第四章動物細胞培養,1,動物的細胞和組織培養：從動物體內取出組織或細胞，模擬機體內生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養條件等，使之生長和生存，并維持其結構和功能的技術。,2,4.1培養細胞的生物學特征,4.1.1體外培養細胞的分型按生長方式分為3型：貼壁型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，在懸浮狀態下即可生長的細胞。半貼壁型細胞,3,（一）貼附型細胞：大多數培養細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞貼附:是大多數有機體細胞在體內生存和生長發育的基本存在方式結果:基于貼附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織，有機體的絕大多數細胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。培養時：這些細胞被放到體外環境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞,細胞在體內、外的貼附方式存在差異體內：貼附是全方位,外形具有復雜的立體特征體外：多數情況，細胞只有一個附著平面，外形一般與體內時明顯不同貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養細胞的主要形態，可分為四大類型,1、成纖維細胞型：,名稱：成纖維細胞來源：由中胚層間充質組織起源的組織真正的成纖維細胞：心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮形態：似體內成纖維細胞的形態，胞體梭形或不規則三角形，胞質向外伸出23個長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細胞-細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起,2、上皮細胞型,名稱：僅形態上似體內，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態：類似體內的上皮細胞，扁平，不規則多角形，中有圓形核生長特點：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動,3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規則。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區別。4、多形型細胞：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。,（二）懸浮型細胞：見于少數特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。來源：血，脾或骨髓，血中白細胞癌腫細胞特點：在懸浮中生長良好，細胞圓形、單個或小細胞團優點：生存空間大，提供數量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩定狀態缺點：純化不方便，不能通過離心將死、活細胞分離,4.1.2培養細胞的生長特點1.貼附貼壁伸展影響因素：鈣離子機械、物理因素生物因素,13,細胞貼壁過程,15,2.接觸抑制細胞接觸停止移動正常細胞成單層生長腫瘤細胞無接觸抑制，可以堆積生長。接觸抑制可作為區分正常細胞與癌細胞的標志之一,16,3.密度抑制細胞增殖，密度加大，培養液營養成分消耗，細胞代謝物增多，導致發生密度抑制，細胞分裂停止,4.1.3培養細胞的生長和增殖過程,（一）單個細胞的生長過程（二）細胞系的生長過程（三）每代細胞的生長過程,（一）單個細胞的生長過程,細胞周期：一個母細胞分裂結束后形成的細胞到下一次再分裂結束形成兩個子細胞的時期。,（二）細胞系的生長過程,培養細胞的生命期：是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。包括原代培養期、傳代期及衰退期。,細胞的生長曲線,1原代培養期：從體內取出組織,接種培養到第一次傳代階段（初代培養）特點：1-4周、細胞呈活躍的移動、可見細胞分裂、形態結構和功能活動上與體內原組織相似性大、多呈二倍體核型細胞群是異質的，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。,2傳代期：初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期的持續時間最長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。一般情況下當傳代1050次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。,3衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點，由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性。,細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續細胞系。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。