1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)生物化學(xué)教研室前 言21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì),生物化學(xué)與分子生物學(xué)是當(dāng)代生命科學(xué)領(lǐng)域中一門重要的基礎(chǔ)學(xué)科,它涵蓋的基礎(chǔ)理論,基本知識(shí),基本技術(shù)與醫(yī)學(xué)研究各學(xué)科領(lǐng)域密切相關(guān),其理論與技術(shù)的發(fā)展,推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展,對(duì)人類的科技進(jìn)步與文明產(chǎn)生巨大影響。 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)院校學(xué)生必修的一門基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程，其研究技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用是依據(jù)物理學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)的基本理論和實(shí)驗(yàn)方法而建立起來(lái)的。20世紀(jì)20年代微量分析的發(fā)展，30年代電子顯微鏡的出現(xiàn)，40年代層析技術(shù)和電泳技術(shù)的興起，以及同位素示蹤技術(shù)、各種光譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)的應(yīng)用，激光、超導(dǎo)等新技術(shù)的出現(xiàn)，電子計(jì)算機(jī)技術(shù)的突飛猛進(jìn)

2、，使生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)手段提高到一個(gè)嶄新的水平，掌握生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和研究技術(shù)，對(duì)醫(yī)學(xué)院校學(xué)生來(lái)說(shuō)是十分重要的。 本門課程主要側(cè)重于給學(xué)生以基本的實(shí)驗(yàn)方法和技能的訓(xùn)練，讓學(xué)生了解并掌握生物化學(xué)的四大基本實(shí)驗(yàn)方法，即：分光光度法、離心法、層析法和電泳法。同時(shí)也注意引進(jìn)一些新近發(fā)展起來(lái)的、重要的生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究技術(shù)，作為學(xué)生學(xué)習(xí)其他專業(yè)課程和進(jìn)入科學(xué)研究領(lǐng)域的準(zhǔn)備。 由于編者水平有限，教材中可能有一些錯(cuò)誤和不足，望同行專家和使用者提出寶貴意見。 編 者 2012.03目 錄第一章 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與操作 .5第一節(jié) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本 .5第二節(jié) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作 .8第二章 分光光度技術(shù)

3、 .25 實(shí)驗(yàn)一 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 .39實(shí)驗(yàn)二 folin-酚試劑法(lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 .41實(shí)驗(yàn)三 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度.43實(shí)驗(yàn)四 考馬斯(comessie)亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 .45實(shí)驗(yàn)五 bca法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 .48實(shí)驗(yàn)六 激素對(duì)血糖濃度的影響及血糖的測(cè)定 .50實(shí)驗(yàn)七 堿性磷酸酶(akp)米氏常數(shù)(km)的測(cè)定和底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 .57第三章 生物大分子的提取、沉淀和離心分離技術(shù).61第一節(jié) 生物材料的選取與預(yù)處理 . .61第二節(jié) 生物大分子的沉淀分離技術(shù) .66第三節(jié) 生物大分子離心分離技術(shù) .69實(shí)驗(yàn)八 雞血sod的提取、分離及活

4、力測(cè)定 .76實(shí)驗(yàn)九 堿性磷酸酶的制備及活力測(cè)定.79實(shí)驗(yàn)十 酪蛋白的制備 .83實(shí)驗(yàn)十一 細(xì)胞核蛋白質(zhì)的提取 85實(shí)驗(yàn)十二 動(dòng)物肝臟中提取dna 88實(shí)驗(yàn)十三 豬心肌細(xì)胞線粒體可溶性atp合酶的提純 91第四章 電泳技術(shù) .96實(shí)驗(yàn)十四 dna瓊脂糖凝膠電泳 . 105實(shí)驗(yàn)十五 血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳 .109實(shí)驗(yàn)十六 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶 .113實(shí)驗(yàn)十七 蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定sds-聚丙烯凝膠電泳 .120實(shí)驗(yàn)十八 聚丙烯酰胺等電聚焦電泳 .123實(shí)驗(yàn)十九 醋酸纖維素薄膜對(duì)血清蛋白質(zhì)的電泳 129實(shí)驗(yàn)二十 雙向電泳 131實(shí)驗(yàn)二十一 垂直板sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

5、血清脂蛋白蛋白質(zhì)143第五章 層析技術(shù) .147第一節(jié) 層析技術(shù)概述 .147第二節(jié) 吸附層析 .148第三節(jié) 分配層析 .150第四節(jié) 離子交換層析 .152第五節(jié) 凝膠層析 . .155第六節(jié) 親和層析 .159第七節(jié) 高效液相層析 .160實(shí)驗(yàn)二十二 氨基酸的紙上層析與氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用162實(shí)驗(yàn)二十三 血清-球蛋白的分離純化與鑒定 .165實(shí)驗(yàn)二十四 親和層析純化胰蛋白酶 .170實(shí)驗(yàn)二十五 離子交換層析分離氨基酸.174實(shí)驗(yàn)二十六 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定凝膠過(guò)濾層析法177第六章 分子生物學(xué)基本技術(shù) .181第一節(jié) 核酸分子雜交 .181第二節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng). .185第三節(jié) 分子克隆 .

6、189實(shí)驗(yàn)二十七 限制性內(nèi)切酶消化dna分子 193實(shí)驗(yàn)二十八核糖核酸（rna）的提取 195實(shí)驗(yàn)二十九 southern雜交分析 .198實(shí)驗(yàn)三十 northern雜交分析 .203實(shí)驗(yàn)三十一 pcr基因擴(kuò)增 .206實(shí)驗(yàn)三十二 rt-pcr擴(kuò)增目的基因cdna 209實(shí)驗(yàn)三十三 瓊脂糖凝膠中dna片段的回收 211實(shí)驗(yàn)三十四 質(zhì)粒dna的提取及酶切 . .213實(shí)驗(yàn)三十五 質(zhì)粒載體和外源dna的連接反應(yīng) 217實(shí)驗(yàn)三十六 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 219實(shí)驗(yàn)三十七 克隆的篩選和快速鑒定 222附錄一 常用緩沖液的配制方法.224附錄二 易變質(zhì)及需要特殊方法保存的試劑 . 235附錄三

7、 一般化學(xué)試劑的分級(jí) .236附錄四 english words in the lab .237第一章 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)與操作第一節(jié) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)一、實(shí)驗(yàn)課目的與要求（一）實(shí)驗(yàn)課目的1加深對(duì)生物化學(xué)基本理論的理解和掌握。2掌握生物化學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和思維能力以及獨(dú)立分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。（二）實(shí)驗(yàn)課要求 1實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃怼㈩A(yù)期的結(jié)果，操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。 2實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)肅認(rèn)真專心進(jìn)行操作，注意觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，結(jié)果不良時(shí)，必須重做。 3實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)及時(shí)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果如實(shí)記錄下來(lái)，并請(qǐng)老師當(dāng)場(chǎng)審核

