植物代謝組學及其應用 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院趙會杰 目錄 一 植物代謝組學的概念和意義二 代謝組學在系統(tǒng)生物學中的地位三 植物代謝組學的研究方法四 代謝組學在植物科學中的應用五 展望 一 植物代謝組學的概念和意義 1 概念 生物學中 組 的概念 組 來源于希臘語ome 意指每個 所有 全部 以它為后綴最先用于基因組 genome 指一個物種的全部遺傳組成 自基因組學概念提出后 帶組學 omics 的概念出現(xiàn)有200多種 如蛋白組學 代謝組學等 近年來 隨著生命科學研究的發(fā)展 尤其是完成擬南芥 Arabidopsisthaliana 和水稻 Oryzasativa 等植物的基因組測序后 植物科學發(fā)生了翻天覆地的變化 有人說生命科學研究跨入了后基因組時代 人們已經(jīng)把目光從基因的測序轉(zhuǎn)移到了基因的功能研究 在研究DNA的基因組學 mRNA的轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)的蛋白組學后 接踵而來的是研究代謝物的代謝組學 代謝組 是指細胞或者生物體內(nèi)的所有代謝物的總和 也有人將它定義為細胞 組織 器官或者生物體內(nèi)的所有小分子代謝組分的集合 代謝組學 通過大量代謝成分的定性 定量分析來定義生物體的生化表型 代謝表型 及其與基因型的關(guān)系 從而為研究基因功能 詮釋生命現(xiàn)象提供大量的代謝信息 這就是代謝組學 metabolomics 2 意義 通過研究不同物種的代謝產(chǎn)物 可以指導植物分類學 對植物進行更加合理的分類 通過研究不同基因型植物的代謝物 可以發(fā)現(xiàn)新的功能基因 促進轉(zhuǎn)基因植物的研究 同時還可以對轉(zhuǎn)基因植物及其在食用方面的安全性進行代謝物組學水平上的評估 通過研究不同生態(tài)環(huán)境下植物的代謝產(chǎn)物 了解植物的區(qū)域性分布 如果所研究的植物是某種藥用植物 則就可以應用于中藥道地藥材的確定 植物在受到某種內(nèi)部或外界因素刺激之后會產(chǎn)生的特定的應激變化 最終會表現(xiàn)在代謝物的改變上 通過研究這種變化規(guī)律 為從植物中定向培養(yǎng)得到某一特定代謝物提供指導 20世紀末到本世紀初 大規(guī)模的基因組測序工作產(chǎn)生了海量數(shù)據(jù) 但僅僅是依賴DNA序列我們能夠得到的信息還是有限的 科學家迫切希望在整體水平上了解基因表達的特征和基因所編碼的產(chǎn)物的功能 因此 功能基因組學 functionalgenomics 的研究逐漸興起 它是通過大規(guī)模地分析細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平 轉(zhuǎn)錄組 和蛋白質(zhì)水平 蛋白質(zhì)組 上的變化 進而推測基因功能 這就開啟了 功能基因組學 的研究 二 代謝組學在系統(tǒng)生物學中的地位 然而 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組不一定能很好地預測基因的功能 盡管轉(zhuǎn)錄組攜帶了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的密碼子 但是mRNA水平上的增加與蛋白質(zhì)水平的增加并不一致 況且蛋白質(zhì)合成后的各種修飾往往帶來活性的改變 考慮到這些因素 僅憑轉(zhuǎn)錄組或者蛋白質(zhì)組的改變不一定能夠準確預測生化表型 代謝物 的改變 另外 在建立轉(zhuǎn)錄譜和蛋白譜的時候 要鑒定一種mRNA或者蛋白質(zhì) 現(xiàn)代的技術(shù)手段主要是通過序列相似性比對和與數(shù)據(jù)庫的匹配來確定的 這樣的鑒定主要依賴于匹配度 因此不是直接的 由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息的缺乏 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組也就只能提供有限的信息 代謝組可以在代謝物的基礎上來區(qū)分表型 不論是可見的還是不可見的表型 用代謝物來區(qū)分可能是更無偏見的 至少是提供了代謝水平上的證據(jù) 而且 在那些由突變體或者轉(zhuǎn)基因造成的可以測量的表型變化的實例中 代謝組的方法可以被用來闡明造成這種可見表型的生化原因或者結(jié)果 因此 以DNA mRNA 蛋白質(zhì)和代謝物為研究對象的基因組學 轉(zhuǎn)錄組學 蛋白質(zhì)組學和代謝組學是一個密切相關(guān)的整體 他們共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學 