1、基于代謝控制育種技術選育深黃被孢霉-亞麻酸高產菌株郝冉，楚樂樂，胡申才*（武漢輕工大學生物與制藥工程學院，武漢，430023）摘要： 為了獲得深黃被孢霉合成-亞麻酸的高產菌株，本研究采用了紫外照射和氮離子注入技術2種誘變方法來建立突變體庫。然后，根據-亞麻酸代謝合成途徑中的部分關鍵因子，設計并建立起了抗丙二酸和紅四氮唑(TTC)篩選模型，該2種篩選模型分別旨在提高菌體生物量和不飽和脂肪酸含量。結果顯示，采用丙二酸濃度為2 g/L的平板可篩選得到高產油脂菌株；在發酵培養的第54 h時收集菌體，用0.9 % TTC染色4 h，可作為TTC法的最佳染色條件。經過兩輪不同方法的誘變篩選后，最終得到了一

2、株具良好遺傳穩定性的突變株I-0281，其GLA產量為889.80 mg/L，比原始菌株提高了60.27%。關鍵詞: -亞麻酸；菌種選育；篩選模型；抗丙二酸法；紅四氮唑法Screening of Mortierella isabellina mutants pertain to produce high-yield -linolenic acid by metabolic control breeding techniqueHao Ran, Chu Lele, Hu Shencai* (School of Biological and Pharmaceutical Engineering, W

3、uhan Polytechnic University, Wuhan, 430023) In order to obtain Mortierella isabellina mutants with the capability of high-yielding -linolenic acid, the mutant library was constructed by UV and N+ ions implantation technique, respectively. Then, according to some key enzymes involved in the metabolic

4、 synthetic pathway of -linolenic acid, the two screening models, anti-molonic acid and triphenyltetrazolium chloride (TTC), were designed and established, which are aimed to increase biomass or contents of unsaturated fatty acid. The results showed that the high-yield strains can be screened by resi

5、stant plate containing 2 g/L molonic acid; The TTC screening model was ascertained as collecting samples after fermenting for 54 h, stained 0.9 % by TTC for 4 h. Through 2 rounds screening via the two kinds of screening model, the I-0281 mutant strain was obtained, which has good genetic stability,

6、and also the production of -linolenic acid was up to 889.80 mg/L, 60.27% higher than the wild strain. Key words: -linolenic acid; strain breeding; screening model; anti-molonic acid method; TTC method -亞麻酸（GLA）及其系列代謝物在人體的免疫系統、心血管系統、生殖系統、內分泌系統和神經系統中都具有重要而廣泛的生理作用1,2。GLA在食品、保健品、醫藥品、化妝品和飼料等領域的應用也越來越廣泛，因

7、此目前市場對GLA的需求量也越來越大。 1959年，Qsbond首次用化學合成法制備-亞麻酸，但從其原料、所用試劑以及操作條件來看，這種方法有一定難度而未得到推廣應用。目前，商業化生產GLA的資源主要為植物，但自然界中富含GLA的植物資源較少，受植物來源、地域、生長季節氣候、加工生產成本等多因素影響，通過植物來生產GLA具有一定的局限性3,4。近年來發現利用微生物發酵生產GLA具有很大的潛力，為未來生產GLA的方向5。一般來說，野生菌株GLA產量不能夠滿足工業化生產的需求，需對菌的遺傳系統加以改造。囿于油脂微生物的遺傳信息不是很清楚，迄今為止還未能通過基因工程技術構建得到能夠滿足工業化生產GL

8、A的高產菌株6，因此通過誘變獲得高產GLA菌株是目前GLA育種的首選方法7。常規的誘變育種在育種上曾取得了巨大的成就，然而其篩選工作量大、且帶有很大的盲目性。迄今為止，GLA的生物合成途徑和關鍵合成酶都研究得比較清楚。因此本研究主要想通過利用GLA生物合成的生物化學和遺傳學原理，在了解生物代謝途徑和代謝調節控制理論的基礎上8，來定向選育某種特定的突變型以使菌體生產性能或目的產物得到提高。1 材料與方法1.1 菌種 深黃被孢霉（Mortierella isabellina）AS 3.3410，購于中國科學院微生物研究所。1.2 試驗方法1.2.1 紫外誘變加5 mL生理鹽水于深黃被孢霉斜面中，用

