密級： 論文編號： 中國農業科學院 碩士學位論文 豬肺組織中差異表達基因的篩選 of of in of of in 要 目前，豬呼吸系統疾病已成為我國許多規模化豬場和農村養豬大戶十分關注的問題 。豬的呼吸道疾病被認為是困擾豬場生產經營的主要問題之一 ，是造成最大經濟損失的疾病， 將是今后養豬業面臨的主要難題。 豬呼吸 系統 疾病是多種因素綜合作用的結果， 除了 遺傳因素 以外，還 包括傳染性、環境 以及 管理 因素 等 。 豬呼吸 系統 疾病 的肺組織炎癥過程常導致 肺間質纖維化 ， 是呼吸衰竭的重要原因。 通過遺傳選擇提高肺組織炎癥 抗性可能是解決這一重大疾病最好的長期策略。 對豬 肺 組織炎癥抗性的基因表達調控和分子機制 目前還不 是很 清楚 , 這就嚴重阻礙了人們通 治療、免疫接種和遺傳選擇等途徑來顯著提高豬肺組織炎癥的整體抗性。本研究旨在通過分離和克隆與豬肺組織炎癥抗性相關基因的探索性研究，初步揭示參與肺組織炎癥抗性的基因種類和數量，為進一步深入開展肺組織炎癥抗性的分子機理研究及將來通過遺傳選擇提高肺組織炎癥的抗性提供理論基礎。 本實驗中首先應用抑制性消減雜交 (術成功構建了豬病變肺組織 與健康 肺組織差異表達 大白豬為材料，分離 )+ 轉錄合成單鏈及雙鏈 酶切成為平均大小 150豬病變肺組織 成兩組，分別與 2種不同 的接頭連接，再與健康 肺組織 行 2 次消減雜交和 2 次抑制性 增，將第 2 次 體連接，轉化大腸桿菌 終構建得到了具有高消減效率的豬肺組織炎癥抗性相關 庫擴增后得到 422 個白色陽性克隆，隨機挑選 21 個克隆進行 定，鑒 定結果表明插入片段主要分布在150500間。 隨后將從抑制性消減雜交過程中篩選到的初步差異表達的基因片段，經過反 庫中高通量篩選得到 422 個差異表達的克隆。分別用地高辛標記豬病變肺組織和無病變肺組織 為雜交探針，對構建的 減文庫利用反向1 個差異表達克隆，測序后得到 34個質量合格的 據在 將這些 類：第一類 代表已知基因，共 12 個；第二類代表已知 22個 。 代表已 知基因的 照基因功能分為 六 類：信號轉導與細胞間通信、細胞結構與運動、細胞與機體防御、物質轉運、翻 譯與表達調控及其它。結合相關文獻初步探討了部分豬肺組織炎癥相關 差異表達基因的作用和意義，其中豬免疫球蛋白重鏈基因 ( 核轉錄因子一 B)、 補體分子 鈣粒蛋白 ( 平滑肌激動蛋白基因 ( 核糖體蛋白基因 ( ( 基因可能在豬肺組織炎癥抗性中發揮重要作用。 關鍵詞： 大白豬；肺組織炎癥抗性；抑制性消減雜交；基因表達；差異篩選； 庫 X ow is a is of to be in is in in is to XI be it of of in it to to of to to we in of A)+ 0 as )+ 50 00 as a of 8 h 00 CR CR . 422 of in 50bp in 1 of of in A 22 ( 41 4 A in nr ST ST 22, in on of is or an of of in on 、 an in in 目 錄 第一章 文獻綜述 . 1 吸系統及其肺損傷機制 . 1 吸系統的結構及其與疾病的關系 . 1 損傷發生的機制 . 2 常見的呼吸系統疾病及其研究進展 . 3 因差異表達的研究方法 . 4 示篩選 (. 5 消減雜交 (. 5 異顯示反轉錄 術 (. 6 表性差示分析法 (. 6 因表達系列分析（ . 7 制性消減雜交 (. 7 互扣除 . 11 異消減展示（ . 11 陣列分析 (. 11 研究意義 . 12 第二章 構建豬肺組織炎癥抗性相關 庫 . 13 言 . 13 料和方法 . 14 料 . 14 法 . 15 結果 . 26 部組織中總 . 