,（三）每代細胞的生長過程,所謂細胞的“一代”是指從細胞接種到分離再培養的一段時間。這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代或倍增不同；在細胞一代中，細胞能倍增36次。,細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：潛伏期指數生長期停止期,26,1潛伏期,游離:懸浮,胞質回縮,全部細胞變為圓球形吸附:貼附底物,一般24小時內貼壁潛伏:可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相,2指數生長期：細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。細胞活力最旺盛的階段，培養物中細胞數量呈指數增長,細胞群體均一，是理想的實驗用細胞,接觸抑制：細胞運動停止密度抑制：細胞終止分裂,3停止期：細胞數量達飽和密度后，細胞停止增殖，進入停止期，也稱平臺期。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養即傳代，否則細胞會中毒，發生形態改變，重則從底物脫落死亡,潛伏期,指數生長期,停止期,4.1.4培養細胞的遺傳學特征,（一）染色質與染色體：正常細胞：二倍體細胞發生轉化：多倍體或異倍體（二）細胞性別女性：Barr小體男性：Y小體,4.1.5體內外細胞的差異及培養細胞的分化,經多次傳代增殖后，培養細胞將失去原有的組織結構和細胞形態，分化逐漸減弱或不顯。形態與功能逐漸單一化，細胞衰老或死亡，或發生轉化，獲得不死性或惡性性。,4.2細胞培養液,4.2.1細胞培養常用液體1.水三蒸水、純水2.平衡鹽溶液（BSS）由生理鹽水發展而來，由無機鹽和葡萄糖配制而成?？删S持滲透壓、調節pH值、供給細胞生存所需的能量和無機離子。主要用于合成培養基的基礎液和洗滌組織、細胞等。Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液。,33,34,3.消化液胰蛋白酶EDTA-Na溶液膠原酶4.消化酶抑制液：用于終止消化酶的作用血清大豆胰酶抑制劑,35,5.培養基pH調整液：常用的有：3.7、5.6、7.4的NaHCO3溶液和HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）等。6.抗生素液：青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素7.谷氨酰胺補充液：谷氨酰胺在合成培養基中必須添加，它不穩定，需及時補充。,36,4.2.2培養基1.培養基的基本要求按照來源分：天然培養基合成培養基無血清培養基,37,1.天然培養基,天然培養基：直接取自動物體液或從組織中提取的天然成分作培養液，但成分復雜，來源有限。（1）血清：血漿去除纖維蛋白所得。營養豐富，其中溶有多種物質，如無機鹽離子、蛋白質及氨基酸、糖類（如葡萄糖等）、脂類、激素、固醇、抗體、維生素等。血清由于營養豐富，且含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質，能使細胞順利增殖生長，應用最廣。缺點是組成復雜，使培養結果不穩定。常用新生犢牛血清和胎牛血清。,38,（2）胚胎提取液：雞胚、牛胚提取液，能促進細胞生長。來源有限。不常用。（3）水解乳白蛋白：是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解后的產物，含豐富氨基酸。用Hanks液配制成0.5%溶液，與合成培養基按比例混合使用。多用于細胞系和原代細胞的培養。（4）膠原：膠原是從動物真皮或大鼠尾腱中提取的，具改善細胞表面特性促使其附著生長的作用。,39,2.合成培養基,合成培養基是用化學物質人工模擬合成，種類相當多。合成培養基成分已知，便于對實驗條件的控制。但與天然培養基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代，因此，細胞培養中使用的基礎合成培養基還必須加入一定量的天然培養基成分，以克服合成培養基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清，稱為完全培養基?；九囵B基，如109培養液、DMEM、TC199、RPMI-1640、MEM培養液等。,40,合成培養基的組成：（1）氨基酸：氨基酸是細胞合成蛋白質的基本成分，12種必須氨基酸必須由培養液提供。需加一定量的谷氨酰胺。（2）維生素：包括水溶性和脂溶性兩類。一般由血清供應。（3）無機離子：包括大量和微量無機離子，通常也可由血清提供。（4）碳源：以葡萄糖為主。（5）其他：嘌呤、嘧啶、輔酶及抗氧化劑等。,41,動物血清成分復雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未明確，后期對培養產物的分離、提純以及檢測會造成一定困難。另外高質量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。,3.無血清培養基,42,無血清培養基不加動物血清，一般由基礎培養液和替代血清的添加成分（細胞生長有效因子，激素等）兩部分組成。可保證實驗結果的準確性和穩定性。但成本較高，針對性較強，一種無血清培養基只適用于某一類細胞的培養。主要用于：研究細胞生長因子、單克隆抗體的制備、以及細胞分泌產物研究,43,（1）基礎培養液根據不同培養細胞選擇合適的合成培養基作為基礎培養基。