1、細菌內毒素檢查法 （凝膠法）,蘇州大學 衛生與環境技術研究所,內 容,基本概念 實驗方法 操作注意事項,細菌內毒素,細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的產物,它主要化學成分是脂多糖。細菌在生活狀態下不會釋放出來，只有當細菌死亡后才會表現出毒性。,一、概念及相關知識,熱原反應：病人在靜脈給藥15分鐘后發生冷感、寒戰、發熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。 熱原：任何可以導致肌體發熱的物質。 機理：外源性熱原質通過內源性熱原質起作用。,外源性 熱原質,吞噬性 白細胞,內源性 熱原質,體溫調節 中心,發 熱,新蛋白合成,新mRNA翻譯,1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（195

2、3年版）起收載。 所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經過熱原檢查。 熱原檢查法的局限性： 1、重現性差。 2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。 3、不同細菌產生的熱原質的致熱域有差別。 4、非定量反應。 雖然不排除有其他熱原物質存在，但細菌內毒素是最主要的熱原物質。,細胞壁結構： 肽聚糖 脂蛋白 革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖 細菌內毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當細胞壁外膜結構完整時不具備生物活性，只有當細菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內毒素活性。 脂多糖結構：多糖O抗原核心多糖類脂A,致熱活性部分,細菌內毒素的生物活性,1、致熱性。 2、致死性

3、毒性。 3、白細胞減少。 4、激活凝血系統。 5、降低血壓，休克。 6、 Shwartzman反應。 7、刺激淋巴細胞有絲分裂，等等 。,細菌內毒素的耐熱性,細菌內毒素具很強的耐熱性，一般的高壓滅菌不能去除細菌內毒素，需250至少30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活 。,實驗用器具的處理,內毒素試驗中使用的器皿都要經過處理去除可能存在的外源性內毒素。 耐高溫的玻璃器皿等置于電熱干烤箱內180干烤至少2h或者250干烤至少30分鐘； 塑料器皿置于30雙氧水中浸泡4h，再用細菌內毒素檢查用水充分沖洗，60烘干備用。,細菌內毒素的單位,內毒素的量值： 1、內毒素單位（EU） 1982年FDA將當時美國

4、代號為EC2的內毒素標準品規定為5EU/ng。1983年內毒素單位（EU）被USP正式引用。 2、國際單位（IU） WHO先后兩次組織協作標定，建立內毒素國際標準品，其中第二批內毒素國際標準品適用于所有內毒素檢查法，且明確1IU1EU。,細菌內毒素檢查法,凝膠法 濁度法 光度法 顯色基質法 重現性好 能定量 能控制藥物的增強/抑制干擾 操作簡便。節省時間,方法 分類,方法 特點,細菌內毒素檢查法概念,本方法是利用鱟試劑檢測由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法 。細菌內毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，由于凝膠法操作簡單快捷、靈敏度高，并且藥典規定

5、當不同試驗方法的結果存在爭議時，除另有規定外，以凝膠法為準，所以凝膠法被廣泛應用。,鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。 鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內毒素形成特異凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內毒素濃度有關，是體外檢測內毒素的敏感試劑。,凝膠法概念,凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。,鱟試劑與內毒素反應機理,內毒素,C因子,活化的C因子,凝膠,B因子,凝固酶原,凝固酶,活化的B因子,凝固蛋白原,鱟凝血系統酶聯反應,二

6、、細菌內毒素凝膠法,實驗程序 1、試驗準備：試劑、儀器及用具 2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度 3、鱟試劑靈敏度復核 4、供試品干擾試驗（新藥或新方法） 5、供試品內毒素限量檢查,凝膠法中用到的儀器,1. 超凈工作臺,凝膠法中用到的儀器,2. 恒溫培養箱 孵育樣品浸提液以及培養試驗結果。,凝膠法中用到的儀器,3.干烤箱 用于實驗用耐高溫器皿的去熱源，溫度范圍要求至少300,凝膠法中用到的儀器,4. 移液器和無熱源的移液尖（或者去熱源的刻度吸管） 5. 計時器、漩渦混合器、電子天平等,凝膠法中用到的器皿,凝膠法中用到的試劑,1）鱟試劑：具有國家頒發的批準文號 2）細菌內毒素工作品 3）細菌內