26 鏈 成與酶切 . 27 頭連接效率檢測 . 27 減產物第二次 果 . 28 減效率檢測 . 29 減文庫中插入片段的 . 27 論 . 27 第三章 豬肺組織中差異表達基因片段的克隆測序和功能分析 28 言 . 28 料與方法 . 28 要試劑 . 28 要儀器設備 . 28 交所用溶液配制 . 29 異篩選探針的標記 . 31 針標記效率檢測 . 33 入片段的擴增與點膜 . 33 點雜交與顯色 . 34 異表達克隆選取 . 34 序 . 34 異表達 . 35 果 . 35 針標記效率檢測結果 . 35 點雜交篩選結果 . 35 3 4 結論 . 39 豬免疫球蛋白 . 38 核轉錄因子 基因 () . 38 補體 分子 . 42 鈣粒蛋白 ( . 42 a平滑肌激動蛋白基因 (. 44 核糖體蛋白基因 ( (. 44 第四章 全文結論 . 45 參考文獻 . 46 致 謝 . 55 附 錄 . 55 作者簡歷 . 56 英文 縮略詞 (英文 縮寫 英文全稱 中文 全稱 芐青霉素 部比對基本檢索工具 基對 補脫氧核糖核酸 DD 乙基焦 碳 酸鹽 ds 鏈互補 B 溴化乙錠 二胺四乙酸二鈉 達序列標簽 油醛 疫球蛋白重鏈可變區 丙基 - 道爾頓 使核糖核酸 OD 密度 酸鹽緩沖溶液 合酶鏈反應 糖核酸 糖體 /分 轉錄聚合酶鏈反應 of 因表達系列分析 細胞計數 二烷基磺酸鈉 化鈉 ss 鏈互補 SH 制消減雜交 羥甲基氨基甲烷 43 1 第一章 文獻綜述 吸系統及其肺損傷機制 吸系統 的 結構 及其與疾病的關系 豬呼吸系統疾病與呼吸系統的結構和免疫機制是密切聯系的。呼吸系統由鼻、咽喉、氣管、支氣管及其分支（細支氣管和呼吸性細 支氣管）組成的長長的呼吸道。大量的肺泡和肺泡囊附著在呼吸性細支氣管上。在由鼻到呼吸性細支氣管的管道系統中，管道的總面積逐級增大，到細支氣管這一級時，管道總面積已非常大，這種結構影響氣流的速度，有利于塵埃和微生物的沉積。在吸入的各種病原因子作用下，肺內細支氣管 首先是因為吸入并能到達肺深部小顆粒（直徑 米）主要沉積在這一部位，其次是因為肺泡內排出的細胞性和非細胞性物質經過狹窄的細支氣管腔時，很容易在這個部位滯留。在外界不良條件作用和機體抵抗力下降時，如脫水、受寒 、細菌、病毒或寄生蟲感染、饑餓、吸入有毒氣體、代謝紊亂、肺瘀血、肺水腫等情況時，病原微生物則可入侵定居和繁殖，引起支氣管肺炎。 整個呼吸系統都有自己的非特異性屏障。從鼻到細支氣管黏膜都有一層單層柱狀纖毛上皮覆蓋，上皮層中有一些能分泌黏液的杯狀細胞，它所分泌的黏液能粘附微生物和氣源性顆粒，借助纖毛的擺動將這些異物排出。此外黏液中還含有殺菌物質，如溶菌酶、鐵蛋白及低分子肽等。溶菌酶對革蘭氏陽性菌，鐵蛋白對巴氏桿菌，低分子肽對胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌均具有很好的殺滅作用。肺泡壁沒有黏液，而是靠肺泡巨噬細胞 的吞噬作用及表面活性物質來清除。但是這種清除作用對某些毒力較強的細菌如胸膜肺炎放線桿菌的清除作用不大，相反，這些毒力較強的細菌產生的毒素能使肺泡巨噬細胞失去活性，從而迅速定居增殖并引發疾病。多數西方學者認為多殺性巴氏桿菌屬于繼發感染，而胸膜肺炎放線桿菌屬于原發感染。 另外，豬呼吸系統的疾病 與 呼吸系統的免疫應答和免疫抑制 密切相關 。與胃腸道類似，呼吸系統的抗菌保護主要靠 使在有抗體存在時，那里也有大量的微生物群。 此不能激活 C3C5的生物功能或 C8介導的溶菌作用，其也沒有調理活性，因而 2 強巨噬細胞的吞噬作用。在呼吸系統中， 反， 而使肺基本保持無菌。豬感染病毒、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌時能引起呼吸道單核細胞的浸潤，具有細胞介導免疫的活性。