常用DMEM和F12以1：1比例混合作為基礎培養基，用NaHCO3或HEPES溶液調整pH。,44,（2）補充成分激素和生長因子：激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、增殖刺激因子、類胰島素生長因子等。主要是刺激生長，維持細胞功能的作用。結合蛋白和轉運蛋白：主要是轉鐵蛋白（增強細胞攝取培養基中鐵的能力，可螯合痕量有害金屬離子）和白蛋白（參與運載一些脂類、金屬離子等，也有螯合過量微量元素的作用）兩種蛋白。,45,貼壁和鋪展因子：幫助細胞貼壁和鋪展。如纖黏蛋白、血清鋪展因子、膠原等。微量元素和低分子量營養因子：硒元素、丁二胺、亞油酸等。酶抑制劑：常用大豆胰酶抑制劑。,46,47,影響動物細胞培養的因素,（1）溫度：哺乳動物最適溫度36.50.5；對低溫耐受性比高溫強。（2）pH：7.27.4之間。低于6.8或高于7.6細胞生長受到影響，甚至死亡。偏酸性耐受較強，偏堿性很快死亡。（3）氣體：O2；CO2，還可調節pH。（4）滲透壓：不同細胞要求不同。,48,4.3細胞的基本培養技術,定義動物細胞培養：就是將動物組織或細胞從機體中取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內的生長環境，使其在體外繼續生長和增殖的技術。體外培養可分為原代培養和傳代培養。,49,動物細胞體外培養的特點:,大多數須附著在固體或半固體的表面才能生長。對于營養要求苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清。對培養環境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都需嚴格監控。生長緩慢，培養時間長，培養代價大污染問題難以控制。,動物細胞的培養過程,幼齡動物,取動物器官和組織,剪碎組織,胰蛋白酶處理,細胞培養,單個細胞,動物細胞培養技術是動物細胞工程技術的基礎,轉入培養液中進行原代培養,4.3.1原代培養原代培養：從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。特點：原代細胞剛剛離體，生物學特性未發生大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反應生物體內生長特性，是藥物檢測、細胞分化的很好實驗工具。原代細胞通常由多種細胞組成（異質性），細胞獨立生存性差,53,過程,組織取材,組織細胞的分離,培養,機械法,消化法,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,細胞懸液,胰蛋白酶,1代細胞,原代培養,傳代培養,無限傳代,單個細胞,加培養液,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,（一）組織取材1.雞胚組織：用于病毒與疫苗研究,56,2.鼠胚組織：與人最相近的哺乳動物組織，取材方便，易于培養。,57,機械法分離胚胎,3.皮膚和粘膜：多來源于手術，需嚴格消毒以消滅細菌霉菌。4.血細胞：靜脈取血、指尖或耳垂取血。加肝素抗凝劑防止凝血。5.內臟和實體瘤：主要源于外科手術和活檢組織。,59,60,（二）組織細胞的分離有機械法和消化法兩大類1.機械法：離心分離法：適用于細胞懸液組織。500-1000rpm離心5-10min。切割分離法：用剪刀剪切成1mm3左右的小塊。機械分散法：擠壓和研磨，適用于纖維含量少的組織。,61,（二）組織細胞的分離2.消化法：可使組織疏松，細胞分開，細胞容易生長，成活率高。胰蛋白酶消化法：適于消化細胞間質較少的軟組織，對傳代細胞也適用。使用濃度一般為0.1%-0.5%，用不含鈣、鎂離子的BSS配制，PH8-9。血清有抑制其活性作用。胰蛋白酶消化法有熱(37)和冷(4)兩種處理。,63,膠原酶消化法：膠原酶是由細菌中提取出的酶，適用于消化纖維組織、上皮組織或膠原成分的組織。可用含鈣、鎂離子的BSS配制或溶于含血清的培養液中。使用濃度一般為0.1-0.3mg/mL，37溫育。優點：消化緩和、無需機械振蕩缺點：價格昂貴可與胰蛋白酶混用,64,其他消化酶消化法：鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、透明質酸酶等。螯合劑消化法：常用螯合劑有檸檬酸鈉、EDTA-Na2等?？捎貌缓}、鎂離子的BSS配制成0.02%溶液。EDTA適于消化傳代細胞，不受血清抑制，消化后需徹底清洗。,65,（三）培養方法1.組織塊培養法：簡便，成功率較低,2.單層細胞培養法:將解離得到的細胞用培養液配制成一定密度的細胞懸液，接種培養。3.懸浮細胞培養法：指細胞懸浮在培養液中生長增殖的培養方法。少數動物細胞（血液和淋巴組織細胞等非貼壁動物細胞）可懸浮生長，采集組織分散、過濾、離心、純化、漂洗后接種培養。,4.3.2傳代培養傳代培養：從原代培養的細胞繼續轉接培養稱為傳代培養。動物細胞培養類型:非貼壁培養：也叫懸浮培養。用于血液白細胞、淋巴組織細胞、某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等的培養，可在培養液中懸浮生長。貼壁培養：大多數動物細胞需貼附于帶適量正電荷的固體或半固體表面進行培養。,67,68,貼壁生長細胞的傳代（消化法）：要求細胞覆蓋80%以上吸出舊的培養液。用不含鈣、鎂離子的BSS溶液清洗。加入0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液解離細胞。2-5min檢查，如有細胞間隙變大，加入蛋白酶抑制劑或血清培養液終止消化。