systemsbiology 基因組 轉(zhuǎn)錄組 蛋白質(zhì)組和代謝組的關(guān)系 系統(tǒng)生物學研究的四個層次 代謝組學研究技術(shù)步驟 三 植物代謝組學的研究方法 植物材料培養(yǎng) 數(shù)據(jù)分析與解釋 樣品制備 成分分析與鑒定 1 植物培養(yǎng) 栽培 對研究對象進行培育的目的是為了對樣本的穩(wěn)定性進行控制 相對于微生物和動物而言 植物的人工栽培需要考慮更多的問題 如中藥材在不同年齡 不同發(fā)育階段 不同部位以及光照 水肥 耕作等環(huán)境因素的微小差異都可引起生理狀態(tài)的變化 而這些非可控及可控雙重因素的影響很難進行精確的控制 從而影響藥用植物代謝組研究的重復性 為了解決以上問題 推薦使用大容量的培養(yǎng)箱 定時更換培養(yǎng)箱中栽培對象的位置 以及使用無土栽培技術(shù)等 利用無土栽培系統(tǒng)將水和養(yǎng)分直接引入植物根部 并且對供給量進行精確地控制 大大提高了實驗的重復性 植物代謝物樣品制備分為組織取樣 勻漿 抽提 保存 樣品預處理等步驟 代謝產(chǎn)物通常用水或有機溶劑 如甲醇和己烷等 分別提取 獲得水提取物和有機溶劑提取物 從而把非極性的親脂相和極性相分開 分析之前 通常先用固相微萃取 固相萃取和親和色譜等方法進行預處理 然而植物代謝物千差萬別 其中很多物質(zhì)稍受干擾結(jié)構(gòu)就會發(fā)生改變 且對其分析鑒定所采用的設備也不同 目前還沒有適合所有代謝物的抽提方法 通常只能根據(jù)所要分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的提取方法 而抽提時間 溫度 溶劑成分和質(zhì)量及實驗者的技巧等諸多因素也將影響樣品制備的水平 2 樣品制備 對獲得的樣品中所有代謝物進行分析鑒定是代謝組學研究的關(guān)鍵步驟 也是最困難和多變的步驟 與原有的各種組學技術(shù)只分析特定類型的物質(zhì)不同 代謝組學分析對象的大小 數(shù)量 官能團 揮發(fā)性 帶電性 電遷移率 極性以及其他物理化學參數(shù)差異很大 要對它們進行無偏向的全面分析 單一的分離分析手段往往難以保證 色譜 質(zhì)譜 核磁共振 紅外光譜 庫侖分析 紫外吸收 熒光散射 發(fā)射性檢測和光散射等分離分析手段及其組合都被應用于代謝組學的研究 一般根據(jù)樣品的特性和實驗目的 可選擇最合適的分析方法 目前最常用的分離分析手段 氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 GC MS 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 LC MS 毛細管電泳 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) CE MS 核磁共振 NMR 傅里葉變換紅外光譜與質(zhì)譜聯(lián)用 FTIR MS 3 成分分析鑒定 1 氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 GC MS 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 LC MS 色譜是最常用和有效的分離分析工具 其與質(zhì)譜的聯(lián)用則可以完成從成分分離到鑒定的一整套工作 GC MS和LC MS可以同時檢測出數(shù)百種化合物 包括糖類 有機酸 氨基酸 脂肪酸和大量不同的次生代謝物 GC MS有很好的分離效率且相對較為經(jīng)濟 但需要對樣品進行衍生化預處理 這一步驟會耗費額外的時間 甚至引起樣品的變化 受此限制 GC MS無法分析膜脂等熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)和分子量較大的代謝產(chǎn)物 Forexample Roessner等 2000 2001 利用GC MS對馬鈴薯進行高通量代謝物分析 同時檢測到150種化合物 其中77種被鑒定為氨基酸 有機酸或糖 利用GC MS進行代謝組學研究的代表性工作是Fiehn等 2000 的一系列有關(guān)植物代謝的研究 他們用GC MS對模式植物擬南芥的葉子提取物進行了研究 定量分析了326個化合物 并確定了其中部分化合物的結(jié)構(gòu) LC MS中目前應用較廣的是高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 HPLC MS HPLC與GC原理相似 但在進樣前不需進行衍生化處理 適合那些不穩(wěn)定 不易衍生化 不易揮發(fā)和分子量較大的化合物 HPLC MS選擇性和靈敏度都較好 但分析的時間相對較長 且需依賴純的參照物 Fiehn 