在胸膜肺炎放線桿菌感染中，細胞介導免疫通過激活巨噬細胞而起著重要作用。當細胞介導免疫不存在時，抗放線桿菌抗體的強烈免疫應答是有害的。這是由于當非活化的肺泡巨噬細胞攝取大量放線桿菌而又不能將其消化時 ，被攝入的放線桿菌分泌出細胞毒素，使巨噬細胞失去活性。 一些免疫、自身免疫或代謝性的全身性疾病，如結節病，系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、皮肌炎、硬皮病等都可累及肺部。肺還具有非呼吸性功能，如肺癌異位性激素的產生和釋放所產生內分泌綜合證。 肺損傷 發生的 機制 多種急性和慢性肺疾病伴有不同程度的肺部炎癥和肺纖維化統稱為肺間質疾病 ,肺間質纖維化是各種不同病因肺間質疾病的共同結局 ,是呼吸衰竭的重要原因。對肺間質纖維化 所造成的肺部組織損傷的發病機制的 始動因素目前還不清楚 ,有人認為與遺傳易感性、 病毒感染、免疫功能異常等有關。各種損傷因素損傷肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞 ,引起肺泡巨噬細胞 (活化 ,單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細 胞等炎癥細胞浸潤 ,炎癥細胞及其釋放的細胞因子和炎癥遞質介導了早期的肺損傷 。有以下炎癥細胞和細胞因子參與了早期的肺損傷過程 源的細胞因子 化后釋放的細胞因子和炎性遞質在早期肺損傷中起主要作用。在肺損傷時 , 1 ,腫瘤壞死因子 ( ,單核細胞趨化蛋白 (1 ,轉 化生長因子 ( ,血小板源生長因子 ( 、胰島素樣生長因子 ( 1 以及其他趨化因子和黏附分子。這些細胞因子一方面使炎癥細胞浸潤 ,化和成熟 ,另一方面促進細胞因子和炎癥遞質的進一步分泌和表達 ,形成復雜的細胞因子網絡 ,引起肺泡炎和肺損傷。 單核細胞趨化因子 , 中性粒細胞趨化因子 , M ,并損傷肺泡上皮細胞及血管內皮細胞。 致纖維化的生長因子 ,在早期分泌增多 ,同時啟動肺纖維化的過程 ,形成不可逆性肺損 傷 （ C， 1996） 。 性粒細胞 近年來 ,中性粒細胞在肺泡炎和肺實質損傷中的作用日漸引起重視 , 人和博萊霉素肺纖維化模型支氣管肺泡灌洗液 () 的中性粒細胞數目都明顯增高 （ M， 3 1995） 。中性粒細胞來源的活性氧化物和中性粒細胞崩解后釋放的蛋白水解酶既對肺組織有直接損傷作用 ,又能促進 放其他細胞因子。 人肺纖維化程度與肺組織中中性粒細胞活性密切相關 , 中中性粒細胞比值低、淋巴細胞比值高者對治療反應好 ,預后好 。 他細胞和細胞因子的作用 在早期肺損傷時 ,上皮細胞和毛細血管內皮細胞是受到損傷的靶細胞 ,但受損傷后分泌的細胞因子又參與了肺損傷和肺纖維化。在鼠的博萊霉素肺纖維化模型中 ,肺泡型上皮細胞的 達增高 , 白表達增高 （ 宋明臣， 1998） ,上皮細胞和 內皮素 ( 1 蛋白表達增高 （ E， 1998） ,嗜酸性粒細胞分泌 肺組織 達增 高 , 嗜酸性粒細胞、單核細胞有趨化作用 ,能夠刺激成纖維細胞增殖和膠原合成 , 夠誘導嗜酸性粒細胞分化、增殖和活化。 人 蛋白表達增高 , 中 高 （ ， 1998） 。在鼠的博萊霉素肺纖維化模型中 ,肺內和 中淋巴細胞升高 ,值升高 ,T 淋巴細胞的 達增高 ,抗 巴細胞單克隆抗體治療后肺纖維化減輕 ,表明淋巴細胞介導的免疫反應也參與了肺損傷。核因子 B () 是調控炎癥 反應的重要轉錄因子 ,與炎癥性疾病密切相關 ,在博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中 ,肺 活性增強 ,伴有 達增高 ,在早期肺泡炎階段尤其明顯 （李永春 ，1999） 。 