專題4生物技術在其他方面的應用 一 DNA的粗提取與鑒定1 提取原理DNA與雜質的 不同 DNA與雜質對酶 高溫 洗滌劑的 不同 溶解度 耐 受性 2 提取DNA的具體步驟 1 實驗材料的選取 本實驗用 細胞做實驗材料 2 破碎細胞 釋放DNA 利用血細胞 的原理 注意玻璃棒的 向攪拌 過濾取濾液 3 溶解細胞核內的DNA 在高濃度的NaCl溶液中 核蛋白容易集聚 游離出的DNA溶解 4 DNA的析出 加蒸餾水降低NaCl溶液濃度 使DNA 5 DNA的初步純化 將DNA絲狀物再溶解 過濾 向濾液中加入體積分數為95 的 溶液進行提純 3 DNA的鑒定DNA在 的條件下 與 呈 色 雞血 吸水漲破 單 析出 冷酒精 沸水浴 二苯胺 藍 二 血紅蛋白的提取和分離實驗1 常用的分離方法 法 凝膠電泳法等2 基本原理 1 凝膠色譜法的原理 相對分子質量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙 路程 流動 相對分子質量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部 路程 流動 2 凝膠電泳法的原理 不同蛋白質的帶電性質 形狀和 不同 在電場中受到的作用力大小 阻力不同 導致不同蛋白質在電場中的運動 和運動 不同 凝膠色譜 短 快 長 慢 電量 大小 方向 速度 方向 3 血紅蛋白的提取和分離程序 1 樣品處理 紅細胞的洗滌 的釋放 分離血紅蛋白溶液 2 粗分離 除去樣品中相對分子質量較 的雜質 3 純化 一般采用 法對血紅蛋白進行分離和純化 4 純度鑒定 一般用 法來測定蛋白質的相對分子質量 即對血紅蛋白進行純度鑒定 血紅蛋白 透析 小 凝膠色譜 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 點撥 提純出的DNA的鑒定還可用甲基綠染色的方法進行 甲基綠可將DNA染成綠色 DNA聚合酶不能從頭合成DNA子鏈 只能從引物的3 端開始延伸 從子鏈的5 端開始合成 引物的3 端與子鏈的5 端交匯于一點 屬于對模板和產物的描述 兩種說法都正確 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳實質上測定的是組成蛋白質的多肽鏈的相對分子質量 電泳后形成的兩條或多條帶并不一定是雜質 如血紅蛋白由兩條 鏈和兩條 鏈組成 本身就會形成兩條帶 DNA和蛋白質技術1 DNA與蛋白質在不同NaCl溶液中溶解度不同 2 分離DNA和分離蛋白質的比較 3 血紅蛋白的提取和分離方法 1 凝膠色譜法 含義 根據相對分子質量的大小分離蛋白質的方法 原理 a 相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道 路程較長 移動速度較慢 b 相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道 只能在凝膠外部移動 路程較短 移動速度較快 2 電泳法 含義 帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程 原理 利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異和分子本身大小 形狀不同 使帶電分子產生不同的遷移速度 從而實現樣品中各種分子的分離 3 緩沖溶液 組成 1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 作用 在一定范圍內抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響 維持pH基本不變 確保實驗室條件下能準確模擬生物體內的代謝過程 高考警示鐘 比較瓊脂糖凝膠電泳和SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 從載體上看 利用瓊脂糖凝膠作為載體的是瓊脂糖凝膠電泳 利用SDS 聚丙烯酰胺凝膠作為載體的是SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 2 從依據上看 利用了分子帶電性質差異和分子大小的是瓊脂糖凝膠電泳 僅利用了分子大小的是SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 3 從優點上看 瓊脂糖凝膠電泳操作簡單 電泳速度快 樣品不需處理 電泳圖譜清晰 分辨率高 重復性好 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了凈電荷對遷移率的影響 使電泳遷移率完全取決于分子的大小 典例訓練 2010 江蘇高考 