附件2：中國藥典三部注釋模板1. 細菌類制品注釋模板皮內注射用卡介苗2. 病毒類制品注釋模板流感疫苗3. 治療類制品注釋模板1人血白蛋白4. 治療類制品注釋模板2注射用重組人干擾素1b5. 體外診斷類制品模板人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒皮內注射用卡介苗卡介苗是一種活的、減毒牛型結核分枝桿菌制成的疫苗，通過人工方法接種于人體，使未受結核菌感染的人體產生一次輕微的沒有臨床危險的原發感染，從而產生一定特異性免疫力，當人體再次感染自然結核菌時，可以限制細菌的生長繁殖，減少體內結核菌的數量而起到預防結核病的作用，對兒童原發性結核病、血行播散性結核病及結核性腦膜炎有顯著的預防效果。1901年,法國科學家Nocard從患結核性乳腺炎的奶牛身上分離到一株強毒性牛型結核桿菌，后經法國醫生卡默特（A.Calmette）和獸醫介蘭（C.Guerin）在含5%甘油牛膽汁的馬鈴薯培養基培養，發現牛型結核桿菌毒力逐漸降低，該結果于1907年發表。此后持續13年，經過230次的連續傳代，在1921年動物實驗結果證明這株牛型結核桿菌失去了毒力，該菌感染牛、豚鼠、小鼠、猴和家兔都不能使其發病，但能產生免疫力，該菌株達到了疫苗菌株的標準，將其制成疫苗，1921年7月1日疫苗首次應用于人類，經過幾年的時間證明其預防結核病安全、有效，于1924年在全球應用推廣，1928年法國召開國家科學大會為紀念卡介二氏的功勞，將該菌株制備的疫苗定名為卡介苗（bacelle Calmette Guerin BCG ）。在二十世紀五十年代前，卡介苗是通過口服途徑免疫的， 由于口服卡介苗安全性與有效性都存在缺陷，而改由皮下注射、皮內注射以及皮上劃痕的方法進行免疫接種，通過實踐結果證實，皮下注射會引起膿腫等局部反應；而皮上劃痕的方法難以保證接種的劑量。因而皮內接種卡介苗的方法得以廣泛使用，其劑型也由早期的液體改為凍干，大大提高了接種的效果。 1974年BCG被納入WHO擴大免疫計劃1。至今BCG共約在172個國家、接種40億人次，每年約1億兒童接種BCG，是世界上接種人數最多，最安全的疫苗之一。 自原始的卡介苗菌株從巴斯德研究院供應到世界各國后，不同的實驗室各自建立了傳代方法，多數實驗室是在土豆膽汁或土豆蘇通培養基上傳代與保存，這種傳代方式繼續應用到40年代中期，在許多地區一直應用到上世紀50、60年代。經過長期傳代，在生物學特性、免疫學特性、保護效果和剩余毒力等方面產生顯著差異，形成了不同卡介苗亞株。目前世界上主要的卡介苗制品的菌株分別為卡介苗巴斯德株（Pasteur 1173P2）、丹麥1331株（Danish 1331）、日本172株（Tokyo 172-1）、莫斯科株（Moscow 254） 、巴西株（Moreau）等，我國卡介苗菌株為Danish 823菌株傳代培養而來，名為上海D2PB302PSII甲10菌株，是我國唯一的卡介苗生產用菌株。我國目前所用BCG為凍干皮內注射用BCG，包括10人份疫苗（含卡介菌0.40.6mg）和5人份疫苗（含卡介菌0.20.3mg）兩種規格。主要用于3個月以內的嬰兒或PPD皮試陰性兒童預防結核病。目前國內上市僅為5人份疫苗（0.25mg）一種規格。 制造概要1、總體工藝情況及國內外發展狀況；BCG作為一種活疫苗，生產過程主要包括菌體培養、菌體收集和洗滌、菌體研磨、定量稀釋等。目前，國際上BCG生產主要采用表面浮膜培養和深層培養兩種技術。表面浮膜培養是最經典的方法，也是應用最廣泛的方法，目前世界上有20多個國家采用該方法。我國BCG生產采用表膜培養，原液生產工藝可分為菌種接種與培養、菌液收集和研磨兩個階段，大致工藝可概略如下。啟開工作種子批菌種，接種于蘇通馬鈴薯培養基，培養一段時間，挑取發育良好的菌膜移種于改良蘇通綜合培養基表面（S1），37-39靜止培養10-14天，連續在液體蘇通培養基上培養2-3次（S2或S3），收集S2或S3菌膜制成100mg/ml菌懸液，取適量菌懸液接種入蘇通培養基中（S紗），37-39培養10-14天，在液體表面逐漸形成菌膜即為紗膜。用S紗在蘇通培養基上傳代2-3次，成為紗膜第2代或第3代，培養8-12天的第2代或第3代紗膜可用于制備BCG。菌種自啟開至最終收獲物傳代代數不能超過12代，每代培養結束后，應逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應廢棄2。收集菌膜壓干后稱濕重，移入盛有不銹鋼珠瓶內，鋼珠與菌體的比例應根據研磨機轉速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨，或用手工研磨，加入適量無致敏原穩定劑稀釋成一定濃度的BCG菌體原液。對BCG原液進行純菌檢查和濃度測定，向原液中加入穩定劑，制成1mg/ml或0.5mg/ml半成品。對半成品進行純菌檢查、濃度測定、沉降率測定、活菌數測定及活力測定，然后分裝凍干，即為BCG成品2，。英國、瑞士和荷蘭等國采用深層培養技術制備BCG。將凍干菌種開啟重溶后種入改良羅氏雞蛋培養基表面，在羅氏培養基上至少傳2代，第3代在液體Dubos培養基中深層培養，液體培養基中通常需要加Tween80或Triton WR1339。卡介菌在液體培養基中呈均勻分散的生長。