1、快速序列測定：雙脫氧末端終止法06級生科A班 蘇 狄 摘 要：核酸的序列分析，即核酸一級結構的測定，是現代分子生物學中一項重要技術。目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977年）提出的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert（1977年）提出的化學降解法，其中雙脫氧鏈終止法是目前應用最多，最好的技術。關鍵詞：快速序列測定、雙脫氧末端終止法目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（雙脫氧鏈終止法）和Maxam（1977）提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭，但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終

2、止于一種（或多種）特定的殘基，形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個特定堿基在待測DNA片段上的位置所決定。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經放射自顯影后，從放射自顯影膠片上直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳亦是DNA序列測定技術的重要基礎，可分離僅差一個核苷酸、長度達300500個核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測定的簡便方法為詳細分析大量基因組的結構和功能奠定了基礎，時至今日，絕大多數蛋白質氨基酸序列都是根據基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。除傳統的雙脫氧鏈終止法和化學降解法外，自動化測序實際上

3、已成為當今DNA序列分析的主流。此外，新的測序方法亦在不斷出現，如上世紀90年代提出的雜交測序法（sequencing by hybridization，SBH）等。雙脫氧末端終止法測序一、 原理 雙脫氧末端終止法是Sanger等在加減法測序的基礎上發展而來的。其原理是：利用大腸桿菌DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，并以與模板事先結合的寡聚核苷酸為引物，根據堿基配對原則將脫氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5-磷酸基團與引物的3-OH末端生成3,5-磷酸二酯鍵。通過這種磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補DNA得以從53延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為鏈終止劑。ddTNP比普通

4、的dNTP在3位置缺少一個羥基（2,3-ddNTP）（圖7-4-1），可以通過其5三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由于缺少3-OH，不能同后續的dNTP形成3,5-磷酸二酯鍵。因此，正在增長的DNA鏈不再延伸，使這條鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處。這樣，在4組獨立的酶反應體系中，在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種后，鏈的持續延伸將與隨機發生卻十分特異的鏈終止展開競爭，在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結果產生4組分別終止于模板鏈的每一個A、每一個C、每個G和每一個T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上

5、的核苷酸順序。雙脫氧鏈終止法測序原理如圖7-4-2所示。圖7-4-1 脫氧核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸分子結構5GAGTCACACTTGAC 3待測單鏈DNA 3CTG 5引物、Klenow酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和少量-32P-dATP 加ddGTP反應3GAACTG 53GTGAACTG 53GTGTGAACTG 5加ddCTP反應3CAGTGTGAACTG 53CTCAGTGTGAACTG 5加ddTTP反應3TGAACTG 53TGTGAACTG 53TCAGTGTGAACTG 5加ddATP反應3ACTG 53AACTG 53AGTGTGAACTG 5變性凝膠電泳、

6、放射自顯影5 ACTGGAGTCACACTT測序圖譜識讀3 圖7-4-2 雙脫氧鏈終止法測序原理二、Sanger法DNA測序的試劑（一）模板 有兩種類型的DNA模板可以作為Sanger法測序的模板，即純化的單鏈DNA和經熱變性或堿變性的雙鏈DNA。1單鏈DNA模板：在一般情況下，可將靶DNA片段克隆于M13mp載體，從重組克隆M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板。這種單鏈模板效果最佳，只要細心掌握模板與引物的最佳比例，有經驗的測序人員通過一次末端終止反應，能讀取500個以上的核苷酸序列。2經熱變性或堿變性的雙鏈DNA模板：盡管采用變性雙鏈DNA作測序模板顯然簡單且方便，但實際上很

7、難獲得單鏈模板那樣的滿意結果。利用雙鏈質粒模板測序，其中有兩個至關重要的因素，即模板的質量和聚合酶的種類。用小量制備的質粒DNA來測定未知序列的DNA克隆往往因為有污染而并不可取，高純度的質粒最好采用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備。其次是應采用高質量的聚合酶。一次末端終止反應亦可能讀出300核苷酸序列。應該注意的是，適合做雙鏈模板的質粒，最好具有較高的拷貝數并有插入失活的選擇標志，有配套的通用引物結合區。最常用的載體系統是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。雙鏈模板測序最大的優勢是對已知序列DNA的亞克隆進行鑒定，可省略再經M13載體亞克隆獲取單鏈模板過程。（二）引物

8、酶促測序反應中利用一個與模板鏈特定序列互補的合成寡核苷酸作為DNA合成的引物。在許多情況下，可將靶DNA片段克隆于M13噬菌體或噬菌粒載體，以取得單鏈DNA分子作為模板。但也可以采用Sanger 法商定變性雙鏈DNA模板的序列。在以上兩種情況下， 都可以采用能與位于靶DNA側翼的載體序列相退火的通用引物，而不必取得與未知DNA序列互補的引物。適于M13噬菌體重組克隆的通用測序引物一般長15-29 個核苷酸，并可與緊靠M13mp18噬菌體多克隆位點區的Hind位點成M13mp19 噬菌體多克隆位點區的EcoRI位點的序列互補。這些引物同樣也可用于對克隆于pUC質粒的DNA進行“雙鏈”測序，并可從