源的生長因子是肺損傷后過度修復和肺纖維化發生的重要原因。在修復階段 ,纖維化病灶附近的 纖維化病灶內的成纖維細胞 能刺激成纖維細胞增殖和膠原合成 ,促進膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質酸、蛋白聚糖等在細胞外基質 中沉積 ,減少細胞外基質的降解（ ， 1998） 。 是重要的致纖維化生長因子 ,能刺激平滑肌細胞、成纖維細胞增殖和膠原合成。 總之 ,肺間質纖維化是一種免疫介導的炎癥性疾病 ,多種炎癥細胞和細胞因子參與了肺纖維化的發病過程 ,傳統的激素和免疫抑制劑治療仍是目前主要的治療手段 ,新的抗纖維化的藥物和細胞因子治療正在為肺纖維化的治療開辟新的途徑。 豬常見的呼吸系統疾病 及其研究進展 豬 常見的呼吸系統疾病 從病理學上，按其發病部位，可分為 3種主要類型：鼻炎、肺炎 、胸膜炎。不同病原侵襲不同生理部位，造成靶器官損傷或全身各系統病征。在生產中，常見 4 的呼吸系統疾病可分為以下幾類：（ 1）細菌性呼吸系統疾病，主要有支原體肺炎（豬喘氣病，豬放線桿菌胸膜肺炎（ 豬鏈球菌病（ 進行性萎縮性鼻炎（ 豬肺疫等；（ 2）病毒性呼吸系統疾病，主要有豬繁殖與呼吸系統障礙綜合癥（ 豬偽狂犬（ 豬流感（ ,豬瘟（ ；（ 3）細菌和病毒混合感染的呼吸系統疾病，主要有豬呼吸道疾病綜合征（ 豬斷奶后多系統衰竭綜合征（ ；（ 4）寄生蟲 性呼吸系統疾病，如由蛔蟲、后圓線蟲、肺絲蟲等引起的呼吸系統疾病。 目前對豬的呼吸系統疾病的防治 主要還是 根據各 豬 場實際情況，建立生物安全體系，制定相應的技術和管理規范 措施來解決出現的疾病問題 ， 從分子遺傳角度來改善豬呼吸系統疾病相關抗性的研究 還比較少 見，但是 關于豬 呼吸系統方面的遺傳差異已有 多數研究 報道 ，呼吸障礙在某種程度上受遺傳影響 ，如：在基因選擇的肥胖豬中，發現肺臟的肺泡巨噬細胞的吞噬功能比經基因選擇的瘦肉型豬的效力強的多，這種差異在冬季和夏季時最明顯（ 1990） ； 有臨床觀察表明，純種漢普 夏豬（ 約克夏豬呼吸系統疾病的發病率低 （ ， 1986） ； 約克夏豬比長白（ 對萎鼻（ 易感性高 （ 1983） 。 到目前為止，對豬肺組織中抗病性遺傳機制及肺組織中與抗病性有關的基因研究還不多。 對于豬呼吸系統疾病的防治還沒有從根本的免疫機制和基因水平上去改變豬本身的免疫抗性， 可以通過研究豬呼吸系統疾病相關因子和基因， 采用細胞因子治療法和基因治療法，從根本上提高豬的整體抗病力 。 因差異表達的研究方法 基因的時空差異表達是有 機體發育、分化、衰老和抗逆等生命現象的分子基礎。基因在不同組織、不同器官以及不同環境條件下的差異表達特征為基因的功能提供了重要的信息。 高等生物大約 30000是同時表達的基因只有很小的一部分，約15%左右。 而這些基因的表達是按事件和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達。 基因的選擇表達，決定著整個生命過程中的發育，分化，內環境穩定，刺激反應，細胞周期調控，衰老以及程序化死亡等正常的發育過程 ， 另外， 在疾病中出現的病理性改變，無論是單一基因突變引起的或是多基因的復雜效 應，也都是由基因表達的改變所決定的。因此，比較兩種不同類型細胞中基因表達的差異，就可探究造成這兩種細胞的表型差異的遺傳原因，提供研究生命過程的基本信息。 5 基因差異表達有兩種含義 ， 包括新出現的基因表達與表達量有差異的基因表達。 無論基因發生哪種差異表達，都會對其生理過程造成重要的影響。 研究基因差異表達的方法很多， 常用的方法 大致歸納如下幾種。 示篩選 (差別雜交 (叫差別篩選 (適用于分離經特殊處理而被誘發表達的 差別雜交的技術基礎十 分簡單，它不需要任何有關的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是 要 擁有兩種不同的細胞群體。