8、。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析，按時(shí)將實(shí)驗(yàn)報(bào)告交教師評(píng)閱。二、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 1嚴(yán)肅、認(rèn)真、積極、主動(dòng)地上好實(shí)驗(yàn)課。進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)要穿戴好隔離衣，不得穿拖鞋、背心出入實(shí)驗(yàn)室，以免酸堿腐蝕皮膚。 2進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、課本、筆記、實(shí)驗(yàn)記錄本、報(bào)告本、文具等。3要保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)整潔，試劑、儀器應(yīng)整齊,按次序放置。實(shí)驗(yàn)完畢要按各類儀器的清洗方法和要求將儀器清洗干凈。 4實(shí)驗(yàn)室是培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、獨(dú)立工作能力及良好科學(xué)作風(fēng)的重要場(chǎng)所，操作務(wù)必認(rèn)真不得敷衍，室內(nèi)應(yīng)保持肅靜，不得吸煙、玩鬧 ，不得隨地吐痰，亂丟紙屑。實(shí)驗(yàn)后要清掃實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、地面、試劑瓶要碼放整齊。5要愛護(hù)儀器、節(jié)約藥品。第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)要按儀器清單清點(diǎn)儀

9、器，負(fù)責(zé)保管，用后如數(shù)交還,在使用時(shí)如有破損，及時(shí)報(bào)告，經(jīng)指導(dǎo)教師檢查后填寫破損單，按學(xué)校規(guī)定賠償。6貴重儀器，如分光光度計(jì)、離心機(jī)等，要盡力愛護(hù)，使用前應(yīng)熟悉使用方法，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，嚴(yán)禁隨意開動(dòng)。 7要節(jié)約水電，一經(jīng)用完隨手關(guān)閉水門、電門。三、值日生任務(wù)1領(lǐng)發(fā)本次所用儀器、物品，清點(diǎn)、交還臨時(shí)用儀器、物品，若有損壞負(fù)責(zé)追查賠償。 2管理操作公用儀器，打蒸餾水。 3搞好實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，做到儀器、桌面、地面、水池全干凈。 4確保安全：管好儀器、門窗、水電。 5請(qǐng)任課及實(shí)驗(yàn)室老師檢查工作，認(rèn)可后方能離開實(shí)驗(yàn)室。四、試劑使用規(guī)則 1使用試劑前應(yīng)仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需要。2取出

10、試劑后，立即將瓶塞蓋好，切勿蓋錯(cuò)，放回原處。試劑瓶塞、專用吸量管、滴管，不得與試劑瓶分家，以免錯(cuò)用而污染試劑，造成自己或他人實(shí)驗(yàn)的失敗。未用完的試劑不得倒回瓶?jī)?nèi)。昂貴的sephadex、sepharose凝膠和deae纖維素等，用后必須及時(shí)回收，不得丟棄。 3使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使試劑流入橡皮帽內(nèi)。 4使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒量取，若用吸管時(shí)只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 五、廢棄物處理 1所有固體廢棄物如：用過(guò)的濾紙、棉花、碎屑沉淀物和電泳后的凝膠等必須傾棄于垃圾筒中。 2濃酸必須棄于小缽中，用水稀釋后倒入水池中。六、安全注意事項(xiàng) 1低沸點(diǎn)有機(jī)

11、溶劑，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用時(shí)應(yīng)禁明火、遠(yuǎn)離火源，若需加熱要用水浴加熱，不可直接在火上加熱。 2. 若發(fā)生酸堿灼傷事故，先用大量自來(lái)水清洗，酸灼傷者用飽和nahc03溶液中和，堿灼傷者用飽和h3b03溶液中和，氧化劑傷害者用na2s204處理。 3若發(fā)生起火事件，根據(jù)發(fā)生起火性質(zhì)分別采用砂、水、c02或ccl4滅火器撲滅。 4離開實(shí)驗(yàn)室必須關(guān)好窗戶，切斷電源、水源，以確保安全。七、實(shí)驗(yàn)室意外事故的處理實(shí)驗(yàn)室如遇著火、燙傷、割傷等意外事件發(fā)生，必須鎮(zhèn)靜，作緊急處理，并立即報(bào)告教員，作如下處理：1、著火：如酒精燈推倒或其他原因起火，首先將一切易燃物品移至安全處，然后將火撲滅。滅火

12、方法：可用濕布或工作服蓋上撲滅，或蓋上一層沙撲滅。如乙醚、油類等比水輕易燃的物品著火時(shí)，切勿用水，火勢(shì)大時(shí)速取滅火器滅之。2、火傷：皮膚被火灼傷，用燙傷軟膏涂之，如傷勢(shì)較重，即送醫(yī)院。3、藥品傷：皮膚被藥品所侵蝕，應(yīng)據(jù)藥品的性質(zhì)加以適當(dāng)處理后，用單寧油膏或凡士林涂之，如是酸或堿，則先用大量水沖洗，然后用5%的小蘇打液或1%醋酸分別處理。如眼睛為藥品所侵入，用水洗去后，繼以5%的小蘇打液或1%的硼酸液沖洗，視侵入藥品的性質(zhì)而定。必要時(shí)，去醫(yī)院處理。4、割傷出血：凡遇到玻璃割傷出血，可用碘酒或紅藥水消毒后（切忌碘酒與紅藥水同時(shí)應(yīng)用），用紗布包扎。如有玻璃留在傷口，應(yīng)先取出再作處理。5、毒物入口：有

13、毒之物切勿用吸管直接用口吸取。如遇毒物入口，除酸、堿外，應(yīng)先使之嘔吐，用芥子粉或0.06克吐酒石溶于2毫升水中作致吐劑，溫鹽水肥皂水也可用。如是腐蝕性物質(zhì)，則飲以雞蛋清作潤(rùn)滑劑。第二節(jié) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作一、玻璃儀器的清潔及使用（一）玻璃儀器的清潔1玻璃儀器的清洗實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，往往由于儀器的不清潔或被污染而造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。 做生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)玻璃儀器清潔程度的要求，比一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求更高。這是因?yàn)椋荷锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”計(jì)的，稍有雜質(zhì)，影響就很大。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)許多常見的污染雜質(zhì)十分敏感，