然后離心收集菌體、洗滌、再離心集菌，加保護液，制成所需濃度的BCG。2、關鍵工藝步驟原理及控制條件；疫苗的質量安全、有效和一致性，除了依賴于對疫苗的全面檢定，更重要的生產過程中科學、嚴格的質量控制。BCG生產過程中的質量控制主要從如下幾方面進行。種子批的質量控制歷史上曾因BCG生產用菌種錯誤出現嚴重不良反應的的深刻教訓，嚴控生產用菌種十分重要。我國目前使用D2 PB302種子批作為BCG生產用菌種，嚴禁使用通過動物傳代的菌種制造BCG。生產用菌種采用種子批系統，原始種子批樣驗明其記錄、歷史、來源、和生物學特性。從原代種子批傳代、擴增后凍存保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批核工作種子批得各種特性應與原始種子批一致。BCG種子批生產前應作嚴格檢定，檢定合格后方可用于生產，工作種子批啟開至菌體收集傳代應不超過12代。主要從以下幾方面進行BCG生產用種子批的質量控制。培養特性 BCG在蘇通培養基上經3739培養，生長良好、抗酸染色為陽性。在蘇通馬鈴薯培養基上培養的卡介菌應是干皺成團略呈淺黃色。在牛膽汁馬鈴薯培養基上為淺灰色黏膏狀菌苔。在雞蛋培養基上有突起的皺型和擴散型兩類菌溶，且帶淺黃色。在蘇通培養基上卡介菌應浮于表面，為多皺、微帶黃色的菌膜。毒力試驗用結核菌素純蛋白衍生物（TB-PPD）皮膚試驗陰性、體重300400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液(5mg/ml)，每周稱體重，觀察5周動物體重不應減輕；同時解剖檢查，大網膜上可出現膿皰，腸系膜淋巴結及脾可能腫大，肝及其他臟器應無肉眼可見的病變。無有毒分枝桿菌試驗 用TB-PPD皮膚試驗陰性的同性豚鼠6只，于股內側皮下各注射1ml濃度為10mgml菌液，注射后豚鼠體重不應降低，6周和3個月時分別解剖3只豚鼠，各臟器應無肉眼可見的結核病變；若有可疑病灶，應做涂片和組織切片檢查，并將部分病灶磨碎，加少量生理氯化鈉溶液混勻后，皮下注射2只豚鼠，若證實系結核病變，該菌種即應廢棄；當試驗未滿3個月時，豚鼠死亡則應解剖檢查，若有可疑病灶，即按上述方法進行，若證實系結核病變，該菌種應廢棄；若證實屬非特異性死亡，且豚鼠死亡1只以上應復試。免疫力試驗用種子批菌種制備疫苗，經4只300400g豚鼠分別皮下注射0.2ml疫苗(1/10人用劑量)，對照組注射0.2ml生理氯化鈉溶液。豚鼠免疫后45周，經皮下攻擊103104強毒人型結核分枝桿菌，攻擊后56周解剖動物，免疫組與對照組動物的病變指數及脾臟毒菌分離數的對數值應有顯著差異。 菌種培養和傳代中的質量控制 卡介苗作為一種減毒活疫苗，菌種的安全、可靠至關重要。首先，必須嚴格按照種子批管理系統，啟用和保存菌種，嚴禁使用通過動物傳代的菌種制造BCG。其次，菌種傳代和培養的質量高低直接影響疫苗質量。我國BCG生產采用表膜培養技術，培養過程中，表面菌膜的質量至關重要，通常液體表面形成生長快、薄而多縐并富于彈性的菌膜，適合擴大傳代。凍干菌種在馬鈴薯培養基上培養獲得的菌種如果不能及時傳代，可于2-8保存，但保存時間不得超過2個月。生產過程中，為了簡化程序和降低工作量，可將傳代過程中獲得的紗膜移入冷藏室中保存，下次生產時可直接將紗膜接種入蘇通培養基中，而不必每次生產都用馬鈴薯培養基獲取第一代菌膜。但紗膜在冷藏室的保存時間應控制在2個月以內，并且每代紗膜均需作純菌檢查。在傳代過程中，每代培養結束后，均需逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應予廢棄。另外，應確保菌種自啟開至最終收獲物傳代代數不能超過12代，以保證疫苗的質量穩定。菌種培養過程中應將溫度控制在37-39，培養時間也應嚴格控制，通常，紗膜接入液體培養基中，培養時間應控制在14-21天，液體培養基菌膜直接接入液體培養基，只需培養6-8天即可，用于制備紗膜或BCG原液的菌膜培養時間控制在8-12天。培養基的質量控制卡介苗生產用培養基為蘇通馬鈴薯培養基、膽汁馬鈴薯培養基或液體蘇通培養基。通常，卡介菌培養第一代，即凍干菌種的復蘇，使用蘇通-馬鈴薯培養基或膽汁馬鈴薯培養基，以后各代培養均使用液體蘇通培養基。其中的氮源有必要進行控制，通常將液體培養菌膜直接轉接液體培養基時，待接種培養基使用谷氨酸鈉作為氮源，其他各代培養多用天冬素作為氮源。原液收集和合并（菌體收集和研磨）中的質量控制培養結束后，應逐瓶檢查，若有污染、濕膜、渾濁等情況應廢棄。收集菌膜壓干，移入盛有不銹鋼珠瓶內，鋼珠與菌體的比例應根據研磨機轉速控制在一適宜的范圍，并盡可能在低溫下研磨。加入適量無致敏原穩定劑稀釋，制成原液。由于水分壓干程度不同，同樣濕重下的疫苗所含實際活菌量不同，進而影響 疫苗濃度，故在對收集的菌膜進行壓干去除水分時，壓力控制是必要的，通常根據收集的菌量調整壓力。同樣，菌體經研磨后獲得大小不一的菌團，菌團大小可能和臨床上BCG的不良反應有關，通常菌團越大，越易引起局部反應并可在淋巴結處滯留而引起強反應，因此，壓干的菌塊移入裝有不銹鋼株的球瓶內，鋼珠與菌體的比例應根據研磨機轉速控制在適宜范圍，研磨時間也應根據菌量確定。同時應對菌液均勻度進行監測，以保證生產過程的一致性。