9、接種環輕輕刮取斜面上的孢子，再過濾到離心管中可得到孢子懸液。稀釋孢子懸液至104個/mL，取孢子懸液5 mL至平板中，將其置于磁力攪拌器上，距8 W紫外燈中心30 cm處，分別照射0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s、120 s，取原液和稀釋10倍的孢子懸液100 L孢子懸液分別涂布于YPD平板，培養3 d并計數，作誘變致死率曲線。1.2.2 氮離子注入誘變 （1）孢子平板的制備：向AS 3.3410試管斜面中加5 mL10 %甘油，接種環輕輕刮取斜面 孢子，過濾，10 %甘油稀釋至108-1010個/mL，取100 L涂布于無菌平板中，超凈工作臺風干

10、。 （2）離子注入：在離子注入頻率為25 HZ，靶室真空度為10-3 Pa的條件下，設置一系列不同劑量的氮離子來進行注入，對照組在離子注入時置于注入平板的下方（離子注入機為鄭州大學離子束生物工程實驗室提供）。 （3）涂布：取出平板，加2 mL生理鹽水，用橡皮塊擦洗平板底部的孢子，將平板底部的孢子洗脫，分別取稀釋倍數為100、101、102的孢子懸液100 L涂PDA平板，于28 培養2 d，計數并計算存活率。1.2.3 高產GLA菌株的篩選方法1.2.3.1 丙二酸篩選法 （1） 深黃被孢霉耐丙二酸濃度的確定試驗向冷卻至50-60 的100 mL的PDA培養基中分別加入500 g/L的丙二酸溶

11、液0 、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mL，倒平板后涂布菌液。28 培養箱培養3 d，觀察菌落生長狀況，確定合適的耐丙二酸篩選濃度。 （2）丙二酸篩選高產油脂菌株方法吸取誘變后的菌懸液涂布于含2 g/L 丙二酸的PDA平板，28 培養2 d。挑選菌落較大的菌株試管發酵，收集菌體，超聲波輔助提取法提取油脂，篩選油脂產量較高的菌株。1.2.3.2 TTC篩選法取發酵液150 L于96孔板中，加入50 L一定濃度的TTC，28 ，170 rpm搖床培養，再將孔板于酶標儀中振蕩后，測492 nm處的吸光值。 （1）染色時期的確定 發酵培養深黃被孢霉菌株，分別測培養時間為41、65、89、1

12、13、137、161、185、209和233 h時的生物量、油脂含量與脂肪酸組成。分析生物量和不飽和脂肪酸含量與培養時間之間的關系，以確定染色時期。 （2）TTC濃度和染色時間的確定按上述TTC法，所用紅四氮唑濃度分別為為0.1 %、0.3 %、0.6 %、0.9 %和1.2 %， 28 ，170 rpm染色培養時間分別為0、1、2、3、4、5、6和7 h，酶標儀振蕩30 min，吸取120 L上清液于空白孔中，測492 nm處吸光值。分別以染色培養時間（t）為橫坐標，不同濃度的紅四氮唑濃度染色后A492為縱坐標作圖。 1.2.4 氣相色譜檢測脂肪酸組成 （1）脂肪酸甲酯化：取0.3 g干菌體

13、于50 mL離心管中，加入4 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3，60 恒溫水浴30 min，加3 mL14 % BF3-CH3OH，室溫催化5 min，加2 mL正己烷，振蕩混勻，加10 mL蒸餾水，振蕩混勻，5000 rpm離心5 min，取上層正己烷層過濾。 （2）氣相色譜分析條件：色譜柱: 安捷倫DB-WAXer毛細管柱 （60 M0.53 mm I.D. 1.5 m）；檢測器：氫火焰離子化檢測器；氣化室溫度：250 ；檢測器溫度：250 ；柱溫：程序升溫：起始溫度140 ，保持2 min，以10 /min的升溫速率上升至160 ，保持3 min，2 /min的升溫速率上升至24

14、0 ，保持3 min。 （3）進樣分析：取1 L樣品進樣。 （4）脂肪酸組成分析方法：所得氣相色譜圖對照37種脂肪酸混合標準品圖譜定性分析，面積歸一化法確定各種脂肪酸所占百分比。2 結果與分析2.1 丙二酸篩選高產油脂深黃被孢霉菌株2.1.1 深黃被孢霉孢子紫外線誘變致死率的確定實驗 由圖1可知，紫外照射時間在 30 s 以內時，紫外線對深黃被孢霉影響不大；當照射時間大于30 s時，死亡率急劇增加，照射時間為75 s時，孢子死亡率已達到 90 %以上。由于致死率為70 %80 %時正突變率最高，因此，選用紫外線照射時間60 s作為紫外誘變處理時間。圖 1 深黃被孢霉紫外致死曲線2.1.2 丙二