某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關探究活動 具體步驟如下 材料處理 稱取新鮮的花菜 辣椒和蒜黃各2份 每份10g 剪碎后分成兩組 一組置于20 另一組置于 20 條件下保存24h DNA粗提取 第一步 將上述材料分別放入研缽中 各加入15mL研磨液 充分研磨 用兩層紗布過濾 取濾液備用 第二步 先向6只小燒杯中分別注入10mL濾液 再加入20mL體積分數為95 的冷酒精溶液 然后用玻璃棒緩緩地沿一個方向攪拌 使絮狀物纏繞在玻璃棒上 第三步 取6支試管 分別加入等量的2mol LNaCl溶液溶解上述絮狀物 DNA檢測 在上述試管中各加入4mL二苯胺試劑 混合均勻后 置于沸水中加熱5min 待試管冷卻后比較溶液顏色的深淺 結果如下表 注 越多表示藍色越深 分析上述實驗過程 回答下列問題 1 該探究性實驗課題名稱是 2 第二步中 緩緩地 攪拌是為了減少 3 根據實驗結果 得出結論并分析 結論1 與20 相比 相同實驗材料在 20 條件下保存 DNA的提取量較多 結論2 針對結論1 請給出合理的解釋 4 氯仿密度大于水 能使蛋白質變性沉淀 與水和DNA均不相溶 且對DNA影響極小 為了進一步提高DNA純度 依據氯仿的特性 在DNA粗提取第三步的基礎上繼續操作的步驟是 然后用體積分數為95 的冷酒精溶液使DNA析出 解析 本題主要考查的是實驗探究的能力 包括明確實驗課題 處理和解釋實驗步驟 設計可行的實驗步驟等 1 據題意 該探究實驗的自變量有實驗材料的種類和溫度 因變量為DNA提取量 則該探究性實驗課題名稱是探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響 2 攪拌過程中常常會發生DNA的斷裂 因而該步驟需要 緩緩地 進行 3 據表分析不同自變量條件下的因變量情況 則可得結論2 等質量的不同實驗材料 在相同的保存溫度下 從蒜黃中提取的DNA量最多 低溫能使DNA酶的活性受到抑制 從而降低了DNA的降解速率 使DNA提取量增多 4 根據氯仿的理化性質 可采用氯仿與提取液混合 然后吸取上清液 答案 1 探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響 2 DNA斷裂 3 等質量的不同實驗材料 在相同的保存溫度下 從蒜黃中提取的DNA量最多 低溫抑制了相關酶的活性 DNA降解速度慢 4 將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混合 靜置一段時間 吸取上清液 變式訓練 2011 江蘇高考 在利用雞血進行 DNA的粗提取與鑒定 的實驗中 相關敘述正確的是 A 用蒸餾水將NaCl溶液濃度調至0 14mol L 濾去析出物B 調節NaCl溶液濃度或加入木瓜蛋白酶 都可以去除部分雜質C 將絲狀物溶解在2mol LNaCl溶液中 加入二苯胺試劑即呈藍色D 用菜花替代雞血作為實驗材料 其實驗操作步驟相同 解析 選B A項 用蒸餾水將NaCl溶液濃度調至0 14mol L 使DNA析出 B項 NaCl溶液濃度為2mol L 過濾除去不溶的雜質 木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質 C項 在沸水浴的條件下 DNA遇二苯胺會被染成藍色 D項 如果實驗材料是植物細胞 需要先用洗滌劑溶解細胞膜 1 下列關于DNA的粗提取實驗和血紅蛋白的提取實驗 敘述正確的是 A 前者選擇雞血細胞作為材料較好 后者選擇哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料較好B 樣品預處理時 前者靜置1天處理除去上清液 后者需要加入清水 反復低速短時間離心洗滌 至上清液無黃色C 在DNA粗提取實驗中 往2mol L氯化鈉溶液中加入蒸餾水析出DNA時 應該緩慢加入 直到出現黏稠物為止D 洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖 無機鹽等 解析 選A 本題考查了實驗材料的選取與實驗操作過程 雞血細胞有細胞核 適于提取DNA 哺乳動物成熟紅細胞無細胞核和眾多細胞器 適于提取血紅蛋白 提取血紅蛋白的實驗中 洗滌紅細胞時 不能加清水 應該加入生理鹽水 否則細胞提早釋放出血紅蛋白與雜質混合 加大提取難度 DNA初次析出時 加清水至黏稠物不再增加為止 洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白 以利于血紅蛋白的分離和純化 2 2012 鎮江模擬 已知某樣品中存在甲 乙 丙 丁 戊五種蛋白質分子 分子大小 電荷的性質和數量情況如圖所示 下列有關蛋白質分離的敘述正確的是 A 若將樣品以2000r min的速度離心10min 