2003 利用HPLC MS檢測筍瓜 CucurbitamaximaGelberZentner 葉柄和葉片抽提物 檢測到了超過400種代謝物 有90種被定性 其中大部分是氨基酸 糖和糖苷 Huhman和Sumner 2002 在紫花苜蓿和蒺藜狀苜蓿中各鑒定出15個和27個皂角甙 并在紫花苜蓿中找到了2個新的乙二酸皂角甙 2 毛細管電泳 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) CE MS CE MS分離樣品效率比普通的色譜質(zhì)譜聯(lián)用要高得多 更為便利的是其耗時很短 往往在10分鐘內(nèi)就能完成一個樣品的分析過程 Tolstikov等 2003 用CE MS對擬南芥進行代謝組分析 分離效果遠遠超過了Fiehn等用GC MS進行的先期工作 檢測到超過700個不同的色譜峰值 其中包括許多以前未檢測到的脂類化合物及次生代謝物 3 核磁共振 在代謝組學領(lǐng)域 核磁共振最初被用于病理生理學和藥理毒理學方面 但目前也已被廣泛用于植物代謝組學研究 其優(yōu)點是 A 不同于質(zhì)譜具有離子化程度和基質(zhì)干擾等問題 NMR沒有偏向性 對所有化合物的靈敏度是一樣的 B NMR無損傷性 不破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 可在接近生理條件下進行實驗 可在一定的溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇實驗條件 可以進行實時和動態(tài)的檢測 C NMR氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應的 所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關(guān)的譜峰 圖譜中信號的相對強弱反映樣品中各組分的相對含量 更為直觀 因此 NMR方法很適合研究代謝產(chǎn)物中的復雜成分 Examples Ward等 2003 用1H NMR對多種不同生態(tài)型的擬南芥進行了代謝組分析 在碳水化合物和脂肪族物質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了差異 說明了植物代謝物和生態(tài)型差異的相關(guān)性 Hyung Kyoon等 2004 用1H NMR對野生型和過表達水楊酸合成基因的轉(zhuǎn)基因煙草 Nicotianatabacum 的葉片和葉脈進行了研究 通過進行TMV嫁接和對照實驗 得到多個峰值變化 大部分峰被鑒定為氯原酸 蘋果酸和糖 此實驗提供了一種有效的不需過多步預處理程序的區(qū)分野生型和轉(zhuǎn)基因植物的方法 NMR也有其缺點 與GC MS和LC MS相比 NMR的缺點是靈敏度低 有可能形成信號重疊 且其對樣品制備的要求很高 因為動態(tài)范圍有限 很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物 4 傅里葉變換紅外光譜 質(zhì)譜聯(lián)用FTIR MS FTIR主要測定樣品中各成分的功能基團和高極性鍵的振動 而特定的化學結(jié)構(gòu)有特定的吸收頻率 通過測定實驗樣品的紅外吸收頻率和強度 可以辨別出各個成分 FTIR優(yōu)點 掃描速度快 光通量大 高分辨率 高信噪比及測定光譜范圍寬 FTIR缺點 不可區(qū)分異構(gòu)物 且組分片段和一些絡合離子也對其有影響 由于離子抑制不能進行定量分析 Examples Aharoni等 2002 利用高分辨率的FTIR MS聯(lián)用儀器對鳳梨草莓 Fragariaananassa 組織進行了分析 依據(jù)不同的質(zhì)荷比找到了5844個不同質(zhì)量的物質(zhì) 并根據(jù)對化合物中高含量的元素的精確質(zhì)量測定估計了其中一半以上物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)式 結(jié)果表明 在草莓的不同組織中都含有多種類的初生代謝物 如氨基酸 脂肪酸和碳水化合物 及次生代謝物 如類黃酮和萜類化合物 4 數(shù)據(jù)分析與解釋 樣品成分分析鑒定之后 需要對所獲得的數(shù)據(jù)進行相應的整合處理 這也是代謝組學研究中十分關(guān)鍵的步驟 應用高通量的檢測分析工具可以得到海量的數(shù)據(jù) 如果不對其進行合理的處理 這些紛擾的數(shù)據(jù)反而對研究工作是有害無利的 可應用模式識別和多維統(tǒng)計分析等方法從這些大量的數(shù)據(jù)中獲得有用的信息 這些方法能夠為數(shù)據(jù)降維 使它們更易于可視化和分類 目前數(shù)據(jù)分析常用的方法有兩類 非監(jiān)督方法 