15、酸篩選模型的建立丙二酸結構類似于琥珀酸，競爭性抑制琥珀酸脫氫酶，因此能夠抑制三羧酸（TCA）循環。丙二酸抗性菌株，三羧酸循環途徑比較強，具有較高的能量代謝，菌體生物量應該變大。將稀釋至一定濃度的孢子懸液涂布于一系列丙二酸濃度不同的平板，培養2 d，觀察菌落長勢如表1中所示，丙二酸濃度小于0.5 g/L時，對菌株沒有明顯抑制作用，當丙二酸濃度大于2.5 g/L時，菌株生長完全被抑制，因此選用丙二酸濃度為2 g/L的平板作為誘變后高產油脂菌株的篩選。表 1 不同濃度的丙二酸對深黃被孢霉菌落的抑制作用丙二酸濃度（g/L）00.511.522.5菌落長勢+/-2.13 丙二酸篩選高產油脂深黃被孢霉菌株

16、通過2 g/L丙二酸濃度的PDA平板對紫外照射獲得的突變體庫篩選后得到了8株油脂產量較高的突變株，傳代培養5代后最終確定出U-0116、U-0218、U-0230等3個高產油脂菌株，其與油脂合成相關的發酵參數如表2所示。氣相色譜分析其脂肪酸組成，因發現其生物量和GLA產量均顯著高于原始菌株，因此該突變菌株U-0116將用于后續的菌種選育工作。表 2 丙二酸篩選高產油脂深黃被孢霉突變株編號原始出發菌株U-0116U-0218U-0230生物量/（g/L）16.7119.86179218.51油脂含量/（g/L）60706562油脂產量/（g/L）10.0313.9011.6511.48油脂產量提

17、高率38.58 %16.15 %14.46 %GLA產量/（mg/L）554.14699.7633.74632.392.2 TTC法篩選高產GLA菌株2.2.1 TTC染色時期的確定圖2 生物量和單位菌體內不飽和脂肪酸含量隨發酵培養時間變化曲線 由圖2可知，在發酵前4 d，生物量增加迅速，在46 d生物量增加明顯減緩，在發酵7 d后，生物量基本不再增加，當發酵時間大于10 d，由于發酵液營養物質的利用和有害代謝產物的積累，生物量有下降趨勢。從單位菌體不飽和脂肪酸隨培養時間變化趨勢來看，選擇前7 d測較為合適。綜合以上兩點，為提高篩選效率以及準確性，選擇第5 d進行染色。2.2.2 TTC染色濃

18、度和染色時間的確定發酵培養至第5 d時，采用不同濃度TTC染色，A492隨時間變化曲線如圖3所示。由圖3可知，0.9 % TTC在7 h內染色效果均強于用0.1 %、0.3 %、0.6 %、1.2 %TTC的染色效果。這說明TTC濃度過高或過低均不利于染色，在低濃度TTC條件下，分子之間的碰撞幾率降低而降低染色速度，過高濃度TTC可能對細胞產生毒性而影響了脫氫酶活性。用0.9 %的TTC染色，在前4 h內，A492隨染色時間延長增加非常迅速，染色時間大于4 h時，A492隨時間變化趨于平緩。因此，選擇0.9 %的TTC染色4 h可作為染色的最佳條件。圖3 不同TTC濃度染色后A492隨時間變化

19、情況2.2.3 氮離子注入誘變條件的確定由圖4可知，致死率隨注入劑量的增大呈現先增大后減小再增大的趨勢，這與多人報道的離子注入誘變曲線呈“馬鞍型”相一致10,11。在上面的 6種誘變劑量中各隨機挑選出 25株，發酵測其GLA產量，統計誘變率，與U-0116對比GLA產量增加5 % 作為正突變計算，結果見表3，由表3可知，注入劑量為481014 ions/cm2時，正突變率達到最大，為36 %。在離子注入劑量誘變曲線上的峰值范圍內可以獲得較高的正突變率，這與余增亮，孟小琴等12的研究結果相一致，因此選擇離子注入劑量為481014 ions/cm2。表3 不同N+注入劑量下的正突變率注入劑量/（1