在這種情況下便可制備到兩種不同的 此，可以通過這兩種總 是它們的 為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總 應用差別雜交技術分離克隆的目的基因存在著諸多方面的局限性。首先，差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐度的 個缺點就顯得更加突 出。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費時間和金錢的工作。況且兩套平行轉移的濾膜之間， 樣所得的雜交信號的強度也就不會一致，需要重新進行點雜交，以作進一步的陽性克隆鑒定工作。所以說重復性差是差別雜交篩選法的又一個缺點。 差別 雜 交技術在理論上很具吸引力 ,但實際操作并不容易 :首先是回收 并仍存在重復性差 ,敏感度低的缺點 ,這些均限制了這一技術更廣泛的使用。 減雜交 (消減雜交又叫扣除雜交或 扣除 它是通過構建扣除文庫 (以實現的。 1984年， 差異表達的基因通過檢測樣本 過量的對照樣本 相互雜交而得到 ， 是早期建立的經典方法。該法通過構建富含目的基因序列的 本質是將共同擁有的序列消減掉，以富集目的基 因序列，提高分離的敏感性。 將消減雜交法的基本原理應用于 兩個不同來源的 同樣可鑒別出只在一種 而鑒定出差異表達的基因。 另外， 扣除雜交法同樣也可以用來分離缺失突變基因。 該法對高豐度的 其適于分離由于缺失而造成的遺傳病的相關基 因；但很難獲得低豐度的差異基因，且存在重復性差、敏感性低的缺點 6 異顯示反轉錄 術 (差異顯示反轉錄 術是 1992年 由 P,992)，它是以分子生物學上最廣泛應用的兩種技術 基本原理是：以一對細胞 (或組織 )的總 用 過 5 端與 3 端引物的合理設計和組合，將細胞 (或組織 )中表達的約 15 000種基因片段直接顯示在 而找出一對細胞 (或組織 )中表達有差異的 同其它方法相比較 雖然 有很多優點 : l）簡單易行 2）靈敏度高 3）重復性好 4）多能性 5）快速 但在實際操作中仍 存在一些問題 ,主要表現在 : 1)出現差別條帶太多 ,假陽性率高達 70%左右 ,重復性差 ,且對高拷貝數的 2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因 。 3)得到的有差異的擴增條帶短 ,一般在 110 4）以 )為引物的 所以差別顯示技術自 1992年建立后，一直在不斷進行著改進。第二代差異顯示系統 :限制性酶切片段差異顯示（ 就是一個很有效的改進。 是首先限 制性酶切 在酶切后的 是 異性 決了第一代差別顯示系統的重復性問題 。總之， 點放大和展示編碼區，對原核及真核 大消除假陽性。 差異顯示技術經過一系列的改進，其假陽性率有了一定的下降，但是仍然無法完全解決 。 表性差示 分析法 (1993年， 1994年， 代表性差異分析法， 其目的在于減少假陽性，增加重復性。該技術充分發揮了 指數形式擴增雙鏈模板，而以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使目的基因片段得到特異性擴增。 此技術最大的優勢是差異條帶在 陽性少 。 但是如果兩組間存在較大差異，以及某些基因在檢測子 (存在上調表達時，此方法顯得 7 力不從心， 達不到預期目的；而且 所需起始材料較多，更多信賴于 之間若存在較多差異，或 難達到預期目的，而且工作量比 期長 ；另外 操作步驟比較煩瑣，低豐度分子被擴增的幾率仍很低，酶切連接步驟多， 能漏掉關鍵基因。 因表達系列分析（ 基因表達