細菌藥敏試驗及耐藥機制研究進展,安徽省細菌耐藥監控中心安徽醫科大學臨床檢驗診斷學教研室安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科徐元宏,一、藥敏試驗種類,1、 紙片擴散法2、稀釋法 稀釋法包括宏量肉湯稀釋法(macrodilution test)、微量肉湯稀釋法(microdilution test)、瓊脂稀釋法(agar dilution test)。 3、E-test法,細菌藥敏試驗-宏量稀釋法,Minimal inhibitory concentration (MIC)Reference method. Add standard inoculum to dilutions of antibiotic. Incubate overnight. MIC is lowest concentration that inhibits growth (can also be performed by agar dilution). Interpretation (S or R) is based on achievable drug levels,微量液體稀釋法,細菌藥敏試驗- E-test法,E-testStrips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip.Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.,二、藥敏試驗基本條件,（1）對于從糞便中分離的沙門菌和志賀菌屬，常規僅測試和報告氨芐西林，一種喹酮類藥和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。此外對于胃腸外分離的沙門菌屬還一定要測試并報告氯霉素及其某一種代頭孢菌素的結果。 （2）所有確認產ESBLs的菌株應當報告為耐所有青霉素類，頭孢菌素類和氨曲南。（3）出于對流行性，治療及感染控制方面的考慮，應該把從尿中分離的所有菌株做ESBLs 篩選試驗作為一個基本制度。（4）僅當被認為與臨床有關時（如菌血癥）才進行奇異變形桿菌ESBLs篩選試驗（5）腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬和沙雷菌屬可發展為耐藥。最初分離的敏感菌株在開始治療34天內可變為耐藥，因此對重復分離菌株應重新進行藥敏試驗。 。,用紙片擴散法能可靠地測定分離于囊性纖維化病人的銅綠假單菌的敏感性，但在作為敏感結果報告前，應將孵育時間延長至24小時。,（1）對于腸球菌屬，頭孢菌素，氨基糖苷類（篩選高水平耐藥除外），克林霉素和甲氧芐啶-磺胺甲噁唑可以在體外顯示活性但臨床上無效，因此這些菌株不應該報告為敏感。（2）腸球菌心內膜炎要求大劑量青霉素或氨芐西林，或萬古霉素或替考拉寧聯合慶大霉素或鏈霉素以增加殺菌作用。,（3）慶大霉素和鏈霉素篩選試驗，能夠預測氨芐西林、青霉素或萬古霉素與一種氨基糖苷類抗生素之間的協同效應。其它的氨基糖苷類不需進行測試，因為它們對腸球菌的活性并不優于慶大霉素和鏈霉素。（4）對血和腦脊液分離株推薦用頭孢硝噻吩-內酰胺酶試驗。-內酰胺酶試驗陽性提示青霉素耐藥，同時也對酰胺基，羧基和脲基青霉素耐藥。,（1）肺炎鏈球菌對苯唑西林的抑菌環20mm的菌株對青霉素敏感(MIC0.06g/ml) （2）苯唑西林的抑菌環19mm的菌株應當測定青霉素、美洛培南和頭孢噻肟或頭孢曲松的MICs,三、耐藥表型的檢驗,1、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌、大腸埃希菌和奇異變形桿菌中ESBLs檢測的篩選與確證試驗 紙片法 ：初篩和確證液體稀釋法：初篩和確證,3.D試驗-克林霉素誘導耐藥試驗（1）機制：對大環內酯耐藥的葡萄球菌可能有天然或誘導性對克林霉素的耐藥通過erm 基因編碼的23S rRNA 甲基化也稱為MLSB（大環內酯、林可和B 型鏈陽霉素）耐藥，或只對大環內酯類耐藥（由msrA 基因編碼的外排機制）。（2）方法：MHA或血平板，紙片相鄰試驗，對于葡萄球菌，距紅霉素紙片（15g/片）邊緣1526mm 處放置克林霉素紙片(2g/片)來進行檢測；對于-溶血鏈球菌，將克林霉素紙片(2g/片)和紅霉素紙片（15g/片）貼在相鄰的位置，紙片邊緣相距12mm。,（3）結果判讀：35空氣，16-20小時孵育后，克林霉素抑菌環不出現“截平”現象，應報告分離株對其敏感。鄰近紅霉素紙片側克林霉素抑菌環出現“截平”現象（稱為“D”抑菌環），提示存在可誘導的克林霉素耐藥，應報告分離株對其耐藥，在報告中應注明“通過誘導克林霉素耐藥試驗，推測此菌株對克林霉素耐藥，克林霉素對某些病人可能仍有效”；若無“截平”現象，則應報告菌株對克林霉素敏感。,葡萄球菌對大環內酯類抗生素耐藥機制研究：一、由msrA基因介導的主動外排機制，即M型耐藥；二、抗生素作用靶位的改變，即由erm基因編碼的RNA甲基化酶對細菌核糖體50S亞基23SrRNA進行特定核苷酸殘基甲基化，使藥物與靶位的結合能力下降，導致對具有相同靶位的大環內酯類、林可酰胺類、鏈陽菌素B三類藥物同時耐藥，臨床稱為MLS型耐藥。體外藥敏試驗又可將MLS型分為結構型（cMLS型）和