unsupervisedmethod 有監(jiān)督方法 supervisedmethod 1 非監(jiān)督 學習 方法 非監(jiān)督方法是用來探索完全未知的數(shù)據(jù)特征的方法 對原始數(shù)據(jù)信息依據(jù)樣本特性進行歸類 把具有相似特征的目標數(shù)據(jù)歸在同源的類里 并采用相應的可視化技術(shù)直觀地表達出來 應用在此領(lǐng)域的常見方法有 聚類分析 clusteranalysis 主成分分析 principalcomponentsanalysis PCA 聚類分析 依據(jù)物以類聚的原理分析具有相似性的事物 將分類對象置于一個多維空間中 根據(jù)事物彼此不同的屬性進行辨認 將性質(zhì)相近的歸入一類 這樣歸在同一類的事物具有高度的相似性 聚類分析就是把事物按其相似程度進行分類 并找出每一類事物共同特征的分析工具 具體到代謝組學中 被歸入一類的物質(zhì)有相同的特征 可能有相同的功能作用 這樣通過同一類事物中一個研究較為清晰的物質(zhì)可以推斷該類中其他物質(zhì)的功能作用 聚類分析過程通常可分為以下步驟 數(shù)據(jù)收集并且收集相應的變量 產(chǎn)生一個相似矩陣 決定把目標總體細分為幾類 對每一種類別相應的定義 實施聚類分析 產(chǎn)生結(jié)果 主成分分析 PCA PCA是目前應用最為廣泛的多維分析方法之一 其特點是將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合指標 即主成分 principalcomponent PC 上 利用這些主成分來描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部結(jié)構(gòu) 實際上也起著數(shù)據(jù)降維的作用 主成分是由原始變量按一定的權(quán)重經(jīng)線性組合而成的新變量 這些變量具有以下性質(zhì) 每一個PC之間都是正交的 第1個PC包含了數(shù)據(jù)集的絕大部分方差 第2個次之 依此類推 這樣 由頭2個或3個PC作圖 就能夠很好地代表數(shù)據(jù)集所包含的生物化學變化 如果存在一些有關(guān)數(shù)據(jù)的先驗消息和假設 有監(jiān)督方法比非監(jiān)督方法更適合且更有效 有監(jiān)督方法在已有知識的基礎上建立信息組 classinformation 并利用所建立的組對未知數(shù)據(jù)進行辨識 歸類和預測 在這類方法中 由于建立模型時有可供學習利用的訓練樣本 所以稱為有監(jiān)督學習 應用于該領(lǐng)域的常見方法有 線性判別分析 lineardiscriminationanalysis 偏最小二乘法 顯著性分析 PLS discriminationanalysis 人工神經(jīng)元網(wǎng)絡 artificialneuralnetworksANN 2 有監(jiān)督 學習 方法 3 網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫 在信息時代 利用網(wǎng)絡資源進行研究是必不可少的 而對千頭萬緒的植物代謝物研究 建立相應的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫也是勢在必行的 這些數(shù)據(jù)庫的建立也有利于聯(lián)結(jié)代謝組學與其他系統(tǒng)生物學分支的關(guān)系 目前 最為成熟的數(shù)據(jù)庫是關(guān)于模式植物擬南芥的 TheArabidopsisInformationResource TAIR http www arabidopsis org 其他常用的網(wǎng)上植物資源有 http www york ac uk res garnet garnet htmhttp www maizegdb orghttp www genome ad jp kegg pathway html 此外網(wǎng)上已有一些與代謝和代謝組學有關(guān)的數(shù)據(jù)庫 主要介紹以下幾個 http www armet org是一個涵蓋大部分植物代謝組學研究工作的網(wǎng)站 包含了這些工作開展的時間 甚至還有詳細的實驗步驟 并將代謝物信息標準化 以便于研究者交流 http medicago vbi vt edu dome html有許多關(guān)于代謝物的原始數(shù)據(jù)和分析結(jié)果 同時也有對人們感興趣的一些植物物種的分子生物學研究 分析結(jié)果用多維統(tǒng)計軟件處理后可用于OMEs的瀏覽器瀏覽 http metacyc org是一個關(guān)于代謝物的數(shù)據(jù)庫 闡述了超過150種生物體中的代謝途徑 包含了從大量的文獻和網(wǎng)上資源中得到的代謝途徑 