包埋法 脂質體包裹脂質體包裹DNA，通過與受體細胞膜融合使

14、，通過與受體細胞膜融合使 DNA片段進入細胞。片段進入細胞。 （2）磷酸鈣共沉淀法）磷酸鈣共沉淀法 DNA與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細胞表與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細胞表 面，通過胞飲作用進入細胞。面，通過胞飲作用進入細胞。 （3）DEAE-葡聚糖吸附法葡聚糖吸附法 通過病毒感染的方式導入外源基因。通過病毒感染的方式導入外源基因。 病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉入細病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉入細 胞，無法產生包裝的病毒顆粒。胞，無法產生包裝的病毒顆粒。 常用：腺病毒載體、逆轉錄病毒載體。常用：腺病毒載體、逆轉錄病毒載體。 3. 生物學方法生物學方法 第二節 動物細胞

15、工程的應用 一一. 醫用蛋白質的生產醫用蛋白質的生產 1. 單克隆抗體單克隆抗體 一種一種B淋巴細胞能接受一種抗原決定簇的刺激，淋巴細胞能接受一種抗原決定簇的刺激， 分化繁殖成為可分泌相應抗體的克隆系。大量分化繁殖成為可分泌相應抗體的克隆系。大量B 淋巴細胞可分泌出識別許多抗原決定簇的抗體。淋巴細胞可分泌出識別許多抗原決定簇的抗體。 單克隆抗體單克隆抗體：來源于單個：來源于單個B淋巴細胞的抗體，只能淋巴細胞的抗體，只能 識別一種特定抗原決定簇。識別一種特定抗原決定簇。 單克隆抗體制備技術（單克隆抗體制備技術（B 淋巴細胞雜交瘤技術）淋巴細胞雜交瘤技術） ：將骨髓瘤細胞與：將骨髓瘤細胞與B淋巴細

16、胞融合形成雜交瘤細淋巴細胞融合形成雜交瘤細 胞，用于制備單克隆抗體。胞，用于制備單克隆抗體。 所獲得的雜交瘤細胞既具有腫瘤細胞所獲得的雜交瘤細胞既具有腫瘤細胞無限生長無限生長的的 特性，又具有特性，又具有B淋巴細胞淋巴細胞分泌抗體分泌抗體的能力。的能力。 單克隆抗體的優點：單克隆抗體的優點：專一性、均質性、靈敏性專一性、均質性、靈敏性以以 及及無限量制備無限量制備的可能性。的可能性。 單克隆抗體的制備過程單克隆抗體的制備過程 應用價值：應用價值： 作為體外診斷試劑。作為體外診斷試劑。 作為體內診斷試劑，作為體內診斷試劑， 用作腫瘤定位等。用作腫瘤定位等。 作為導向藥物的載體作為導向藥物的載體

17、：單克隆抗體上連接：單克隆抗體上連接 抗癌藥物等抗癌藥物等,特異地治特異地治 療癌癥等疾病。療癌癥等疾病。 -生物導彈生物導彈 p 由于微生物缺乏蛋白質翻譯后的加工修飾系統，由于微生物缺乏蛋白質翻譯后的加工修飾系統， 因此許多復雜人體蛋白必須用真核動物細胞表達。因此許多復雜人體蛋白必須用真核動物細胞表達。 如：如： 溶血栓藥物溶血栓藥物-組織型纖溶酶原激活劑組織型纖溶酶原激活劑（tPA） 血友病藥物血友病藥物凝血因子凝血因子 VIII 促紅細胞生成素促紅細胞生成素治療腫瘤化療或腎臟疾病導致的治療腫瘤化療或腎臟疾病導致的 紅細胞減少癥紅細胞減少癥 2. 復雜人體蛋白質復雜人體蛋白質 二二. 基因

18、工程動物的產生基因工程動物的產生 基因工程動物基因工程動物 轉基因動物轉基因動物 （transgenic animal） 基因剔除動物基因剔除動物 （gene knockout animal） 1、疾病動物模型、疾病動物模型 目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類疾病目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類疾病 的有利工具。的有利工具。 2、動物生物反應器（、動物生物反應器（bioreactor） 主要用于生產目的蛋白質，如：乳腺生物反應器主要用于生產目的蛋白質，如：乳腺生物反應器 3、人類移植用器官、人類移植用器官 通過遺傳改造減少排斥。通過遺傳改造減少排斥。 三三. 基于細胞的組織工程基于細胞的組織工程 組織工程皮膚組織工程皮膚 組織工程膀胱組織工程膀胱 將體外培養的功能細胞植入患者體內，以代償將體外培養的功能細胞植入患者體內，以代償 病變細胞所喪失的功能。病變細胞所