7、毒素檢查用水（內毒素含量小于0.015EU/ml的無菌水） 4）75乙醇,鱟試劑靈敏度復核試驗,當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。,鱟試劑靈敏度復核試驗,根據鱟試劑靈敏度的標示值（）,將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘, 然后制成2、1、0.5和0.25四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。,鱟試劑靈敏度復核試驗,取復溶后的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1m

8、l細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。 將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入371的適宜恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘。,鱟試劑靈敏度復核試驗,結果觀察 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180時，若管內形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉180后從管壁滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。,鱟試劑靈敏度復核試驗,若最大濃度2.0管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（c），計算方法見中國藥典。 反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的

9、濃度。 當c在0.52.0（包括0.5和2.0）時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。,凝膠法的試驗步驟,下面我們結合中國藥典2010、 GB 14233.2醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 以及GB 15810一次性無菌注射器 來學習具體試驗方法。,實驗步驟,浸提介質（細菌內毒素檢查用水）體積計算公示： V浸提介質體積，單位為（ml）； L產品細菌內毒素限值（該產品允許含有的細菌內毒素的量），單位為EU/件； 鱟試劑靈敏度的標示值，單位為EU/ml。,實驗步驟,樣品處理方法： a）管類和容器類器具用細菌內毒素檢查用水浸泡器具內腔，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，

10、取浸提液進行試驗； b）小型配件或實體類樣品置無熱源玻璃器皿內，加入細菌內毒素檢查用水振蕩數次，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進行試驗。 制備的供試液儲存不應該超過2h。一般要求供試液的PH值在6.08.0之間，如不在該范圍內，可用鱟試劑廠家提供的PH緩沖液調節浸提液的PH值。,實驗步驟,結果觀察,B、C溶液的反應管必須要陽性，就是輕輕倒轉180度過來，鱟試劑安瓿里的反應溶液形成了凝膠體，不滑落。 而D溶液，就是細菌內毒素檢查用水那2管，必須要陰性，3個條件都滿足，就說明試驗結果是可信的。最后看A溶液的反應情況： 陽性就說明原套器具每件大于20EU，判定為不合格； 陰性就說明小于

11、20EU,結果是合格的； 1管陽性、1管陰性則要重新復查，復試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性則判斷合格；否則判斷為不合格。,注意事項,1. 每批鱟試劑在用于試驗前首先要進行靈敏度的復核試驗； 2. 安瓿開啟前應先用砂石劃痕(不管是色點或包環易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬不能用鑷子敲擊，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時，取樣均應準確，緩緩加入避免氣泡。 4. 保溫過程中不可隨時取出觀察，防止形成的凝膠受到振動后變形而誤判為陰性。,注意事項,5. 凍干的鱟試劑應存放在2-8下；避免長時間放置在高于25的溫度條件下。已復溶的鱟試劑在間歇使用過程

12、中最好放在2-8的冰箱里，可存放24小時，在-20以下，可存放四個星期，鱟試劑只能凍融一次。,三、操作注意事項,試驗前準備： 1、玻璃器具應規范化，便于除熱原、計量準確、清洗操作方便。 洗凈 去污去內毒素 去洗滌劑 精洗 除外源性熱原：250 干烤至少1小時。 2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250 干烤至少1小時。 3、用于內毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內毒素。,實驗環境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內進行，保證環境溫度、濕度及通風穩定。 實驗人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 實驗過程： 1、內毒素工作標準品應嚴格按要求低溫保存；工作標準品開封后盡快使用且應一次性用完，不再保存。 2、溶解后的標準品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進一步稀釋時每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s。,振蕩前,振蕩后,內毒素分子在水溶液中的狀態,3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復、交叉使用。 4、鱟試劑復溶時應將檢查用水順著瓶壁加入，避免產生氣泡。 5、操作時間的長短。環境溫度