20、014ions/cm2）612244872致死率7591947297正突變率1216243616圖4 N+離子注入誘變曲線2.2.4 TTC法篩選高產不飽和脂肪酸深黃被孢霉菌株通過氮離子注入（能量30 KeV，頻率25 Hz，注入劑量481014 ions/cm2）菌株U-0116，經PDA平板分離共獲得78株菌，采用TTC法從中篩選獲得了9株脫氫酶活性較高的突變菌株，其脫氫酶活性如表4所示，特別是突變株I0274、I0281、I0291和I0314均較U-0116菌株提高了約20%以上。表4 TTC法篩選的各高產不飽和脂肪酸突變菌株的吸光值菌株編號U-0116I-0274I-0281I-02

21、87I-0292I-0295I-0305I-0306I-0313I-0314A4920.15020.19060.17930.16300.19700.16550.17330.17110.17120.18042.2.5 氣相色譜法復篩高產GLA深黃被孢霉菌株氣相分析這9株脫氫酶活性較高的菌株，結果如表5。由表5可知，這9株脫氫酶活性較高的菌株其不飽和脂肪酸組成均高于原始菌株，其中菌株I-0281、I-0314的GLA/TFA分別為6.700 %、6.509 %，比次出發菌株U-0116分別提高了24.51 %、20.99 %。而突變株I-0281具有良好的遺傳穩定性，其GLA產量為889.80 m

22、g/L，比原始菌株提高了60.27%。表5 深黃被孢霉各突變株菌體所含的不飽和脂肪酸與GLA占總脂肪酸含量菌株編號U-0116I-0274I-0281I-0287I-0292I-0295I-0305I-0306I-0313I-0314UFA/TFA（%）68.30170.83271.17871.77973.36572.33971.74771.90573.04372.093GLA/TFA(%)5.3816.0896.7006.0164.9845.4215.5695.7175.3906.5093 討論 GLA是一種多不飽和脂肪酸，生物合成機制比較復雜，從葡萄糖起始合成涉及20多步酶促反應。要想菌體

23、內大量產生GLA，關鍵在于能否打破微生物正常的代謝調節，因此應從增強目的產物的主代謝流，切斷支路代謝，解除菌體自身的反饋調節，增加前體物的合成及去除終產物等幾個方面入手。通過誘變技術得到突變菌株，有些突變菌株可能發生了上述幾種情況的變異，如何篩選得到不同特質的突變株，本研究著力于采用代謝控制育種技術來進行理性選育，以減少盲目性和提高目的性。本研究的研究思路一是從提高菌體內總體油脂含量入手，二是增強脂肪酸脫氫酶的脫氫能力。油脂是細胞內積累產物，生物量增大，有可能單位發酵體積內菌體的油脂量就增多。丙二酸作為呼吸抑制劑，在本實驗中發現丙二酸抗性菌株中的油脂總含量比原始菌株有大幅度提高，這應該與其有利

24、于菌體生長相關13。TTC法篩選目標主要是找到脂肪酸脫氫酶活力提高的菌株，因此應盡量減少除脂肪酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶以外的其它脫氫酶的干擾。TTC染色應選在生物量增長緩慢區：一是可以減少篩選大量菌株時，因加樣時間不同，菌體量變化而引起的測量誤差；二是可以減少在代謝旺盛時期其他脫氫酶如丙酮酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶等的干擾。本論文研究采用了不同誘變方法和篩選方法得到了U-0116等多株產量高于原始菌株30%以上的突變株，這些突變株分別具有生物量高、油脂合成量高或GLA合成能力強等不同特點。基因組改組（genome-shuffling）技術是近年來被開發應用于菌種改良非常成功的一種育種

25、技術14，而上述獲得的各突變株為我們下一步采用基因組改組技術來獲得集成各突變株優點于一身的高產優良菌株提供了親本菌株，有望為獲得更高產的菌株奠定堅實基礎。參考文獻1 周同永, 任飛, 鄧黎, 等. -亞麻酸及其生理生化功能研究進展J. 貴州農業科學, 2011, 39(3): 53-582 喬冬，龐永昌，李揚.-亞麻酸對小鼠免疫系統的調節作用J.食品科學，2011, 32 (21) : 247-2523 慕鴻雁，裘愛泳.-亞麻酸生理功能、資源及其分離純化J.糧食與油脂，2004, (10):12-144 李會珍,張志軍.植物合成長鏈多不飽和脂肪酸研究進展J.中國生物工程雜志，2008, 28(12): 112-1155 李忠玲, 岳淑寧, 王衛衛, 趙文娟, 任平, 徐霞美. 絲狀真菌發酵生產-亞麻酸的研究進展J. 微生物學雜志, 2008, 28: 94-976 CHEN R, SHINZO T, KEISUKE M, et al . Prod