總之，在菌體收集、壓干和研磨過程中中，應對壓力和研磨轉速及時間設計相應的過程參數并經充分驗證。檢定按照原液檢定，半成品檢定和成品檢定分別進行描述，說明檢定項目設定的原則、意義；1、原液檢定原液檢定有兩個項目，分別為純菌檢查和濃度測定。純菌檢查按現行版藥典無菌檢查法進行，生長物做涂片鏡檢，不得有雜菌。純菌試驗是疫苗的安全性試驗之一，保證疫苗制品不含雜菌。濃度測定用國家藥品檢定機構分發的1 mg/ml的凍干卡介苗參考比濁標準，以分光光度法測定原液濃度，濃度范圍為60-120mg/ml。原液濃度=（樣品A580nm/標準品A580nm）稀釋倍數1 mg/ml。濃度測定的設定是為了確保疫苗有效成分的含量，并監測生產過程的一致性。2、半成品檢定半成品檢定有5個項目，分別為純菌檢查、濃度測定、沉降率測定、活菌數測定、活力測定。本成品純菌檢查同原液的純菌檢查。半成品濃度測定同原液的濃度測定，應不超過配制濃度的110%。半成品濃度=（半成品A580nm/標準品A580nm）1 mg/ml沉降率測定，可以和濃度測定同時進行，將濃度測定后的半成品室溫靜置2小時，再檢測A580nm，計算靜置前后2小時吸光度值的變化，應不大于20%。通過檢測沉降率，可以了解菌液的均勻性及菌團的大小，從而控制制品的質量，同時也監測生產過程的一致性。沉降率=（半成品A580nm-2小時后的半成品A580nm）/半成品A580nm100%。活菌數測定，半成品活菌數經凍干后有顯著性下降，為了保證凍干后成品的活菌數，因此每批半成品均需做凍干前活菌計數，半成品活菌數應不低于1.0107CFU/mg。活力測定，采用XTT法測定，將相同濃度的半成品與檢測參考品100l/孔加入到培養板中，同時加入25lXTT與中間電子載體混合物，于37-39避光培養24小時，檢測A450nm，半成品的吸光度值應大于參考品的吸光度值。卡介苗生產過程中從半成品到成品的周期較短，而常規的活菌數測定耗時長，需要4-5周時間，通過XTT法可以快速檢測卡介苗活力，從而可以了解半成品中活菌含量。3、成品檢定成品檢定共有9個項目，除裝量差異、水分測定、活菌數測定和熱穩定性試，驗外，按標示量加入滅菌注射用水，復溶后進行其余各項檢定。生物學與物理檢定每批疫苗須做抗酸染色涂片檢查，抗酸染色應是抗酸桿菌,細菌形態與特性符合卡介菌特征;制品外觀為白色疏松體或粉末狀, 殘留水分不高于3.0%,加入稀釋液后，應于3分鐘內完全溶解；裝量差異限度為15%。安全性檢定純菌試驗按現行版藥典無菌檢查法進行，觀察14天,無污染其他雜菌。無有毒分枝桿菌試驗無有毒分枝桿菌試驗是卡介苗制品重要的安全性試驗，因為結核桿菌其形態與培養特性與卡介苗基本一致，如果污染該菌用常規微生物方法無法區分，只能根據結核桿菌與卡介苗對豚鼠的致病力的差異加以區別。同一代菌種生產的各批凍干卡介苗應抽1個亞批做安全試驗，每間隔兩個月應至少抽1亞批進行毒分枝桿菌試驗。用PPD皮膚試驗（10IU）陰性，體重300400g的同性健康豚鼠6只，每只皮下注射相當于50人份的凍干皮內注射用卡介苗，每2周稱重一次，觀察6周，動物體重不應減輕；同時解剖檢查每只動物，若肝、脾、肺等臟器無結核病變，該批疫苗即為合格。效力檢定活菌數與熱穩定性試驗卡介苗的效力與其活菌數密切相關，疫苗中含有足夠數量的活菌是保證疫苗免疫成功發揮預防作用的重要因素，因此活菌數試驗是卡介苗制品重要的質控指標。同時卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到環境溫度的影響而導致活菌數改變，進而影響疫苗的質量，因此對制品進行熱穩定性試驗，以評價疫苗的穩定性。每批成品抽取5支疫苗稀釋并混合后進行活菌數測定，培養4周后活菌數應在1.0106CFU/mg以上。同時取凍干后疫苗放置3728天進行加速破壞試驗，測定放置后樣品的活菌數，與4保存的同一批疫苗同時進行比較，計算活存的百分率。加溫放置制品的活菌數應不低于冷藏疫苗的25%，并不得低于2.5105CFU/mg。活菌數與熱穩定性試驗可以同時進行。動物效力測定同一代菌種生產的各批凍干卡介苗應抽1個亞批做效力測定，每間隔兩個月應至少抽1亞批進行效力試驗。用結素試驗（PPD 10IU）陰性，體重300400g的同性健康豚鼠4只，每只皮下注射0.5mg的凍干皮內注射用卡介苗，注射5周后皮內注射PPD 10IU/0.2ml，注射PPD24小時后觀察結果，局部硬結反應直徑應不小于5mm。PPD 試驗能反應卡介苗接種后機體產生免疫反應的情況，通常情況下，只有免疫成功，才能出現PPD 反應，因此質控中的動物效力測定，是反應卡介苗制品免疫力的指標。稀釋劑稀釋劑為滅菌注射用水，應符合現行版藥典的相關規定。4、歷版藥典標準變化的情況、原因及與國外要求的比較；我國皮內注射用卡介苗的質量標準是規程根據世界衛生組織卡介苗標準制定，內容涵蓋了WHO卡介苗規程所有內容，但WHO標準對濃度、均勻度項目缺少有效的質控指標，對臨床使用存在一定的安全隱患，尤其近年來卡介苗不良反應增加，而其是否與制品本身有關缺少依據。因此我國在2010版藥典中增加半成品沉降率的質控項目，目的是為了監測生產過程的一致性，從而保證疫苗的質量。同時由于半成品至凍干的周期很短，也增加了XTT法快速檢測活菌活力質控項目；正在修訂的WHO 卡介苗標準在成品項下有快速檢測卡介苗活菌數方法，為ATP法， 兩種檢測方法，目的都是為了快速了解制品中卡介苗的活菌含量。