14、如金屬離子（鈣、鎂離子等）、去污劑和有機(jī)物殘基等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）是否徹底清洗凈就是非常重要的。 新購(gòu)玻璃儀器的清洗 新購(gòu)買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在12鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在100120烘箱內(nèi)烘干備用。 使用過(guò)的玻璃儀器的清洗一般非計(jì)量玻璃儀器或粗容量?jī)x器：如試管、燒杯、量筒等普通玻璃儀器，可直接用毛刷蘸餐洗凈刷洗，然后用自來(lái)水沖洗，直至器壁內(nèi)外既不聚成水滴也不成股流下即可。最后用少量蒸餾水沖洗內(nèi)壁23次，倒置晾干即可。容量分析儀器：容量瓶、滴定管及吸管等

15、容量?jī)x器，用后用自來(lái)水多次沖洗，如能清潔（壁不掛水珠），再用蒸餾水少量沖洗23次晾干即可備用。若仍不干凈附有油污等，則須于干后放入鉻酸洗液內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，然后倒凈（或撈出）洗液，用自來(lái)水充分沖洗至水不顯黃色后再?zèng)_幾次，最后用少量蒸餾水沖洗23次晾干備用。 比色皿的清洗決不可用強(qiáng)堿清洗，因?yàn)閺?qiáng)堿會(huì)浸蝕拋光的比色皿。只能用洗液或12的去污劑浸泡，然后用自來(lái)水沖洗，這時(shí)使用一支綢布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果會(huì)更好，清洗干凈的比色皿也應(yīng)器壁內(nèi)外既不聚成水滴也不成股流下。切忌用刷子、粗糙的布或?yàn)V紙等擦試。洗凈后，倒置晾干備用。2塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已用的越來(lái)

16、越多。第一次使用塑料器皿時(shí)，可先用8mol/l尿素（用濃鹽酸調(diào)ph = 1）清洗，接著依次用無(wú)離子水、1 mol/l koh和無(wú)離子水清洗，然后用103 mol/l edta 除去金屬離子的污染，最后用無(wú)離子水徹底清洗，以后每次使用時(shí)，可只用0.5的去污劑清洗，然后用自來(lái)水和無(wú)離子水洗凈即可。3洗液的配制因己確定鉻有致癌作用，因此配制和使用洗液時(shí)要極為小心，常用兩種配制方法如下： 取100ml 工業(yè)濃硫酸置于燒杯內(nèi)，小心加熱，然后慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解并緩慢冷卻后，貯存在磨口玻璃塞的細(xì)口瓶?jī)?nèi)。 稱取5g重鉻酸鉀粉末，置于250ml 燒杯中，加5ml 水使其溶解，然后慢

17、慢加入100ml 濃硫酸，溶液溫度將達(dá)80，待其冷卻后貯存于磨口玻璃瓶?jī)?nèi)。 4其他洗滌液 工業(yè)濃鹽酸：可洗去水垢或某些無(wú)機(jī)鹽沉淀。 5草酸溶液：用數(shù)滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。 510磷酸三鈉（na3po412h2o）溶液：可洗滌油污物。 30硝酸溶液：洗滌二氧化碳測(cè)定儀及微量滴管。 510乙二胺四乙酸二鈉（edta-na2）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內(nèi)壁的白色沉淀物。 尿素洗滌液：為蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛過(guò)蛋白質(zhì)制劑及血樣的容器。 有機(jī)溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。 氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種

18、強(qiáng)堿性的洗滌液，對(duì)玻璃儀器的侵蝕性很強(qiáng)，可清除容器內(nèi)壁污垢，洗滌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，使用時(shí)應(yīng)小心慎重。5玻璃和塑料器皿的干燥：生化實(shí)驗(yàn)中用到的玻璃和塑料器皿經(jīng)常需要干燥，一般地說(shuō)洗凈后的玻璃儀器，如不急用應(yīng)倒放在晾架上令其自然干燥。若有急用可放在烘烤箱中110120烤干，但容量玻璃儀器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及燒結(jié)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的玻璃儀器等，嚴(yán)禁烘烤。此類儀器，如急用可采用水泵抽氣法干燥。硝酸纖維素的塑料離心管加熱時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸，所以決不能放在烘箱中干燥，只能用冷風(fēng)吹干。（二）常用玻璃儀器的使用1、吸量管吸量管是生化實(shí)驗(yàn)最常用的儀器之一，測(cè)定的準(zhǔn)確度和吸量管的正確選擇和使用有密切關(guān)系。常用的吸量管可以

19、分為三類： 刻度吸量管 刻度吸量管是多刻度吸量管，供量取10ml以下任意體積的溶液，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0毫升等規(guī)格。吸量管刻度所標(biāo)的數(shù)字有自上而下和自下而上兩種，使用之前應(yīng)仔細(xì)分辨。有“快”字則為快流式，有“吹”字則為吹出式，無(wú)“吹”字的吸管不可將管尖的殘留液吹出。吸、放溶液前要用吸水紙擦拭管尖。 移液管 常用來(lái)量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液體，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，管尖需在盛器內(nèi)壁停留15秒鐘，注意管尖殘留液體不要吹出。 奧氏吸量管 在量取粘度較大的液體如血液、血清等時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用奧氏吸管。這種

20、吸管也是單標(biāo)的，并且在其下端有一個(gè)膨大部分。所以液體與吸管表面接觸面積較小，當(dāng)量取血液時(shí)，較他種吸管準(zhǔn)確。奧氏吸管的容量包括遺留在尖端的液體，故在緩緩使液體流出后，再停留數(shù)秒鐘，吹出最后一滴。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中常用的有0.5、1.0、2.0、3.0ml等規(guī)格。 圖1-1 三類吸量管簡(jiǎn)圖l、2 刻度吸量管 3奧氏吸量管 4移液管【吸量管的使用】(1) 選用原則 準(zhǔn)確量取整數(shù)量液體，應(yīng)選用奧氏吸量管。量取大體積時(shí)要用移液管。量取任意體積的液體時(shí)，應(yīng)選用取液量最接近的吸量管。如欲取0.15ml液體，應(yīng)選用0.2ml的刻度吸量管。同一定量試驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同管中，并且取量不同時(shí)，應(yīng)選擇一支與最大取液