9、許多廠商中購置得到。此外，還有若干家公司出售一些引物，這些引物下為了對通過多種限制酶切位點克隆于不同質粒的靶DNA進行測序而設計的。（三）DNA聚合酶 如前所述，選用合適的DNA聚合酶進行測序反應也是保證測序質量的重要因素之一。常用于雙脫氧末端終止法測序的有幾種不同的酶：其中包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反轉錄酶（見文獻，如Mieredorf和Prfeffer，1987）經過修飾消除了35外節酶活性的T7噬菌體DNA聚合酶（Sequenase）和測序酶2.0），Tabor和Richardson，1978惟及從嗜熱水生菌（Thermus aquatic

10、us）分離的耐熱DNA聚合物（Taq DNA聚合酶）。這些酶的特性差別懸殊，因而可大大影響通過鏈終止反應所獲得的DNA序列的數量的質量。（1）大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow 片段：這種酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然廣泛用于DNA序列測定的酶。 通常碰到的兩個問題是：1）Koenow片段的持續合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的摻入，而是因為聚合酸人模板上隨機解離而終止合成，因而導致背景增高。由于該酶不能沿模板進行長中距離移動，因此利用該酶進行的標準測序反應所得序列的長度有限。通常，這一反應只能得到大約250-350個核苷酸的序列。 如果分兩步進行反應，所得序列的

11、數目可以翻一番；其中第一步是初始標記步驟，采用低濃度的dNTP，而隨后的第二步是鏈延伸鏈終止反應，含有ddNTP和高濃度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了這些改進，用Klenow 酶所測序列的長度通常還是不如持續合成能力較強的測序酶。2）這種酶對模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二級結構的區域進行復制的效能很低。將聚合反應的溫度提高到55，可以緩解但并不能徹底解決這一問題（Gomer和Firtel，1985)。有時可采用一些dNTP類似物如dITP或7脫氮dGTP（7deaza-dGTP）來獲取模板中可形成穩定二級結

12、構的相應區段的序列信息，但Kleow酶對這些類似物的作用不如測序酶有效，這也許是因為它們使Klenow酶原已較低的持續合成能力進一步降低。總而言這，可以選用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段測定從引物5位置起250個堿基以內的一段DNA序列， 但不宜用它來測定更長一段DNA序列或者具有二重對稱和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。（2）反轉錄酶：盡管日常測序工作并不廣泛使用反轉錄酶，但有時用這個酶解決一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸區而引起的問題。來自禽類和鼠類反轉錄病毒的反轉錄酶在這一看來要比Klenow酶略勝一籌（Karanthaansis，1982;Graham等,198

13、6 ）,盡管它們也許還是比測序酶遜色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。（3）測序酶：測序酶（SequenaseTM）是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶。這酶原來具有很強的35外切核酸活性，經過修飾后， 這一活性大部分均被消除。測序酶2.0版是測序酶的基因工程產品，它完全缺失了3 5外切核酸酶活性，極其穩定而經活性要比經化學修飾的測序酶高2倍。測序酶持續合成能力很強，聚合速率很高，對諸如dITP和7脫氮dGTP等用于提高分子辨率使測序凝膠某些區段上的壓縮條帶得以分開的核苷酸類似物具有廣泛的耐受性。它是測定長段DNA序列的首選酶。測序酶可以沿模板移動很長的距離

14、，因而一套反應常常就可以測定數百個核苷酸的DNA序列。實際上，測得序列的長度更多是受聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力而不是受該聚合酶的特性所制約。為了充分利用測序酶極高的持續合成能力，可采用兩步測序反應。第一步首先采用低濃度的dNTP的較低溫度， 以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP和較低溫度，以便將合成反應限制在適度之下并確保放射性標記dNTP的有效摻入，這步反應的產物是僅僅延伸了20-30堿基的引物。 再將第一步反應等分于4組1套的標準反應系統中，每組反應中都含有高濃度的d NTP和一種ddNTP。這樣聚合反應就得以繼續，直至造成鏈終止的核革酸摻入正在增長的鏈中。（4）Taq DN

15、A聚合酶：適用于測定在37 形成大段穩定十級結構的單鏈DNA模板序列。這是因為Taq DNA聚合酶在70-75活性最高，這一溫度下即使GC豐富的模板也無法形成二級結構。按照1nnis 等（1988）介紹的方法使用Taq DNA聚合酶進行測序，在放射自顯影片上得到的測序梯連續數百個堿基條帶始終清晰如一，表明這種酶的持續合成能力甚佳。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T的位置上。循環測序法利用了熱循環儀的自動循環的高效能力。循環測序反應與普通PCR反應有所不同。只需一條引物，通過單引物進行熱循環，模板DNA以線性方式被擴增，而不是標準PCR的指數方式擴