我國卡介苗質量標準與WHO規程的主要區別在是熱穩定項目標準不同，我國質量標準規定加溫放置制品的活菌數應由原來標準不低于冷藏疫苗的20%，提高到25%，并由不得低于2.0105CFU/mg，提高到不得低于2.5105CFU/mg。而由于不同卡介苗亞株制備的疫苗制品熱穩定不同，WHO的卡介苗熱穩定標準仍然為不低于冷藏疫苗的20%，并由不得低于2.0105CFU/mg。5、國內外相關標準發展變化的趨勢。正在修訂的WHO 卡介苗規程中包涵了以下修改內容工作種子批 （Working seed lot），規定從主代種子批盡量減少傳代次數制備工作種子批，如3-4代。而我國對從主代種子批制備工作種子批未規定傳代代次，實際操作中一般維持在4代內。單次收獲物（Single harvests），規定從主代種子批到單次收獲物傳代代次不得超過12代。我國規定為從工作種子批到菌體收集傳代不得超過12代。種子批檢定 （Tests on seed lot），補充用分子生物學方法特異性鑒別卡介苗亞株試驗。半成品濃度測定 (Test for bacterial conceration),歐洲藥典中半成品無濃度檢測項目，在成品中檢測該項。而我國和WHO規程相似，目前標準規定在半成品項下進行濃度檢測，成品不檢測。成品鑒別試驗（Identity test），成品鑒別試驗能證明制品為卡介苗BCG ，除了用抗酸染色涂片法檢查細菌的形態與特性及固體培養基菌落特點符合卡介菌特征，還可應用核酸擴增技術如PCR法來特異性的鑒別不同的卡介苗亞株。英國生物制品標準和檢定研究所（NIBSC）設計了多重PCR法3，通過檢測不同卡介苗的遺傳學特性來特異性的鑒別卡介苗及不同的亞株。檢測目標包括卡介苗基因組的缺失區RD1、 RD2、RD 8、RD 14、RD 16區及基因座SenX3-RenX3上的串聯重復序列數。其中RD1是卡介苗基因組的特異缺失區，而存在于結核分枝桿菌復合群中，包括強毒的人結核分枝桿菌及牛結核分枝桿菌，通過檢測RD1的存在與否即可即可特異性鑒別BCG。不同卡介亞株的RD2、RD 8、RD14、RD16區及基因座SenX3-RenX3上的串聯重復序列數不同，PCR擴增后，通過凝膠電泳指紋圖譜區分卡介苗與有毒分枝桿菌及不同的卡介苗亞株。不同的卡介苗亞株有不同的凝膠電泳指紋圖譜3，上述多重PCR鑒別實驗方法已經過包括中國在內的世界上八個獨立實驗室的驗證，旨在替代目前的抗酸染色鑒別實驗方法4。我國藥典目前仍采用抗酸染色涂片法作為卡介苗鑒別試驗的方法。中國食品藥品檢定研究院已對我國生產用卡介苗菌種的遺傳性特性進行了研究，并對傳代12代內的產品進行了檢測。 結果顯示我國卡介苗菌種缺失RD1、RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo，含有一個IS6110插入序列，SenX3-RenX3 基因座有3個串聯重復序列5，并且在12代內都是穩定的6。我國卡介苗亞株是由Danish823傳代培養而來的，和目前世界上應用較多的Danish1331亞株比較，我國卡介苗亞株不缺失RDDenmark/Glaxo，該區域是目前BCGDanish及BCG Glaxo株的特異缺失區。另外我國僅有唯一的卡介苗菌株用于生產，不同于世界上其他國家，同時使用不同的卡介苗亞株制品。因此若使用核酸擴增技術PCR法作為特異性的鑒別卡介苗的試驗方法，僅采用檢測RD1的存在與否及能達到特異鑒別卡介苗制品的目的。成品無有毒分枝桿菌試驗， 若在半成品項檢測無有毒分枝桿菌試驗，且結果合格，在成品項下有可能去掉該項。我國對半成品不進行無有毒分枝桿菌試驗檢測，對成品進行檢測。無有毒分枝桿菌試驗以卡介苗免疫豚鼠后，連續觀察6周，實驗到期后解剖豚鼠，觀察動物臟器是否有結核病變。該方法不但耗時長，而且有動物消耗，不符合節約動物原則和快速檢驗的需要。鑒于與結核分支桿菌H37Rv、牛型分枝桿菌相比，卡介苗基因組中缺少了編碼毒力的基因，如H37Rv RD1區east6和cfp10等基因，檢測毒力特異性基因是否存在即可了解分枝桿菌是否為毒性分枝桿菌。這兩種基因檢測一個即可。中國食品藥品檢定研究院卡介苗實驗室擬用PCR法擴卡介苗是否存在毒力基因來替代動物法，檢測指標為east6毒力基因。檢測結果顯示，有毒的分枝桿菌H37Rv及牛分枝桿菌存在east6基因，可擴增出320bp目的片段，而卡介苗無此基因，則無320bp的擴增條帶，通過高濃度瓊脂糖凝膠電泳即可以對結果進行鑒別。該方法可在12小時內完成，且用一支0.25mgBCG干粉即可完成檢測，靈敏度較高。PCR方法本身的特異性及節省時間、減少動物損耗的優點，說明該方法有替代目前動物法的可能性與可行性。成品卡介苗活力檢測（Test for viability），除了常規通過培養法計數卡介苗菌落形成單位（CFU）來檢查卡介苗活菌數， 還可采用其他的方法快速檢測卡介苗活力，包括生物發光法或其他的生化試驗法。生物發光法是通過檢測卡介苗活菌中三磷酸腺苷含量（ATP法）來快速檢測卡介苗活力。該方法經過包括中國在內8個不同實驗室的驗證7， 驗證結果顯示，該方法可區分4與37存放4周后樣品活菌數的差異，但ATP含量與活菌數相關性較差，還需要進一步驗證。