羅氏(Roche)公司Tunel試劑盒操作說明書(In situ cell death detection kit-POD法)一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，后者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。二、 器材與試劑器材：光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含：1號（藍蓋）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10、 2號（紫蓋）Label Solution標記液：熒光素標記的dUTP 1、 3號（棕瓶）Converter-POD:標記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 l 20DAB+1L 30%H2O2+94 l PBS）、Proteinase K工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或細胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 檸檬酸鈉，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。三、 實驗步驟操作流程圖：制作石蠟切片脫蠟、水合細胞通透加TUNEL反應液加converter-POD與底物DAB反應顯色光學顯微鏡計數并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在2137C（溫度、時間、濃度均需摸索）如果凋亡細胞染色較弱時，可用高濃度的Proteinase K（400g/mL）處理5 分鐘。其它替代方法： 石蠟切片的預處理也可根椐實際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K 處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法 1: 將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）替代方法 2： 將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ）替代方法 3: 將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的檸檬酸緩沖液PH 6 的塑料盒中，置于微波爐中350W（低檔）處理5 min。5. PBS漂洗2次；6. 制備TUNEL反應混合液：處理組用50l 1號液+450l 2號液混勻；而陰性對照組僅加50l 2號液，陽性對照組先加入100l DNase 1，反應在152510min，后面步驟同處理組。7. 玻片干后，加50l TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50l 2號液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應371h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450500nm，檢測波長為515565nm）；10. 玻片干后加50l 3號液（converter-POD）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應3730min。11. PBS漂洗3次；12. 在組織處加50100l DAB底物，反應152510min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200500個細胞）并拍照?？山Y合凋亡細胞形態特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）對于培養細胞的預處理：在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸，干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4保存；適當方法誘導細胞凋亡，同時設未經誘導的對照組，各組離心收集約1106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛中固定25min；PBS浸洗二次，每次5min；將吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100中處理5min；PBS浸洗二次，每次5min；后續操作如同石蠟包埋切片的6-15四、 注意事項1. 進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。4. TUNEL反應液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。5. 如果20DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用8090%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。7. 2號液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20（-1525）；3號液（converter -POD）液一旦解凍，以后就保存在4（28）下，至少在6 m內穩定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好后，放至冰上直至使用。9. 結果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產生大量DNA片斷，從而引起假陽性結果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內反應，進而產生假陰性結果。現象可能原因建議非特異性染色TdT酶的濃度過高用TdT dilution buffer* 作12110稀釋TdT酶反應時間過長或TdT酶反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應時間，并確保TdT酶反應液能很好地覆蓋樣品。光照紫外線導致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸會導致樣本DNA的斷裂）嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑在固定組織時樣本DNA已斷裂（內源核酸酶的作用）確保樣品取樣后立即固定或通過肝靜脈灌注固定使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液采用推薦的固定液固定后某些核酸酶活性依然較高導致DNA斷裂用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉標記率低如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標記效率較低（因為在固定時染色質未能與蛋白質交聯，而在操作中丟失）用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。固定時間過長，導致交聯程度過高減少固定時間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定熒光淬滅Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅，需注意避光操作促滲條件不佳，以致于試劑不能到達靶分子或濃度過低1、 增加通透劑促滲時間2、增加通透劑的作用溫度（15-25）3、優化蛋白酶K的作用濃度和作用時間（如：以400ug/ml作用5min）4、0.1M的檸檬酸鈉70作用30min。熒光背景很高支原體污染請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染TdT酶的濃度過高或反應時間過長用TdT dilution buffer* 作12110稀釋或注意控制反應時間紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。陽性對照沒有信號DNase I的濃度過低1、 冷凍切片使用3u/ml的DN