21、量接近的刻度吸量管。如各試管應(yīng)加的試劑量為0.30、0.50、0.70、0.90ml時(shí)，應(yīng)選用一支1.0ml刻度吸量管。(2) 吸量管的使用執(zhí)管：將中指和拇指拿住吸量管上口以食指控制流速;刻度數(shù)字應(yīng)朝向操作者。取液：把吸量管插入液體內(nèi)(切忌懸空，以免液體吸入洗耳球內(nèi))，用洗耳球吸取液體至所取液量的刻度上端1-2cm處，然后迅速用食指按緊吸量管上口，使管內(nèi)液體不再流出。調(diào)準(zhǔn)刻度：將已吸足液體的吸量管提出液面，用濾紙片抹干管尖外壁液體，然后垂直提起吸量管于供器內(nèi)口(管尖懸離供器內(nèi)液面)。 用食指控制液流至所需刻度，此時(shí)液體凹面、視線和刻度應(yīng)在同一水平面上，并立即按緊吸量管上口。 放液：放松食指，讓

22、液體自然流入受器內(nèi)，(如移液管標(biāo)有“吹”字，則應(yīng)將管口殘余液滴吹入受器內(nèi))此時(shí)，管尖應(yīng)接觸受器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入受器內(nèi)的原有液體之中，以免污染吸量管及試劑。洗滌：吸取血液、尿、組織樣品及粘稠試劑的吸量管，用后應(yīng)及時(shí)用自來(lái)水沖洗干凈。如果吸取一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實(shí)驗(yàn)完畢后，用自來(lái)水沖洗干凈。晾干水分，再浸泡于鉻酸洗液中，數(shù)小時(shí)后，再用流水沖凈，最后用蒸餾水沖洗。晾干備用。 圖l-2 放液體時(shí)的姿勢(shì) 2微量移液器微量移液器在生化實(shí)驗(yàn)中大量地使用，它們主要用于多次重復(fù)的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有10ml、100 ml和1000

23、ml等多種規(guī)格。另一種是可調(diào)容量的移液器，常用的有100ml 、200ml、500ml和 1000ml等幾種。每種移液器都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是一次性使用，當(dāng)然也可以清洗后重復(fù)使用，而且此種吸頭還可以進(jìn)行120高壓滅菌。 微量移液器的結(jié)構(gòu)見圖l-3，液體吸收鈕。體積選取鈕。體積顯示。槍頭排放鈕。槍頭排放器。槍頭接嘴。其內(nèi)部柱塞分2段行程，第l檔為吸液，第2檔為放液。 圖l-3微量移液器的結(jié)構(gòu) 圖l-4持移液器的姿勢(shì) 注：推動(dòng)按鈕內(nèi)部的活塞分2段行程，第一檔為吸液，第二檔為放液，手感十分清楚。 微量移液器的操作 1）調(diào)體積選取鈕至所需體積值；2）套上槍頭，旋緊； 3）垂直持握微量移

24、液器用大拇指按至第一檔；4）將槍頭插入溶液，徐徐松開大拇指，使其復(fù)原； 5）將微量移液器移出液面，必要時(shí)可用紗布或?yàn)V紙拭去附于槍頭表面的液體(注意：不要接觸吸頭孔口)； 6）排放時(shí)，重新將大拇指按下，至第一檔后，繼續(xù)按至第二檔以排空液體。 注意：移取另一樣品時(shí)，按槍頭排放鈕棄掉槍頭并更換新槍頭。3容量瓶及量筒：容量瓶是一個(gè)細(xì)長(zhǎng)頸梨形的平底瓶，具有磨口塞，頸上有標(biāo)線，表示在所示溫度下（一般為20）當(dāng)液體充滿到標(biāo)線時(shí)，液體體積恰好與瓶下所注明的體積相等。容量瓶有10、25、50、100、200、250、500、1000、2000毫升等規(guī)格。容量瓶是裝量型的定量容器，多用作稀釋溶液或配制精確試劑。當(dāng)

25、將液體加至刻度后須用瓶塞塞好，顛倒混勻數(shù)次方可使用。容量瓶是較精確的定量容器，不得直接加熱或烘烤，也不應(yīng)將盛有溶液的容量瓶放入冰箱內(nèi)。當(dāng)配制溶液需要加熱促其溶解時(shí)，必須在燒杯中加熱溶解，并待溶液達(dá)到室溫后，再定量地轉(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)，然后稀釋到刻度，并要注意搖勻。當(dāng)所量取的液體量要求不十分準(zhǔn)確時(shí)，可使用量筒，因其較使用吸管或量瓶更為簡(jiǎn)便，量筒之底座及筒身是焊接一起的，因而不能量取過(guò)熱液體，更不能直接加熱，以防炸裂。4滴定管：滴定管是供容量分析滴定之用，有帶玻塞及橡皮管的兩種類型。前者用以量酸，后者用以量堿。滴定管有刻度較精細(xì)的微量滴定管，有1.0、2.0、5.0、10毫升等規(guī)格。還有25、50、10

26、0毫升等規(guī)格的常量滴定管。使用滴定管應(yīng)該注意以下事項(xiàng)：檢查是否清潔干燥，是否漏水，玻塞是否滑潤(rùn)，如有漏水或轉(zhuǎn)動(dòng)不靈，應(yīng)拆下活塞重新涂抹凡士林。涂抹前要將玻塞擦干，用手指沾少量凡士林在活塞兩頭各擦一薄層，將活塞插入槽內(nèi)，然后向同一方向轉(zhuǎn)動(dòng)活塞，直到從外面看時(shí)，全部透明為止。油涂好后，在活塞的小頭的槽上套一橡皮圈，以防活塞滑脫。使用前必須認(rèn)出每一格表示多少毫升。先用少量滴定液清洗滴定管23次，然后方可裝液。裝液體后，管內(nèi)如有氣泡必須排出。滴定前先應(yīng)讀取起始點(diǎn)。滴定時(shí)，左手控制玻塞，右手持瓶，邊滴邊搖，密切注意被滴定溶液的顏色變化。裝置滴定管時(shí)，管身必須與地面垂直。讀數(shù)時(shí)眼睛與溶液月形面下緣在同一水

27、平線上，不要仰頭或低頭讀數(shù)。如用酸式滴定管裝堿性溶液，滴定后應(yīng)立即洗凈，以免活塞粘連。二、一般操作技術(shù)1、混勻法：欲使一化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行，必須使反應(yīng)體系內(nèi)各種物質(zhì)迅速地相互接觸，因此除特別規(guī)定外，一般都需要將反應(yīng)物徹底混勻。混勻方式大致有以下幾種，可隨使用的器皿的液體容量而選用。（1）旋轉(zhuǎn)混勻法：手持容器作離心旋轉(zhuǎn)，適用以未盛滿液體的試管或小口器皿，如三角瓶等。（2）彈指混勻法：左手持試管使之直立，以右手食指輕擊試管之下部，使管內(nèi)溶液作旋轉(zhuǎn)流動(dòng)。（3）倒轉(zhuǎn)混勻法：適用于有玻璃塞的瓶子，如容量瓶等。（4）彈動(dòng)混勻法：以右手大拇指、食指、中指握住試管上部，將試管放平，于左手掌中彈動(dòng)。（5）吸管混勻

