PCR聚合酶鏈式反應：聚合酶鏈式反應,又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。反應體系與反應條件標準的PCR反應體系： 10擴增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10100pmol 模板DNA0.12ug TaqDNA聚合酶2.5u/ul Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)標準的PCR過程分為三步： 1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25-65）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。 3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。 每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60-65間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。實時定量PCR定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術是一種在PCR反應體系中加入熒光基團利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。閾值：在熒光的增長曲線上人為地設定一個值。標準偏差： (Std Dev) -統計學名詞。一種量度數據分布的分散程度之標準，用以衡量數據值偏離算術平均值的程度。標準偏差越小，這些值偏離平均值就越少，反之亦然。標準偏差的大小可通過標準偏差與平均值的倍率關系來衡量。標準偏差公式：本底：本底值是指沒有進樣時檢測器的信號值.本底值大小和檢測器類型有關。熒光域值（threshold）：以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。Ct值：值得是實時監測擴增過程的熒光信號達到指數擴增是的循環周期數。計算方式是以擴增過程前的3到15個循環的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環數則為閾值循環數（ct）.Ct值與樣本中的原始拷貝數成正比關系。絕對定量：是使用一系列稀釋的已知濃度的標準品與臨床標本同時進行測定，根據系列濃度標準品的ct值與騎士模板（RNA或cDNA）量之間的線性比例關系，繪制標準曲線。可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度。相對定量：在相對定量中，標本中特定mRNA的測定時建立在外標或參比樣本（校準品）的基礎上的。當使用校準品的時候，定量測定結果可表示靶RNA/校準品比值。保準品（standard）：用來構建標準曲線的已知濃度的樣本。Taqman探針是RNA探針。TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5末端，而淬滅劑則在3末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。常用的熒光基團是FAM，TET，VIC，HEX。 而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。FAM是常用的熒光基團，連接在Taqman探針的5末端TaqDNA聚合酶：從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus（ Taq ）中分離出的具有熱穩定性的DNA 聚合酶。對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。與一般酶不同,用Taq酶擴增DNA時常使片段3端凸出一個A,應注意.可在74復制DNA，在95仍具有酶活力。該酶可在離體條件下，以DNA為模板，延伸引物，合成雙鏈DNA。這個酶只有53DNA聚合酶活性和53的外切酶活性，缺少35的外切酶活性。TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.70.8mmol/L時，用不同濃度Mg2+進行 PCR反應10min，測定結果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過高就抑制酶活性，當Mgcl2濃度在 10mmol/L時可抑制4050%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結合而影響PCR反應液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應體系中應適當調整，優化濃度.一般反應 中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.51.0mmol/L.適當濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時明顯抑制該酶 的活性PCR buffer：是PCR反應的緩沖液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。一般常用的10*PCR buffer的成分為：Tris-HCl pH8.5100mM、KCl 500nM、MgCl2 15nM質粒：質粒是細菌擬核裸露DNA外的遺傳物質，為環形閉合的雙股DNA,存在于細胞質中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。質粒的復制和轉錄要依賴于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質，如離開宿主細胞則不能存活。F質粒(又稱F因子或性質粒)、R質粒(抗藥性因子)和Col質粒(產大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。陽性對照：找個原來P出來的模板這用來排除體系問題陰性對照：模板換水排除引物問題陽性對照就是加入你以前能克隆的得到條帶的引物和模板，這樣你就能知道你的體系是可以擴出來東西的。而陰性對照就不一樣了，你可以不加引物，不加模板，或者不加其他體系中的東東，老看看你的體系有沒有污染，或者來檢測你的體系中哪一個東東污染了。這和內參是不一樣的，不是一個概念。內參一般是來做對照組，排除干擾的，或者是別的用途。陰性對照如果用水來做的話，別的東西都不加，這樣沒有意義。你的意思如果是體系中更沒有模板，而只有水和其他pcr體系中的東東，那么就可以檢測你的體系終是否存在其他的模板，可以檢測你的體系污染與否，但是這是一個綜合的指標。我們一般做的陰性對照就是只加水，不加模板。pcr中內參照基因：內參就是對照基因，在PCR中，就是肯定能用PCR擴增出來的基因，無論你要擴增什么生物，比如你做的是真菌，都可以擴的出來。陽性對照的目的，有兩個：一個是幫助你判斷你的PCR擴增的過程中有沒有出現什么問題，比如說加樣過程中會不會漏加某些試劑，以判定你的PCR體系有沒有問題。另一方面，就是用來檢測你的目的蛋白的表達量。這個意思是說，內參一般選用在很多組織和細胞中中都是穩定表達的基因，比如actin,tublin，他們在整個生長過程中表達穩定，因此，以他們作為參照，看你的目的蛋白表達量的多少。也就是說，條帶濃度低比內參低，就是表達比內參低，是一種半定量的標準。影響PCR的主要因素：溫度1.