分子戊在沉淀中 則丙也一定在沉淀中B 若用凝膠色譜法分離樣品中的蛋白質 則分子甲移動速度最快C 將樣品裝入透析袋中透析12h 若分子丙保留在袋內 則乙也一定保留在袋內D 若用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質分子 則分子甲和分子丁形成的電泳帶相距最遠 解析 選A 分子丙的相對分子質量大于戊 所以 在離心時分子戊若在沉淀中 丙也一定在沉淀中 A項正確 用凝膠色譜法分離蛋白質時 甲相對分子質量最小 容易進入凝膠內部 則移動速度最慢 B項錯誤 分子丙的相對分子質量大于乙 若丙保留在袋內 乙可能在袋外 C項錯誤 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳時蛋白質的遷移速度取決于分子的大小 因此 分子甲與丙形成的電泳帶相距最遠 D項錯誤 3 將經處理破裂后的紅細胞混合液以2000r min的速度離心10min后 離心管中的溶液分為4層 從上到下的順序依次是 A 血紅蛋白 甲苯層 脂類物質層 沉淀層B 甲苯層 沉淀層 血紅蛋白 脂類物質層C 脂類物質層 血紅蛋白 甲苯層 沉淀層D 甲苯層 脂類物質層 血紅蛋白 沉淀層 解析 選D 混合液經離心后 按密度大小排列 在離心管中從上到下的順序依次是 第1層為無色透明的甲苯層 第2層為白色薄層固體 是脂溶性物質的沉淀層 第3層為紅色透明液體 這是血紅蛋白的水溶液 第4層為暗紅色沉淀物 主要是紅細胞破碎物沉淀 4 下列敘述中錯誤的是 A 改變NaCl溶液的濃度只能使DNA溶解而不能使其析出B 在沸水浴中 DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色C 用電泳法可分離帶電性質 分子大小和形狀不同的蛋白質D 用透析法可去除蛋白質樣品中的小分子物質 解析 選A 在不同濃度的氯化鈉溶液中DNA的溶解度不同 在0 14mol L的氯化鈉溶液中溶解度最小 DNA析出 呈絲狀 過濾后存在于黏稠物中 在2mol L的氯化鈉溶液中溶解度最大 所以DNA呈溶解狀態 過濾后存在于濾液中 5 2012 蘇州模擬 關于紅細胞的洗滌過程的敘述正確的是 A 低速長時間離心 如500r min 12min 以保證達到很好的分離效果B 離心后用膠頭吸管吸出下層透明的紅色血漿C 將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯 再加入五倍體積的蒸餾水D 直至上清液中沒有黃色 表明紅細胞已洗滌干凈 解析 選D 紅細胞洗滌過程中 應做低速短時間離心 以避免白細胞 淋巴細胞等一同沉淀 影響血紅蛋白的提純 離心后血漿在上層 并呈現黃色 洗滌紅細胞時應用生理鹽水而不用蒸餾水 否則 將導致紅細胞破裂影響實驗結果 因此A B C均錯誤 6 多選 2012 鎮江模擬 下列DNA粗提取的實驗操作中 經過離心或過濾后 取上清液或濾液的有 A 在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉 混合均勻后離心B 在盛有血細胞的塑料燒杯中加蒸餾水 快速攪拌后過濾C 在2mol L的氯化鈉溶液中放入絲狀物 輕輕攪拌后過濾D 在溶有DNA的氯化鈉溶液中緩緩加入蒸餾水 輕輕攪拌后過濾 解析 選B C 檸檬酸鈉能夠防止血液凝固 新鮮雞血經過離心后 上清液中血細胞較少 在血細胞中加入蒸餾水 細胞吸水而漲破 DNA在濾液中 含有DNA的絲狀物溶于2mol L的氯化鈉溶液中 則DNA在濾液中 當氯化鈉溶液濃度為0 14mol L時 DNA溶解度最低而析出 雜質在濾液中 7 2012 廣州模擬 某生物興趣小組在 蛋白質的提取和分離 實驗中 準備從豬的血液中初步提取血紅蛋白 設計的 血紅蛋白提取 分離流程圖 如下 請回答下列有關問題 1 樣品處理中紅細胞的洗滌要用 反復沖洗 離心 向紅細胞懸液中加入一定量的低濃度pH 7 0的緩沖液并充分攪拌 可以破碎紅細胞 破碎細胞的原理是 2 血紅蛋白粗分離階段 透析的目的是 若要盡快達到理想的透析效果 可以 寫出一種方法 3 電泳利用了待分離樣品中各種分子的 等的差異 而產生不同遷移速度 實現各種分子的分離 4 一同學通過血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳 觀察到正常人和鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白電泳結果如圖所示 由圖可知攜帶者有 種血紅蛋白 從分子遺傳學的角度作出的解釋是 解析 1 洗滌紅細胞所用的溶液是生理鹽水 根據滲透作用原理 將紅細胞置于低滲溶液中 紅細胞會吸水漲破 釋放出血紅蛋白 2 血紅蛋白粗分離階段 透析的目的是除去樣品中的小分子雜質 可通過增加緩沖液的量或及時更換