28、法：用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，適用于量少而無(wú)沉淀的液體。（6）攪拌混勻法：適應(yīng)燒杯等大口容器所盛之溶液的混勻，一般在配制混合試劑時(shí)，用玻棒攪拌以助溶，或混勻大量的溶液。2、保溫與加熱：為使某一化學(xué)反應(yīng)在一定的溫度下進(jìn)行，常需要保溫；為促進(jìn)或停止化學(xué)反應(yīng)，有時(shí)需要加熱。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要隨時(shí)監(jiān)測(cè)溫度，并及時(shí)調(diào)節(jié)。（1）保溫：常用恒溫箱或恒溫水浴進(jìn)行，后者的溫度較前者穩(wěn)定。（2）加熱：加熱常用兩種方法，一是直接把試管、燒杯等器皿在酒精燈、電爐或煤氣火焰上加熱；二是在水浴中加熱或煮沸，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的而定。3、過(guò)濾：過(guò)濾的目的是將沉淀與液體分開，用于收集濾液，收集沉淀或洗滌沉淀。在生化實(shí)驗(yàn)中如用于收集濾液

29、應(yīng)選用干濾紙，不應(yīng)將濾紙先弄濕，濕濾紙將影響濾液的稀釋比例。濾紙過(guò)濾一般采用平析法(即對(duì)折后，再對(duì)折)并且使濾紙上緣與漏斗壁完全吻合，不留縫隙。向漏斗內(nèi)加液時(shí)，要用玻棒引導(dǎo)而且不應(yīng)倒入過(guò)快，勿使液面超過(guò)濾紙上緣。較粗的過(guò)濾可用脫脂棉或紗布代替濾紙。有時(shí)以離心沉淀法代替過(guò)濾法可達(dá)到省時(shí)、快捷的目的。三、酸度計(jì)的使用方法（以雷磁25型酸度計(jì)為例）酸度計(jì)是測(cè)定溶液ph值的重要精密儀器。實(shí)驗(yàn)室常用的是國(guó)產(chǎn)雷磁25型酸度計(jì)（最小分度0.1ph）和phs-2型酸度計(jì)（最小分度0.02ph），可用于ph測(cè)定和電動(dòng)勢(shì)測(cè)定。1使用方法（1）安裝電極儀器配備221型玻璃電極和222型甘汞電極。把玻璃電極的塑料帽夾

30、在電極夾的夾子上，插頭插在插孔內(nèi)。把某汞電極的金屬帽夾在電極夾的另一夾子上，由于它具有金屬的帽子，可直接與儀器內(nèi)部形成回路。兩個(gè)電極的高度，可利用電極夾上的支頭螺絲調(diào)節(jié)。（2）校正 首先，將“ph-mv”開關(guān)撥到“ph”位置。然后，打開電源開關(guān)，指示燈亮后，應(yīng)預(yù)熱5分鐘。最好預(yù)熱時(shí)間在半小時(shí)以上，以使零點(diǎn)有較好的穩(wěn)定性。 在小燒杯中加入已知ph值的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，將電極浸入，應(yīng)使玻璃電極的球狀體和甘汞電極的毛細(xì)孔完全浸入溶液。再輕輕搖動(dòng)燒杯，使電極所接觸的溶液均勻。 調(diào)節(jié)溫度補(bǔ)償器使旋鈕指示的溫度與杯內(nèi)溶液(或室溫)的溫度相同。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的ph值，將量程選擇開關(guān)撥至0-7或7-14（phs

31、-2型酸度計(jì)為分檔開關(guān)）。 旋轉(zhuǎn)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使指針指在ph7處。 按下讀數(shù)開關(guān)，轉(zhuǎn)動(dòng)定位調(diào)節(jié)器，使指針恰好指在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的ph處。 放開讀數(shù)開關(guān)，指針應(yīng)指在ph7處，如有變動(dòng)，則重復(fù)、操作至數(shù)值穩(wěn)定為止。 為了更好的校準(zhǔn)，可分別采用兩種ph范圍（0-7或7-14）的已知ph的緩沖液進(jìn)行校正。 校正完畢，用蒸餾水沖洗電極與燒杯。校正后，切勿再旋轉(zhuǎn)定位調(diào)節(jié)器，否則必須重新校正。（3）測(cè)量 用濾紙輕輕觸及兩個(gè)電極以吸干剩余的溶液，或用待測(cè)液洗電極。然后，將電極浸入盛有待測(cè)液的燒杯中，輕輕搖動(dòng)燒杯使溶液均勻。 被測(cè)溶液的溫度應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的溫度相同。 按下讀數(shù)開關(guān)，指針?biāo)傅膒h值即為待測(cè)液的值（ph

32、s-2型酸度計(jì)所測(cè)讀數(shù)應(yīng)為分擋開關(guān)上的指示數(shù)加表頭上指示值）。重復(fù)幾次，直至數(shù)值不變?yōu)闇?zhǔn)。 在放開讀數(shù)開關(guān)后，指針必須指在ph7處，否則，應(yīng)旋轉(zhuǎn)零位調(diào)節(jié)器至ph7處以后，重測(cè)待測(cè)液的ph值。 若在量程07范圍測(cè)量時(shí)，指針讀數(shù)超出刻度范圍，應(yīng)將量程開關(guān)撥至到714的位置，再重復(fù)、的操作。 測(cè)量完放開讀數(shù)開關(guān)，關(guān)閉電源開關(guān)。然后沖洗干凈，玻璃電極可浸泡再蒸餾水中，而將甘汞電極離開蒸餾水并戴上橡皮帽。2注意事項(xiàng) 玻璃電極在初次使用前，必須在蒸餾水中浸泡數(shù)日至一星期，至少泡一晝夜。平時(shí)，應(yīng)經(jīng)常浸泡在蒸餾水中，以備隨時(shí)可用。 玻璃電極不要與強(qiáng)烈吸水的溶劑接觸太久。在強(qiáng)堿溶液中使用應(yīng)盡快操作，用畢立即用水