分析認為，只有檢測出單個細菌中ATP含量，才能將該方法應用于BCG活菌含量的快速檢測，目前該方法尚在進一步研究中。我國目前對半成品進行卡介苗活力快速檢測，方法為XTT法，原理為活BCG 在代謝過程中，通過氧化-還原反應將四唑鎓鹽（Tetrazolium salt，XTT）還原為可溶性的高色產物甲臢（Formazan），甲臢含量反映了 BCG 活菌數量。該方法操作簡單，24小時可出結果，不需要特殊儀器。試驗結果顯示XTT 法能反應 BCG 制品中活菌的含量差異，與培養法菌落形成單位（CFU）結果有較好的相關性，可用于 BCG 活菌含量的快速檢測8。對半成品進行活菌數的快速檢測比對成品更有實際應用意義，因為半成品至成品的周期短，不但可以快速了解半成品中的活菌數，還可以監測生產過程的一致性。卡介苗接種是結核病預防和計劃免疫工作內容之一，對預防和減少兒童結核病,特別是結核性腦膜炎、血行播散性結核病的發揮起著重要作用，但是對于青少年和成人保護效果差異較大,不同的人群和不同地區的保護力從0%80%不等,尤其是對HIV感染者無法接種卡介苗以提供保護。鑒于以上原因，國內外進行了大量結核新疫苗的研究工作，包括重組卡介苗（rBCG）、DNA疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、全菌體滅活疫苗等，希望能夠替代或加強卡介苗的保護作用，但到目前為止，結核新疫苗的保護作用并未超過卡介苗，因此盡管卡介苗保護效果差、但還將繼續使用，當今結核新疫苗研究方向應該是對不同的人群采用不同的疫苗和免疫策略。針對新生兒預防結核感染的免疫，可采用初免用加強型疫苗，該疫苗為替代卡介苗的新疫苗，能產生更強保護力, 以降低結核的感染率；而對于結核病高危人群的預防，可采用初免-加強（Prime- Boost）免疫策略，即初次免疫和加強免疫用不同的疫苗。如初免可用DNA疫苗或亞單位疫苗，加強免疫用BCG、不同載體的DNA疫苗或抗結核藥等。此種免疫策略期望達到強于卡介苗的保護效果而預防感染。另外感染結核菌未發病者為結核潛伏感染人群，機體免疫力一旦低下，潛伏的結核桿菌復燃導致活動性結核病的發生，此類人群用疫苗，是預防已感染者發病的疫苗，是目前結核新疫苗研究的難度與熱點，首先面臨的是有效篩選出潛伏感染者。以結核桿菌特異性抗原為基礎，發展簡單、易行、價廉的篩查方法，在我國已經取得一定的進展9-10。我國是結核高負擔國家之一，目前結核桿菌感染人群已有5億，加強對新疫苗研究的投入，實施主動預防、控制已感染者發病，是結核病控制的重要途徑。 參考文獻：1. Hawgood BJ. Doctor Albert Calmette 1863-1933: founder of antivenomous serotherapy and of antituberculosis BCG vaccination. Toxicon, 1999; 37(9): 1241-1258.2. 國家藥典委員會， 2010版 中華人民共和國藥典 三部，中國醫藥科技出版社，2010，80-82。3. Bedwell J, Kairo SK, Behr MA, et al , Identification of substrains of BCG vaccine using multiplex PCR Vaccine,2001 Feb 28;19(15-16):2146-2651.4. Markey K, Ho MM, Choudhury B,Report of an international collaborative study to evaluate the suitability of multiplex PCR as an identity assay for different sub-strains of BCG vaccine. Vaccine. 2010 Oct 8;28(43):6964-95. 趙愛華，賈淑珍，寇麗杰，等 國內外卡介苗的分子遺傳學特性,中國生物制品學雜志，2009 22(5):583-587。 6. 趙愛華，喬來艷， 賈淑珍，等 我國生產用卡介苗的傳代穩定性，中國生物制品學雜志，2009 22(11):1102-1104。7. Ho MM, Markey K, Rigsby P, Report of an International collaborative study to establish the first WHO reference reagents for BCG vaccines of three different sub-strains. Vaccine. 2011 Jan 10;29(3):512-8.8. 趙愛華，賈淑珍，寇麗杰，等.應用四唑鎓鹽（XTT）法快速檢測卡介苗活菌含量，中國醫藥生物技術，2009，4（1）：33-36.9. 徐苗，陳保文，沈小兵，蘇城，王國治. 重組Esat-6變態反應原對結核病的早期發現的應用價值，中國防癆雜志，2004，26（S）：36.10. 徐苗，羅永艾，黎友倫，陳保文，沈小兵，蘇城，王國治.重組結核分支桿菌11kD蛋白對結核分支桿菌感染的鑒別作用，中華結核和呼吸雜志，2006，29（11）：762-765.