反應 酶和底物的資料 http www chem qmul ac uk iubmb enzyme對主要代謝途徑及涉及的關(guān)鍵酶進行了詳盡的描述 四 代謝組學在植物科學中的應用 雖然植物代謝組學目前尚處于萌芽階段 但其應用前景是十分廣闊的 下面介紹其中的部分應用 1 代謝組分析 應用代謝組學技術(shù)可同時對大量代謝物進行定性定量分析 常用來觀察植物在環(huán)境條件改變下的代謝物變化 也可用于研究同一植物不同部位或不同時期的代謝物種類與含量變化 也可根據(jù)相關(guān)聯(lián)的代謝物的量的變化 推測相應的代謝途徑和代謝網(wǎng)絡 Example Fiehn 2003 利用GC MS對筍瓜 Cucurbitamaxima GelberZentner 的葉柄脈管抽提物和葉片抽提物進行了代謝物分析 得到了400多個峰 通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對 對其中一小部分進行了定性 初步判斷為何種物質(zhì) 比較了葉柄與葉片間代謝物組分的不同 值得注意的是 即使個體中每種代謝物的量變化很大 其各組分間的比值也能一直維持穩(wěn)定 這說明了植物中的代謝物雖然種類繁多 但都是互相關(guān)聯(lián)的 植物利用復雜的機制來維持體內(nèi)主要代謝物相對穩(wěn)定的水平 對代謝組的分析力求可檢測樣品中每種代謝物 并可監(jiān)測各種條件變化下代謝物的變化 這是進行功能基因組學研究的基礎 2 代謝途徑的描述 在對某一代謝途徑中所有代謝物進行了系統(tǒng)研究后 下一步工作就是對代謝途徑的描述 在找到該途徑一系列底物 產(chǎn)物 中間體和關(guān)鍵酶的基礎上 闡明這條代謝途徑的調(diào)節(jié)機制和關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點 用代謝組學手段可以方便地找到調(diào)節(jié)位點 因為在該處 底物和關(guān)鍵酶的濃度將會發(fā)生相反的變化 Forexample Tiessen等 2002 用HPLC對馬鈴薯塊莖進行了代謝組分析 檢測了淀粉合成途徑中的一系列底物 中間物 酶及產(chǎn)物量的變化 再通過對野生株和含有異源腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 AGPase 轉(zhuǎn)基因株馬鈴薯進行對比研究 提出了淀粉合成途徑中一種新的調(diào)節(jié)機制 在離開母體情況下 馬鈴薯塊莖中淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase的催化亞基AGPB會發(fā)生可逆的氧化還原反應形成二聚體 使AGPase失活 從而抑制淀粉生成 目前 代謝組學應用于此方面的研究報道尚不多見 主要原因是確定代謝途徑比測定代謝物更為困難 往往只能進行間接的定性估計 從一個個點的代謝物到一條完整的代謝途徑還有很長的路要走 3 基因功能研究 代謝產(chǎn)物是基因表達的終產(chǎn)物 基因表達上極微小的變化也可導致代謝物的大幅改變 以前往往通過可見的表型改變來判斷基因表達水平的升降 耗時較長 且有時候基因表達變化無法引起表型改變 而此時植物體中某些代謝產(chǎn)物的含量卻會發(fā)生變化 這時 利用代謝組學方法檢測代謝物的變化就可以判斷基因表達水平的變化 從而推斷基因的功能及其對代謝流的影響 Lytovchenko等 2002 通過對馬鈴薯葉片大量代謝物 特別是光合作用途徑中的中間體和終產(chǎn)物進行分析 研究了質(zhì)體葡萄糖磷酸變位酶 plastidialphosphoglucomutase 基因在光合作用中對碳流的影響 發(fā)現(xiàn)在其表達水平低的情況下 雖然植物表型沒有變化 但是植物組織中的淀粉 糖和有機酸的含量都有一定降低 這說明質(zhì)體葡萄糖磷酸變位酶基因表達水平的變化對植物的幾條主要代謝途徑都有很大的影響 4 與轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術(shù)整合 轉(zhuǎn)錄組學 蛋白質(zhì)組學和代謝組學是一個有機的整體 它們都是系統(tǒng)生物學 systembiology 的重要組成部分 生物信息是按DNA mRNA 蛋白質(zhì) 代謝產(chǎn)物方向流動的 將所獲得的這幾者的信息聯(lián)系起來 有利于從整體研究生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的響應 如可判斷代謝物的變化是從哪一個層面開始發(fā)生的 Examples Ferrario Mery等 2002 整合了關(guān)于轉(zhuǎn)錄 酶活性及代謝物的數(shù)據(jù)研究煙草中的碳氮代謝相互作用