33、洗凈。 玻璃電極球泡的玻璃膜很薄，因此勿與玻璃杯與硬物相碰，防止球泡破碎。一般安裝時(shí)甘汞電極頭應(yīng)長(zhǎng)出球泡頭部，使在搖動(dòng)時(shí)不會(huì)碰到杯底。 玻璃電極的玻璃膜不要沾上油污。 若不慎沾上油污應(yīng)先用酒精再用四氯化碳或乙醚，最后用酒精浸洗，再用水洗凈。洗凈后只能用濾紙輕輕吸干，千萬(wàn)不要揩擦， 以免破碎玻璃膜。 甘汞電極在使用時(shí)，要注意電極內(nèi)充滿氯化加鉀溶液，里面應(yīng)無(wú)氣泡， 防止斷路。并且要用少許氯化鉀結(jié)晶存在，以使溶液保持飽和狀態(tài)。 在使用時(shí)應(yīng)將該電極上部的小橡皮塞拔去，讓極少量的氯化鉀溶液從毛細(xì)管中流出，使測(cè)定結(jié)果可靠。 首次使用時(shí)，應(yīng)檢查電源是否與儀器要求相符。儀器的電源必須要有地 線，以使指針?lè)€(wěn)定。

34、 3標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的配制酸度計(jì)用的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液要求：有較大的穩(wěn)定，較小的溫度依賴性其試劑易于提純。常用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的配制方法如下：附表 不同溫度時(shí)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的ph值 溫度酸性酒石酸鉀(25時(shí)飽和)0.05m鄰苯二甲酸氫鉀0.025m kh2po40.025mna2hpo40.0087mkh2po40.0302m na2hpo40.01m na2b4o704.016.987.539.46104.006.927.479.33154.006.907.459.27204.006.887.439.23253.564.016.807.419.18303.554.026.857.409.14383.554.036.

35、847.389.08403.554.016.847.389.07503.554.066.837.379.01將標(biāo)準(zhǔn)緩沖液儲(chǔ)于硬質(zhì)玻璃瓶或塑料瓶中，能穩(wěn)定12月，它們的ph值隨溫度不同稍有差異，見附表。（1）ph4.00(1020)將鄰苯二甲酸氫鉀在105干燥1小時(shí)后，稱取5.07克加重蒸餾水溶解至500毫升。（2）ph6.88（20）稱取在130干燥2小時(shí)的3.401克磷酸二氫鉀（kh2po4），8.95克磷酸氫二鈉（na2hpo412h2o）或3.549克無(wú)水磷酸氫二鈉（na2hpo4），加重蒸餾水溶解至500毫升。（3）ph9.18（25）稱取3.8144克四硼酸鈉（na2b4o710h2

36、o）或2.20克無(wú)水四硼酸鈉（na2b4o7），加重蒸餾水溶解至100毫升。四、生化實(shí)驗(yàn)室的基本設(shè)施與裝備1. 溫度與環(huán)境設(shè)施許多生化實(shí)驗(yàn)都要求在一定的溫度和濕度下進(jìn)行操作，因此，一個(gè)正規(guī)的生化實(shí)驗(yàn)室必須能夠保持恒溫、恒濕的環(huán)境。為了保持這些條件，實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)裝備空調(diào)和加濕器等，而儀器分析室則要求保持干燥，一些怕潮濕和易水解的試劑應(yīng)保存在干燥箱中。由于各種生物材料、制劑和各種生化試劑要求在不同的溫度下保存，實(shí)驗(yàn)室必須備有4、-20、-80的冰箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。對(duì)于需在較高溫度下進(jìn)行的操作，則可使用烘箱和高溫電爐等。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)備有干冰，以便使用乙醇干冰浴進(jìn)行樣品的快速

37、冷凍分裝。2. 實(shí)驗(yàn)室用純水生化實(shí)驗(yàn)室使用最多的溶劑是“水”，配制生化實(shí)驗(yàn)用試劑不能用自來(lái)水，只能使用經(jīng)過(guò)純化的水。生化實(shí)驗(yàn)對(duì)所用水的純度是要求比較高的，通常可以認(rèn)為，水的質(zhì)量越高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就越真實(shí)可靠和準(zhǔn)確，為此必須保證實(shí)驗(yàn)用水的質(zhì)量。常用的兩種純水是二次蒸餾水和無(wú)離子水。在超純分析和特殊的生化實(shí)驗(yàn)中要求更高的水質(zhì)，如1518 m-cm高純無(wú)離子水、無(wú)熱源高純水、無(wú)菌水、亞沸蒸餾水、無(wú)二氧化碳蒸餾水等。實(shí)驗(yàn)室制備無(wú)離子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂和聚苯乙烯季胺型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂填充的陽(yáng)離子和陰離子交換柱，或是陰、陽(yáng)離子交換樹脂的比例為21的混合柱。無(wú)離子水的水質(zhì)用電阻

38、率表示，最高純度是18 m-cm（25）。雖然無(wú)離子水中陰、陽(yáng)離子的含量可以很低，但用離子交換法卻不能去除水中的有機(jī)物雜質(zhì)，離子交換樹脂中的低分子有機(jī)化合物亦可能溶于水，因此由無(wú)離子水的電阻率不能看出水中有機(jī)物的污染程度，有機(jī)物的污染有可能干擾生化實(shí)驗(yàn)中的某些反應(yīng)，也會(huì)使水的紫外吸收增加，對(duì)于那些對(duì)紫外吸收要求十分嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)選用蒸餾水而不用無(wú)離子水。實(shí)驗(yàn)室中制備蒸餾水，多采用石英管加熱的硬質(zhì)玻璃蒸餾水器，蒸餾時(shí)不能用自來(lái)水，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生水垢，最好用無(wú)離子水作為水源。如欲除去有機(jī)物，可在蒸餾水器中每升水加1g高錳酸鉀和1ml 85的磷酸，以便通過(guò)氧化除去有機(jī)物。不含金屬離子的水，需用亞沸蒸餾水

39、，即用石英亞沸蒸餾器進(jìn)行蒸餾，其特點(diǎn)是在液面上方加熱，但水并不沸騰，只是液面處于亞沸狀態(tài)，可將水蒸氣帶出的雜質(zhì)減至最低，但制水量較小，每小時(shí)約14升。實(shí)驗(yàn)工作中不應(yīng)盲目追求水的純度，水的價(jià)格隨水質(zhì)的提高而成倍地增長(zhǎng)，因此要根據(jù)實(shí)際工作的需要，即所用水中應(yīng)排除的干擾物質(zhì)的類型，來(lái)選用水的種類，如：無(wú)離子水、普通蒸餾水、二次蒸餾水、亞沸蒸餾水及按特殊要求制備的高純水等。所有的各種純水，在貯存中都會(huì)被污染：塑料容器會(huì)產(chǎn)生有紫外吸收的有機(jī)物；玻璃和金屬容器會(huì)產(chǎn)生金屬離子的污染；長(zhǎng)時(shí)間放置更會(huì)使水長(zhǎng)菌，空氣中的二氧化碳會(huì)溶入水中，所以貯存高純水一定要隔絕空氣，密封蓋嚴(yán)，必要時(shí)貯存在冰箱的冷藏室中。3.