流感病毒裂解疫苗通用名稱： 流行性感冒病毒裂解疫苗英文名稱：Influenza Vaciine （Split Virion）, Inactivated漢語拼音：Liugan Bingdu Liejie Yimiao流行性感冒（以下簡稱流感）病毒可引起急性呼吸道傳染病，其危害性在于傳染性強，常引起本病的流行甚至引起世界大流行。目前，接種流感疫苗是預防流感和控制其流行的最有效的措施。 國際上普遍現使用的疫苗均為純化的滅活疫苗，包括流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒亞單位疫苗。早期的流感病毒滅活疫苗只是有限的純化后制成，疫苗接種后全身和局部副反應大。20世紀60年代，超速離心機和色譜技術的應用，研制出真正意義上的純化全病毒滅活疫苗，盡管接種副反應大副降低，但對于兒童使用時仍出現不良反應。將病毒顆粒裂解后制成的純化裂解病毒疫苗，接種副反應大大降低。20世紀70-80年代，將病毒裂解后，提純血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）， 研制出亞單位疫苗。流感亞單位疫苗接種后雖然不良反應明顯降低，但免疫原性不及流感全病毒滅活疫苗。流感減毒噴鼻疫苗已經獲得美國FDA批準上市，但使用減毒活疫苗應慎重考慮使用安全的問題， 比如疫苗株病毒與野毒病毒株重配產生毒性更強的新型流感病毒，因此這種疫苗只在少數國家有限地使用。新型佐劑疫苗的研發成功提高了流感疫苗對機體的體液免疫反應和細胞免疫反應，美國已經研制成功以MF59水/油乳劑作為佐劑的新型佐劑流感疫苗。目前， 國際上正在加緊研制應用細胞培養生產流感疫苗，提高規模化生產，避免了傳統的采用雞胚技術生產流感疫苗的諸多問題。另外，核蛋白合成肽疫苗、DNA疫苗以及能夠預防各種亞型流感病毒， 特別是大流感病毒感染通用流感疫苗已成為當前研究的熱點。我國1979年版和1990年版生物制品規程均收載了“流行性感冒活疫苗制造及檢定規程”，該制品為非經純化的單價甲型流感減毒活病毒外用鼻噴制劑。2005年版中國藥典三部開始收載“流感全病毒滅活疫苗”；2010年版中國藥典三部增加收載了“流感病毒裂解疫苗”。2008年版歐洲藥典（6.0版）收載了“流感全病毒疫苗（雞胚/細胞培養）”、“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亞單位疫苗（雞胚/細胞培養）”、“流感病毒亞單位病毒體疫苗”； 2009年版英國藥典收載了“流感病毒裂解疫苗”、“流感病毒亞單位疫苗”、 “流感全病毒疫苗”。2010年版美國藥典（32版）收載了“流感疫苗”， 但其中內容僅為概要性的描述。 一、 制造概要 目前季節性流感疫苗生產用病毒株（包括甲型H1N1、 H3N2以及B型毒種）由世界衛生組織（WHO）流感參比研究中心推薦和提供、經國家藥品管理部門批準后依據批準的生產工藝投產。WHO提供的疫苗生產病毒株均已適應于雞胚培養，接種雞胚后可快速大量增殖的病毒用于疫苗生產。目前，國內外現批準上市的流感疫苗均系采用傳統的雞胚培養技術生產。將各型流感病毒分別接種雞胚尿囊腔后，在適宜的溫度下培養適宜的時間， 收獲含有流感病毒的雞胚尿囊液、加入適宜濃度的甲醛滅活病毒（病毒滅活也可在純化后進行），經純化后，去除大量的雞胚雜蛋白成分， 純化后的病毒液中加入適宜的裂解劑裂解病毒， 裂解后的病毒液采用適宜的方法再次進行純化，進一步去除雞胚蛋白成分和流感病毒的核酸RNA等雜質。經除菌過濾后制成單價病毒原液。 將制備的三個亞型的病毒原液按標示量的血凝素含量進行混合配制后制成三價流感病毒裂解疫苗。疫苗中可含有防腐劑， 用于預防與疫苗株抗原性相同的流感病毒引起的流行性感冒。二、 制造 生產用雞胚各型流感病毒株在種子批系統建立過程中，毒種傳代必須使用來源于SPF雞群的雞胚， 以最大程度避免種子批制備過程中污染禽外源感染因子，特別是禽白血病病毒和禽腺病毒。由于全球SPF雞胚的供應遠不能滿足生產的需要，同時，考慮到疫苗生產工藝中對流感病毒滅活的同時對雞胚可能引入的潛在外源因子也具有滅活作用，因此，WHO相關指南規定， 流感病毒滅活疫苗的生產可使健康雞群來源的雞胚。目前， 國內外流感滅活疫苗生產普遍遵循這一原則。疫苗生產使用上通常選用9-11日齡的雞胚， 此階段胚蛋的尿囊液體積量最大、組織蛋白成分含量相對較低， 可獲得更多量的病毒液。雞胚投入生產前，每枚蛋胚都要應經過燈檢篩查，挑選表面清潔無畸形、血管清晰、存活的雞胚用于生產。由于白色雞蛋易于進行雞胚篩查，國內生產用雞胚通常選擇來自“海蘭白”、“海蘭灰”等品種的雞群。【名稱和來源】對于季節流感疫苗而言，生產用毒種通常包括甲型（H1N1、 H3N2）和乙型（B型）。 流感病毒HA抗原容易發生變異，一般說來， A型流感病毒株普遍在HA上可被保護性抗體識別的區域每年會有34個氨基酸的改變， 每25年，這些突變的積累就引起了先前一個周期的毒株的抗原漂移， 從而導致人體通過既往流感疫苗接種或自然感染后產生的免疫不能對新型流感病毒的流行產生保護，因此， WHO建立了遍布全球99個國家的128個流感實驗室的全球流感監測網絡，根據全球流感病毒流行情況和對流感病毒流行株抗原基因序列分析和比對，以及新型病毒在全球傳播的可能性，每年提出建議，對流感疫苗生產用病毒株適時更換。