離心，棄上清液，加入Hanks液漂洗兩次。吸管輕輕吹打，加入新鮮培養液，制成懸液，計數并調整其密度。重新接種培養。,2.半懸浮生長細胞的傳代消化法或直接吹打法3.懸浮生長細胞傳代離心法：培養物轉移到離心管，1000r/min離心。棄上清液，沉淀細胞加新培養液混勻傳代。,4.3.3常用培養技術1.懸滴培養：又稱植塊懸滴培養法，1907年由哈里森首創。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養液，然后翻轉蓋玻片使植塊及營養液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養箱中培養。優點：1）容易換片。2）培養物在培養過程中，不需移動位置，有利于組織分化。,72,2.培養瓶培養：指將培養對象直接接種于培養瓶內培養。1923年，卡雷爾（Carrel）設計了卡氏瓶。采用的材料對細胞無毒，透明,懸浮細胞培養瓶,滾動培養瓶,貼壁細胞培養瓶,蓋玻片+培養瓶培養法：先以蓋玻片為生長表面，將擬培養細胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進培養瓶中進行培養。優點：1）可以避免培養瓶表面粗糙等原因對培養物的影響2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存3）增加了培養瓶培養面積。,3.旋轉管培養：蓋爾（Gey，1933年）、劉易斯（Lewis，1934年）建立該方法。特點：是培養中組織塊或細胞交替地與培養液和空氣直接接觸，有利于物質交換和細胞生長。缺點：不易在顯微鏡下觀察。,77,78,4.克隆培養法：又稱單細胞分離培養法，就是將細胞懸液中獲得的單個細胞用于培養，使之重新繁殖成一個新的細胞群體的培養技術。,細胞株:由細胞系進一步克隆化，而獲得的由單一細胞形成的細胞群體。,初代細胞和有限細胞系的克隆培養比較困難，無限細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞等則比較容易,提高克隆形成率的措施：合理安排接種的密度（10個細胞/ml）使用克隆培養基（Ham12K培養液）使用同源細胞的條件培養液在培養中加入胎牛血清或其他添加劑、激素和生長因子將祖細胞接種到飼養細胞層或其他可適應的生長基質表面,79,條件培養液：已經培養過某種細胞的培養液（內含該細胞分泌的活性物質，包括少量生長因子）與一定比例新鮮培養液混合的培養液?？纱龠M與支持其他種細胞的生長。飼養細胞：也稱滋養細胞，是一層經過射線照射或裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他細胞附著的細胞層。能促進克隆細胞的生長，利于克隆的形成。,80,克隆培養技術：1.稀釋鋪板法2.飼養層克隆法3.膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法4.瓊脂克隆法5.多孔塑料培養板單細胞克隆法,81,82,5.細胞同步化培養：用自然的或人工的方法獲得細胞周期同步化的細胞群體。,篩選同步化細胞,誘導同步化細胞,M期細胞震蕩脫落法,離心洗脫法,梯度沉降法,血清饑餓法,異亮氨酸營養缺乏法,DNA合成抑制劑阻斷法,秋水仙素阻斷法,6.動物細胞的大規模培養,分批式操作,流加式操作,半連續式操作,連續式操作,灌流式操作,優點：操作簡單，培養周期短，污染和細胞突變的風險小。缺點：費用高，每一次收液后，都要進行一系列新的接種放大的準備工作，此期間生產停工。而且收液率低.,優點：生產效率高，可反復長期培養，反復收獲產品。,優點：反應器的培養狀態可以達到恒定，細胞在穩定的狀態下生長。缺點：開放式操作，容易造成污染。細胞容易發生變異，且對設備等要求高。,優點：培養狀態恒定，細胞在穩定的狀態下生長。產量高等.,6.動物細胞的大規模培養,4.4細胞系和細胞株的建立,85,細胞系：原代培養物開始第一次傳代培養后的細胞稱為細胞系。分為有限細胞系、無限細胞系。細胞株:由細胞系進一步克隆化，而獲得的由單一細胞形成的細胞群體。,二倍體細胞：細胞群染色體數目與原供體二倍細胞染色體數相同或基本相同（2n細胞占75或80以上）的細胞群。如僅數目相同，而核型不同的即染色體形態有改變者為假二倍體。為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種。遺傳缺陷細胞：從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養的細胞，或用人工方法誘發突變的細胞，都屬遺傳缺陷細胞。這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,86,腫瘤細胞系或株：是現有細胞系中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,87,細胞系或細胞株的命名,HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3105細胞mL。,細胞系或株的鑒定、管理和使用,ATCC入庫細胞要求檢測項目如下：培養簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態、細胞已傳代數等凍存液：培養基和防凍液名稱細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性培養液：培養基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、