40、消毒系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行生物培養(yǎng)和生物反應(yīng)的操作，這些操作都必須排除其他生物因素的干擾，因此在做這些實(shí)驗(yàn)之前，都必須對(duì)實(shí)驗(yàn)中用到的、可能造成污染的材料、器械等進(jìn)行消毒滅菌處理。常用的滅菌方法有：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過(guò)濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種無(wú)菌處理設(shè)備。4. 計(jì)量系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)都要求在各種標(biāo)準(zhǔn)的定量條件下進(jìn)行，因此實(shí)驗(yàn)室必須配備各種標(biāo)準(zhǔn)的定量系統(tǒng)。常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、ph測(cè)定系統(tǒng)、液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)等。 稱量系統(tǒng)：最常用的設(shè)備是各種千分之一的扭力天平、電子天平和各種萬(wàn)分之一的單、雙盤天平和電子天平等，它們分別用于各種緩沖液的配制

41、和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱量等。 液體體積度量系統(tǒng)：常用的有各種量筒、移液管、容量并、微量進(jìn)樣器和各種自動(dòng)取液器等。 酸堿度ph測(cè)量系統(tǒng)：最常用的是ph試紙和ph計(jì)。 液體溶質(zhì)定量系統(tǒng)：此系統(tǒng)主要是根據(jù)液體溶質(zhì)的某些理化特性而設(shè)計(jì)的，不同的物質(zhì)在一定的條件下有特定的吸收光譜，其吸收值的大小與其在溶液中的濃度有一定的關(guān)系，可以通過(guò)測(cè)定某物質(zhì)在溶液中的吸收光譜來(lái)計(jì)算出該物質(zhì)的濃度，因而分光光度計(jì)就是生化實(shí)驗(yàn)室必備的儀器分析手段。主要有可見分光光度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)和高檔的快速掃描紫外可見分光光度計(jì)等。5. 離心設(shè)備離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段，因而生化實(shí)驗(yàn)室必須備有各種形式的離心機(jī)。常用的有

42、普通臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)和超速離心機(jī)等。6. 電泳裝置電泳是生化實(shí)驗(yàn)中最常用最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。電泳裝置由電源和電泳槽兩部分組成，詳見第四章。7. 層析裝置層析又稱為色譜，是分離各種生物大分子的主要手段之一，因而各種層析系統(tǒng)和核酸蛋白檢測(cè)器就是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的儀器設(shè)備。主要的層析技術(shù)有：吸附層析、凝膠排阻層析、離子交換層析和親和層析等，詳見第五章。8. 光密度儀 激光光密度儀是適用于多種電泳結(jié)果分析的儀器。它采用激光為光源，色散性強(qiáng)，線性范圍廣，分辨率高，所得結(jié)果可以在電腦中進(jìn)行多維的圖象處理，并打印出結(jié)果，在生化實(shí)驗(yàn)室中正得到越來(lái)越廣泛的使用。9.

43、 真空印跡系統(tǒng)該設(shè)備是一種利用真空原理將已經(jīng)分離的生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸)從電泳后的凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上的儀器，主要由印跡儀和真空印跡泵組成，印跡效率接近100，重復(fù)性好，方法簡(jiǎn)易、快速，將轉(zhuǎn)移分子的變性、中和、印跡等所有步驟均在印跡儀中完成，從而避免了凝膠受損。10. 核酸自動(dòng)合成儀與測(cè)序儀用于dna、rna的自動(dòng)合成及序列測(cè)定。11. 蛋白質(zhì)的自動(dòng)合成與測(cè)序儀用于蛋白質(zhì)分子的體外合成與序列測(cè)定。12. pcr儀pcr(polymerase chain reaction)是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該反應(yīng)是用dna聚合酶在體外大量擴(kuò)增dna片段的一種方法。pcr儀就是將此方法實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作的一種儀器

44、，是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用和必備的設(shè)備。13. 同位素實(shí)驗(yàn)設(shè)施生物化學(xué)許多實(shí)驗(yàn)都要用到放射性同位素，如：生物體分子示蹤、分子雜交、放射性檢測(cè)等，因此實(shí)驗(yàn)室必須有安全的同位素實(shí)驗(yàn)設(shè)施。放射源材料存放室：用于放射源材料的存放、保管等，應(yīng)較僻靜。操作時(shí)的防護(hù)設(shè)施： 常用的器具有：有機(jī)防護(hù)并、特制防護(hù)衣、防護(hù)罩等接觸同位素樣品時(shí)必須戴防護(hù)手套。放射性檢測(cè)、監(jiān)測(cè)器：在操作同位素的地方，應(yīng)配備檢測(cè)、監(jiān)測(cè)器，能自動(dòng)安全報(bào)警，隨時(shí)報(bào)告并指示放射源情況。放射性核素分析測(cè)定儀：用來(lái)檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。常用的有液體閃爍計(jì)數(shù)器，數(shù)字式放射自顯影分析儀，蓋革計(jì)數(shù)器和射線放射顯影盒等。廢物處理器：使用同位素應(yīng)有能夠安全地

45、存放和處理同位素廢物的場(chǎng)所，否則嚴(yán)禁使用同位素。14. 生物培養(yǎng)設(shè)施生物培養(yǎng)是生化實(shí)驗(yàn)必不可少的設(shè)備。生物材料的培養(yǎng)有微生物培養(yǎng)、植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物培養(yǎng)等。不同的培養(yǎng)，其對(duì)設(shè)施的要求也有所不同。微生物培養(yǎng)：需要恒溫恒濕培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器即搖床（有空氣和水浴式以及全溫式搖床）、發(fā)酵罐、大型生物反應(yīng)器等。植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)： 需要恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)器、生物反應(yīng)器和植物房等。動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物培養(yǎng)：需要二氧化碳培養(yǎng)箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱和動(dòng)物房等。 為了對(duì)所培養(yǎng)的微生物和動(dòng)植物細(xì)胞進(jìn)行破碎，提取所需的生物大分子，還必需有各種高效率的細(xì)胞破碎裝置。15. 基因?qū)雰x用于向受體生物細(xì)胞