16、增；反應底物除四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入了雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），進行擴增時，鏈的延伸終止于摻入ddNTP的位置，產生分別終止于不同核苷酸的一系列不同長度的擴增片段。（四）放射性標記的dNTP傳統的DNA測序方法都采用-32P-dNTP作為放射性標記物，但由于32P發射的高能射線，常會引起二個問題。首先是導致放射自顯影圖譜條帶擴散、分辨率低，限制了識讀序列的數量和準確性。其次是32P衰變會導致DNA樣品分解，通常都應在測序反應后24h內進行電泳，否則無法獲得好的結果。近年來-35S-dNTP被廣泛采用，是由于35S產生較弱的射線，克服了32P的二大缺點。放射自顯影圖譜具有

17、較高的分辨率和較低的本底，測序反應產物可在-20保存一周，而分辨率并不下降。（五）dNTP類似物二重對稱的DNA區段（特別是GC含量高者）可以形成鏈內二級過程中不能充分變性。因此將引起不規則遷移，使鄰近的DNA條帶壓縮在一起，以致難以讀出序列。這種壓縮現象歸因于DNA二級結構的存在，而且不可能通過改變測序反應中出序列。這種壓縮現象歸因于DNA二級結構地存在，而且不可能通過改變測序反應中所用DNA聚合酶的種類而得到減輕。但是凝膠中的壓縮區段往往可以通過采用諸如dITP（2脫氧次黃苷15 三磷酸）或7脫氮dGTP（7脫氮2脫氧鳥苷5 三磷酸）等核苷酸類似物進行分辨。這些類似物與普通堿基的配對能力較

18、弱，而且是測序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的合適底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但對某些壓縮條帶，7脫氮dGTP無濟于事；同樣，dITP也無補于另一壓縮條帶（尤其是得于GC豐富區的縮條帶）的分辨。如果需要采用類似物，首先可試用dOTP，如果壓縮條帶用d ITP或7脫氮dGTP都無法分辨， 則轉而測定另一條鏈的DNA序列幾乎總能如愿以償。如上所述，兩種形式的測序酶和Taq DNA聚合酶對核苷酸類似物的耐受性優于大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造廠商聲稱在測定含穩固二結構的模板序列時，測序酶2.0版要優于原

19、來的測序酶。測序酶2.0版持續合成能力強于測序酶，其作用總是一氣呵成，很少半途而廢，因而消除了“鬼”帶。 而且，測序酶2.0版對諸如dITP類核苷酸類惟物的耐受性看來也優于原來的測序酶。（六）關于DNA序列的識讀DNA序列的識讀是一個熟能生巧的過程。注意幾點技巧：在顯影前后一定要注意標明模板名稱、日期和測序人等，并標明各套反應位置；識讀時從顯而易見的特征序列開始，如連續的同聚核苷酸（如TTTTT、AAAAA）或交替出現的嘌呤和嘧啶（如GTGTGTGT），一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。三、雙脫氧鏈止終法測定戰略由于DNA一般都由幾千個單核苷組成。而目前測定DNA序列的最好方法，

20、一次也只能測約600個核苷酸，因此進行DNA順序測定前，需要用不同限制酶消化等測DNA，使其降成小片段，分別克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測定各小片段的順序，由于不同限制酶產生的片段之間有交錯重疊順序，根據片段間和末端重疊序列，用計算機軟件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，進而排出DNA的全序列。四、雙脫氧鏈終止法測定方法以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實施步驟為例：1M13噬菌體復制型雙鏈DNA（RFDNA）的制備。為了將待測雙鏈DNA進行克隆，必須制備M13mp18

21、或M13mp19復制型（閉環雙鏈）DNA，從M9培養基中，挑起單個克隆大腸桿菌，JM101到50ml2YT培養基中，37振蕩過夜。稀釋1ml培養物到50ml2YT培養中，于37振搖6h，轉移2ml培養物于微量離心管中，12000g，離心5min細菌沉淀保留用于分離復制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。細菌沉淀用于分離復制型DNA，可以采用標準的堿解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA試劑盒制備。（方法同分離質粒DNA方法）。2重組噬菌體制備采用多克隆位點上的限制性內加酶切割待測DNA，并采用相同內切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol 101gene clean 試劑盒分別純化內切酶切割后的DNA片段），然后將待測外源DNA片段與M13復制型載體DNA連接過夜，連接反應物轉染JM101感受態細菌，將連接物10l與200l感受態細菌混勻，放置冰上4050min，再放在42水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養物混勻，然后分別以300l于含有IPIG（200mg/ml）和X-gal200mg/ml的2YT培養基上，于37培養8h即可出現藍色和白色噬斑，白色或稱無菌噬斑，即為陽性重組噬菌體。3單鏈噬菌體DNA（模板DNA）的制備上述平板的每個白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子