模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。 2.引物退火溫度決定PCR特異性與產量；溫度高特異性強，過高引物不能與模板牢固結合，擴增效率下降；溫度低產量高，過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。 3.引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。循環次數常規PCR一般為2540個周期。 引物1.引物長度根據統計學計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。2.引物之間不應發生互補，特別是在引物3端，即使無法避免，其3端互補堿基也不應大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”。 3.引物3端配對DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以，引物3端56個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。 DNA聚合酶 1.引物3端配對DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以，引物3端56個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。 2.影響酶活力的因素Taq酶的活力受Mg2+離子的影響。第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段 。 3.RTth逆轉錄酶的發展很快，所以對耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。 單位換算：1摩爾（mol）1000毫摩爾(mmol)1毫摩爾(mmol)1000微摩爾(mol) 1微摩爾(mol) = 1000納摩爾（nmol）1納摩爾（nmol）=1000皮摩爾（pmol）引物在PCR反應中的濃度一般在0.11mol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經濟、特異，但濃度過低，不足以完成30個循環的擴增反應，則會降低PCR的產率。三磷酸腺苷（ATP）：ATP的立體結構ATP可通過多種細胞途徑產生，最典型的如在線粒體中通過氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的葉綠體中通過光合作用合成。ATP合成的主要能源為葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在胞液中產生2分子丙酮酸同時產生2分子ATP，最終在線粒體中通過三羧酸循環產生最多36分子ATP。磷酸化：生物分子結合磷酸基團的過程。磷酸化是將磷酸基團加在中間代謝產物上或加在蛋白質（protein）上的過程。磷酸基團的添加或除去（去磷酸化）對許多反應起著生物“開/關”作用。磷酸基團的添加或除去能使酶（enzyme）活化或失活，控制諸如細胞分裂這樣的過程。 添加磷酸基團的酶稱為激酶（kinases）；除去磷酸基團的酶稱為磷酸酶。 磷酸化就是通過磷酸轉移酶在底物上加上一個磷酸基團。 在生物方面： 磷酸化（英語：Phosphorylation）或稱磷酸化作用，是指在蛋白質或其他類型分子上，加入一個磷酸（PO4）基團，也可定義成“將一個磷酸基團導入一個有機分子”。此作用在生物化學中占有重要地位。 蛋白質磷酸化可發生在許多種類的氨基酸（蛋白質的主要單位）上，其中以絲氨酸為多，接著是蘇氨酸。而酪氨酸則相對較少磷酸化的發生，不過由于經過磷酸化之后的酪氨酸較容易利用抗體來純化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也較廣為了解。 除了蛋白質以外，部分核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鳥苷（GTP）的形成，也是經由二磷酸腺苷和二磷酸鳥苷的磷酸化而來，此過程稱為氧化磷酸化。另外在許多糖類的生化反應中（如糖解作用），也有一些步驟存在氧化磷酸化作用。受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs) ：細胞表面一類具有細胞外受體結構域、可使酪氨酸磷酸化的穿膜受體蛋白。具有細胞外受體結構域的酪氨酸激酶，膜外信號物質結合受體部分后激活其細胞內的激酶活性域，從而對底物的酪氨酸殘基進行磷酸化。在細胞信號的穿膜轉導中起作用。 各類受體酪氨酸激酶RTKs是最大的一類酶聯受體， 它既是受體，又是酶， 能夠同配體結合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。所有的RTKs都是由三個部分組成的：含有配體結合位點的細胞外結構域、單次跨膜的疏水螺旋區、含有酪氨酸蛋白激酶（RTK）活性的細胞內結構域。 已發現50多種不同的RTKs,主要的幾種類型包括： 表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF） 受體； 血小板生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF） 受體和巨噬細胞集落刺激生長因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）； 胰島素和胰島素樣生長因子-1 （insulin and insulin-like growth factor-1, IGF-1） 受體； 神經生長因子（nerve growth factor, NGF） 受體； 成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF） 受體； 血管內皮生長因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）受體和肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor, HGF） 受體等。 受體酪氨酸激酶在沒有同信號分子結合時是以單體存在的，并且沒有活性；一旦有信號分子與受體的細胞外結構域結合，兩個單體受體分子在膜上形成二聚體，兩個受體的細胞內結構域的尾部相互接觸，激活它們的蛋白激酶的功能，結果使尾部的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化導致受體細胞內結構域的尾部裝配成一個信號復合物（signaling complex）。剛剛磷酸化的酪氨酸部位立即成為細胞內信號蛋白（signaling protein）的結合位點，可能有1020種不同的細胞內信號蛋白同受體尾部磷酸化部位結合后被激活。信號復合物通過幾種不同的信號轉導途徑，擴大信息，激活細胞內一系列的生化反應；或者將不同的信息綜合起來引起細胞的綜合性應答（如細胞增殖）。HER2：HER2是一種位于乳腺和乳腺癌細胞表面的受體，能夠控制癌細胞的生長、浸潤和癌細胞的轉移，大約20的乳腺癌病例中HER2基因和/或蛋白水平增加，這些HER2陽性的腫瘤是一種高危腫瘤，對某些常規的化療和激素治療反應性差，通常預后不好。為此，多種阻斷HER2的抗癌藥物相繼問世，其中目前最為常用并經FDA批準的此類藥物是曲妥珠單抗(赫賽汀)，適用于治療HER2過度表達的乳腺癌。由于這種藥物只有針對HER2基因擴增和蛋白過度表達的病人才有效，因此準確評價HER2基因和蛋白水平是至關