46、中導(dǎo)入基因。常用的導(dǎo)入儀有：電導(dǎo)入儀、基因槍、激光和超聲導(dǎo)入儀、原生質(zhì)體融合儀等。16. 高效液相色譜儀和毛細(xì)管電泳儀用于各種生物大分子的分析與鑒定。17. 暗室在生化實(shí)驗(yàn)研究中，必須有一間裝備完整的暗室，能對(duì)各種照相乳膠和感光材料進(jìn)行處理，如各種電泳凝膠的照相沖洗和放大，放射性自顯影的x射線片及其他感光底片的處理，以及進(jìn)行核酸與熒光物質(zhì)（溴化乙錠）結(jié)合后在紫外線照射下對(duì)電泳結(jié)果的觀察操作等。暗室中應(yīng)裝備有：照相裝置、放大機(jī)、曝光箱、翻拍儀、自動(dòng)沖片機(jī)和紫外透射儀等。18. 冷室生化實(shí)驗(yàn)一般都要求在低溫下進(jìn)行，由于冰浴太小，冷柜也不能進(jìn)人操作，因此就需要有一間410的冷室，工作人員可以在其中進(jìn)

47、行各種柱層析、各種電泳、生物大分子的提取和分離、硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)以及各種物質(zhì)的透析等操作，并可以貯存各種生物制品和生化試劑。19. 其他設(shè)備實(shí)驗(yàn)室除以上常規(guī)設(shè)備和設(shè)施外，還必須裝備下列一些常用設(shè)備通風(fēng)柜：用于有害和有毒氣體的操作。微波爐：用于化凍、滅菌及其他一些需要快速加熱的操作。組織打碎機(jī)和勻漿器：用于各種生物材料、動(dòng)植物組織和細(xì)胞的破碎。超聲清洗機(jī)：用于各種器皿、移液管和自動(dòng)取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動(dòng)相的脫氣等。制冰機(jī)：為實(shí)驗(yàn)室提供足夠的碎冰塊。冰凍干燥機(jī)：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。機(jī)械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。旋轉(zhuǎn)

48、蒸發(fā)器：用于各種水溶液和有機(jī)溶液的旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾操作。普通顯微鏡和倒置顯微鏡：用于對(duì)各種細(xì)胞和生物材料的觀察。酶標(biāo)儀：用于免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。由上述內(nèi)容可見，生化實(shí)驗(yàn)室所需裝備的各種儀器設(shè)備和設(shè)施是多種多樣的，因而要求每一位生物化學(xué)工作者和學(xué)生都必須非常重視這些儀器設(shè)備和設(shè)施的使用和維護(hù)，必須具有較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力。能否正確熟練地使用上述這些儀器設(shè)備，在很大程度上將決定他們實(shí)驗(yàn)的成敗。 （張媛英，王澤平，方茜）第二章 分光光度技術(shù)分光光度法是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來(lái)鑒別物質(zhì)或測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)靈敏度強(qiáng)，精確度高，操作簡(jiǎn)便，快速；對(duì)于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，勿需分離即可檢測(cè)出其中的微

49、量組分，因此分光光度法已成為生物化學(xué)研究中廣泛使用的方法。人肉眼可見的光線稱可見光，波長(zhǎng)范圍在400760nm，波長(zhǎng)范圍在200400nm為紫外光區(qū)(波長(zhǎng)760nm)。可見光區(qū)的電磁波，因波長(zhǎng)不同而呈現(xiàn)不同的顏色，這些不同顏色的電磁波稱單色光，單色光并非單一波長(zhǎng)的光，而是一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，太陽(yáng)及鎢絲燈發(fā)出的白光，是各種單色光的混合光(復(fù)合光)，利用棱鏡可將白光分成按波長(zhǎng)順序排列的各種單色光，即紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等，這就是光譜。一、基本原理有色物質(zhì)的顯色，是由于它對(duì)光線的吸收具有選擇性。白光是波長(zhǎng)在400-750nm的電磁波，它是由各種波長(zhǎng)不同，顏色不同；如果溶液對(duì)某些波長(zhǎng)的光吸收較少

50、而對(duì)其它波長(zhǎng)的光吸收較多，則溶液呈現(xiàn)這種吸收較少而透過(guò)較多的光的顏色，例如溶液吸收了紅光，透過(guò)藍(lán)綠色光較多，則溶液呈現(xiàn)綠色。當(dāng)然一些物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)在可見光波長(zhǎng)以外，如蛋白質(zhì)的吸收波長(zhǎng)為280nm，核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm。當(dāng)光線通過(guò)透明介質(zhì)時(shí),某波長(zhǎng)的光有一部分被吸收,一部分透過(guò),因此當(dāng)光透射出溶液之后,光強(qiáng)度減少。lambert-beer定律是利用分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析的基本原理，這個(gè)定律是討論有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。1朗伯（lambert）定律：當(dāng)單色光通過(guò)一吸收光的介質(zhì)時(shí)，其光強(qiáng)度隨吸收光介質(zhì)的厚度增長(zhǎng)而呈指數(shù)減少，即 i/i0 = e-k

51、1l （k1為吸光系數(shù)(absorption coefficient)(gcm-1)）（ i0：入射光強(qiáng)度；：透射光強(qiáng)度；l：介質(zhì)的厚度）2比爾（beer）定律：?jiǎn)紊馔ㄟ^(guò)一光吸收介質(zhì)時(shí)，光強(qiáng)度隨介質(zhì)濃度增長(zhǎng)而呈指數(shù)減少。即 i/i0 = e-k2c （c為溶液濃度(concentration) (gl-1)）兩者結(jié)合在一起為朗伯-比爾（lambert-beer）定律。即 i/i0 = e-cl 式中(epsilon)稱之摩爾吸光率(molar absorptivity)(lmol-1cm-1)系一常數(shù),也叫消光系數(shù)；透光度t(transmittance)為i/i0，通常以百分率表示。取對(duì)數(shù)：

52、-lnt= -lni/i0=-lne-cl 令a=-lnt 得：a=cl式為lambert-beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過(guò)溶液介質(zhì)后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。此式為分光分析法的基本計(jì)算式。式中a（absorbance）為吸光度，c(concentration)濃度(moll)，l為溶液樣品的長(zhǎng)度cm(或比色皿內(nèi)徑長(zhǎng)cm)。采用適當(dāng)?shù)墓庠础⒗忡R和適當(dāng)?shù)墓庠唇邮掌鳎屇骋徊ㄩL(zhǎng)的光透過(guò)某一溶液，通過(guò)儀器的測(cè)定，定性鑒別物質(zhì)或定量測(cè)定某一組分含量的方法即為分光光度法。通過(guò)光波長(zhǎng)的調(diào)整，可使溶質(zhì)濃度的測(cè)定范圍不僅僅局限于可見光，尚可擴(kuò)大到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。經(jīng)單色器（棱鏡）得到的光源雖然不是純的單色光，但波長(zhǎng)范圍更狹窄，更符合lambert