WHO推薦的疫苗株是采用基因重配方式構建的毒力減弱、適合于雞胚培養、病毒產量相對較高的毒株。WHO于每年的2月份和9月份分別向全球發布北半球、和南半球流感病毒的流行情況，推薦可用于流感疫苗生產的病毒株，并由WHO 流感參比研究中心，包括美國疾病控制與預防中心（CDC）、英國國立研究院（NIBSC）、 澳大利亞墨爾本原聯邦血清實驗室（TGA）和日本國立公共衛生研究院向各國生產企業提供用于季節流感疫苗生產用毒種和檢定用抗原參考品和抗體參考品。對于流感疫苗株的使用，WHO指南中規定，生產用疫苗株應得到國家管理當局的批準； 美國藥典規定，生產用毒株應由美國公共衛生部推薦并由國家流感專家委員會指定；在我國，生產用疫苗株應具有合法來源，明確毒株的名稱、毒種來源的代次以及相關的傳代背景資料等，并經國家藥品管理部門的批準。 【病毒種子批的建立】建立疫苗生產用病毒種子批系統的主要目的是為了使生產的不同批次疫苗間最大限度保持質量的一致性、穩定性、可控性和可溯源性。應按照中國藥典三部通則中“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”的要求建立種子批系統。由于流感疫苗生產用毒株是由WHO流感病毒參比中心提供。生產企業應根據WHO流感實驗室提供各型毒株的代次，相應建立主種子批和工作種子批。WHO提供各型疫苗株的代次往往不盡相同、且每年都有新的疫苗株更換，因此流感疫苗不象其他疫苗一樣種子批代次相對固定，為此在2005年版藥典三部中未對該品種種子批毒種規定限定代次。考慮到流感病毒在擴增復制過程中抗原容易發生改變，所以傳代次數過多可能影響到毒株的抗原穩定性，因此，在滿足生產需要的前提下，應盡可能使用早代的毒種用于生產。歐洲藥典中規定，自批準的重配株或批準的流感病毒分離時的代次至工作種子批毒種的傳代不超過15代， 生產的疫苗為自工作種子批毒種擴增1代制成。根據目前國內生產企業在獲得疫苗株后建立種子批的情況，通常是將來源WHO的 疫苗株接種SPF雞胚連續傳12代建立主種子批，由主種子批毒種接種SPF雞胚連續傳12代建立工作種子批，工作種子批毒種擴增1代制備成疫苗。據此，本版藥典三部明確規定，以WHO推薦并提供的流感毒株代次為基礎，傳代建立主種子批和工作種子批，至成品疫苗病毒總傳代不得超過5代。 【種子批檢定】由WHO流感實驗室獲得的各型流感毒株經擴增后應進行全面檢定，以證明該毒株可用于疫苗的生產， 檢定項目至少應包括鑒別、無菌、支原體檢查、病毒滴度、血凝效價以及外源性禽白血病病毒和外源性禽腺病毒等檢測， 檢測合格的毒種建立主種子批。由于種子批建立均采用SPF雞胚制備， 因此主種子批檢定合格的工作種子批可不進行禽特異性外源因子的檢查，包括禽白血病病毒和禽腺病毒，但至少應進行鑒別、無菌、支原體檢查、病毒滴度、血凝效價等項目的檢查。 1. 鑒別試驗鑒別試驗常用方法是血凝抑制試驗。因為流感病毒顆粒表面的HA蛋白含有識別和結合宿主細胞表面受體的結構。 流感病毒的受體為含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，一些哺乳動物和禽的紅細胞表面均含有此兩種成分， 能被流感病毒所識別和結合， 并發生紅細胞凝集現象。如果在病毒液中加入針對流感病毒血凝素的特異性免疫血清，可抑制紅細胞凝集現象的出現，通過特異性免疫血清對病毒血凝現象的抑制， 可對流感毒進行鑒別。 試驗用紅細胞通常為1%的雞紅細胞， 為所作試驗的特異性，檢測的同時做所用免疫血清對照、紅細胞對照和抗原對照。鑒別試驗還可采用單向免疫擴散試驗（SRID）檢測，即將含有一定量抗流感病毒抗體參考品的1.5%瓊脂糖凝膠板上打孔， 將抗原參考品對照和供試品分別加入到相應的孔內，供試品與相應（亞）型特異性抗體參考品產生相應沉淀環，結果證明其抗原性與推薦的病毒株相一致。試驗使用的抗原參考品和抗體參考品來源于WHO流感參比研究中心。2. 病毒滴度2010年版中國藥典三部種子批檢定中增加了病毒滴度的檢測，該檢測可對病毒在雞胚中的擴增的病毒量進行檢查，以評價疫苗株在雞胚中的復制能力，同時也是有效確定生產疫苗時工作種子批的稀釋依據， 可控制每枚雞胚所接受的病毒量。采用半數雞胚感染劑量法（EID50）檢查，將毒種10倍系列稀釋，每個稀釋度接種10個雞胚尿囊腔，每胚0.2ml。培養48-72小時后篩選活胚，冷胚后取尿囊液進行紅細胞凝集試驗，紅細胞為1%的雞紅細胞。根據檢測結果計算病毒滴度，應不低于6.5LgEID50/ml。3. 血凝滴度血凝滴度檢測和病毒滴度檢查同樣可對流感病毒的復制能力進行評價，由于流感疫苗主要以血凝素含量評價做為效力指標，因此血凝效價的測定和結果對于評估疫苗生產毒種而言比病毒滴度的測定更客觀、可信和重要。檢測方法是取毒種進行系列稀釋（一般為10倍系列稀釋），將每個稀釋度的病毒液與等量的 1雞紅細胞懸液混合于2025放置60分鐘，觀察紅細胞凝集相，以病毒最高稀釋度為判定終點，血凝效價應不低于1：160。4. 特異性禽外源因子檢查包括禽白血病病毒和禽腺病毒檢測。將供試品與分別相應（亞）型的流感病毒特異性性免疫血清中和后，接種敏感細胞，經培養后采用酶聯免疫法或血清學方法進行檢查， 結果應為陰性。【毒種保存】一般情況下，主種子批毒種應凍干于20以下長期保存， 以保證種子批的性狀穩定。一旦第二年WHO公布的流感疫苗株的一株或幾株不變更，則該凍干毒種由于已經過全部檢定并經前一年疫苗生產的實踐驗證為安全有效，可重新制備工作種子批用于當年流感疫苗的生產， 無需重新向WHO索取相應的疫苗株。但如果不考慮該因素，由于流感疫苗生產用毒種經常更換，可能來年的毒種與今年完全不一致，因此主種子批毒種也不一定需要凍干，制備的液體主種子批保存于60以下也不失為明智之舉。工作種子批由于使用量較大，且往往當年使用，則一般均以液體毒種經檢定符合規定后60以下凍存。 【單價病毒原液】單價病毒原液制備的主要工藝步驟包括：將毒種接種雞胚尿囊腔、 培養、病毒收獲、純化，滅活、裂解、再純化等組成。1. 病毒接種、培養為保證生產工藝的一致性，生產企業應當依據本企業制備的各型流感病毒工作種子批的病毒滴度，根據每一雞胚應接種的病毒量和體積計算，稀釋成每ml單位內的病毒滴度，并應遵守同一工作種子批以同一病毒量接種雞胚。由于疫苗生產使用健康雞群來源的雞胚， 因此疫苗生產工藝過程無法保證完全無菌狀態，為最大限度控制培養過程中的微生物的污染，毒種稀釋液中可加入最低有效抑菌濃度的抗生素。對于在毒種稀釋液中使用抗生素的，應按2010年版中國藥典三部的有關規定進行檢測，生產工藝其他階段不得加入任何抗生素。 稀釋后的毒種接種雞胚尿囊腔，我國生產企業現行接種雞胚的工藝有機械全自動或人工接種兩種方式，病毒接種的關鍵在于接種部位的正確性，應當正確接種在尿囊腔中，如接種不正確而破壞尿囊腔可導致雞胚死亡。每胚接種病毒液0.2ml， 通常情況下，于3335oC 下進行培養， 由于不同型別的病毒在雞胚中的復制能力不同，因此培養時間亦有差異，不同型別的流感病毒培養時間一般約為4872小時。 2. 尿囊液收獲培養到期后，經燈檢篩選活的雞胚置2-8 oC 過夜或16小時左右冷胚后開始收獲尿囊液,冷胚的目的是使雞胚減少活動度并使雞胚遇冷后血管收縮，易于收集尿囊液。目前收獲方式由機械全自動、 半自動以及人工收獲不同方法。使用機械化自動收獲尿囊液的量較人工收獲方法高。嚴格剔除死胚和控制收獲器具的消毒是有效降低尿囊液細菌內毒素含量的關鍵。每個收集容器中的尿囊液應逐一取樣進行檢定。3. 尿囊收獲液檢定31 微生物限度鑒于流感疫苗采用健康雞群來源的雞胚生產， 生產工藝中間產物容易污染細菌， 為最大程度降低有此造成的潛在風險， 生產工藝的各中間環節進行應有效控制微生物的污染程度，加強污染的監控。鑒于此，2010年版中國藥典三部新增了尿囊收獲液檢定，包括微生物限度檢查以及特定病原微生物檢查。微生物限度檢查可采用2010年版藥典三部附錄的“微生物限度檢查法”中“細菌、 霉菌及酵母菌計數”法檢查， 即用將適當稀釋的供試品接種到適宜的培養基上培養，培養到期后進行菌落計數并根據供試品稀釋倍數計算出供試品中的總菌數。也可以采用其他適宜的檢測方法作為輔助方法，對尿囊液的污染程度進行有效的控制。雞胚中污染沙門氏菌， 將對人體產生潛在的危害， 因此，對于沙門氏菌等致病菌應進行特異性檢測。本版中國藥典三部“微生物限度檢查”中“控制菌檢查法”中， 載明了采用培養基與生化反應培養結合的方式檢測沙門氏菌。 在充分驗證方法一致性的前提下， 也可采用經批準的沙門氏菌檢測試劑盒進行快速篩查。 4. 病毒滅活由于收獲的尿囊液不可避免地存在一定數量的微生物污染，因此， 尿囊液收獲后應盡快采用有效的滅活工藝進行病毒滅活，盡可能降低或不增加尿囊液中微生物載荷。 （1）病毒滅活劑可采用甲醛或-丙內酯，目前， 國內批準上市的均采用甲醛作為滅活劑。甲醛對病毒核酸和病毒蛋白質都有破壞作用，蛋白質含量對限定甲醛濃度的滅活效果至關重要， 所以病毒滅活應在工藝驗證規定的蛋白質含量范圍內進行。在控制蛋白質含量的檢測方法上， 國內生產企業通常采用Lowry法檢測蛋白質含量，國外有些生產企業采用更為便捷的分光光度法控制中間產物的蛋白質含量， 檢測波長為280nm的吸收值， 因蛋白質在280nm處有最大的吸收峰， 以此作為蛋白質含量監測的參考指標， 以保證滅活工藝的穩定性。（2）WHO指南和歐洲藥典中均規定病毒滅活工藝應在2-8下進行。國內企業病毒滅活一般采用一步法滅活， 滅活溫度通常為2-8； 國外有的企業采用二步法滅活工藝， 即在2-8冷滅活一定時間后， 再于25放置一定時間進行熱滅活。 對于甲醛滅活劑的濃度， 歐洲藥典規定， 且生產工藝任何階段加入的滅活劑的濃度不得超過200ug/ml； WHO指南規定甲醛使用濃度不超過400 ug/ml；為控制甲醛對病毒抗原性的影響， 本版中國藥典三部規定的甲醛終濃度不高于200g/ml； 對于病毒滅活時間， 國內外均沒有統一的要求， 應根據各生產企業的生產工藝和驗證結果進行確定， 并按照批準的病毒滅活時間執行。（3）國內現批準的流感病毒裂解疫苗病毒滅活工藝可在不同工藝階段進行，有些企業的標準是在尿囊液收獲后立即進行病毒滅活， 有些是在病毒純化后滅活。國外生產企業的病毒滅活工藝都是在病毒純化后進行，避免了尿囊液中含有大量的組織蛋白，影響甲醛對病毒的作用； 同時， 純化后的尿囊液中極大部分雜蛋白被有效去除，且經過超濾濃縮后病毒液體積大大降低，可減少病毒滅活驗證試驗檢測樣品的數量，抽樣檢測的結果更具有代表性； 另外， 純化工藝一定程度上可降低尿囊液中污染的微生物數量，因此， 從工藝優化的角度講，病毒滅活工藝在純化