CHIP PROTOCOL（基于millipore EZ-CHIP catalog#17-371）：實驗原理：在活細胞狀態下固定蛋白質DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。 實驗步驟：第一天：【實驗材料準備】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號tip，1.5ml EP管，200ul PCR管。【實驗儀器準備】： 臺式低溫離心機，超聲儀，電泳設備一套，旋轉混勻儀，層析柜。【實驗試劑準備】：SDS lysis buffer復溫，使其充分溶解，避免沉淀；protease inhibitor cocktail室溫下充分解凍；PBS預冷（若使用試劑盒提供10xPBS，使用前還需用去離子水稀釋成1xPBS工作液）。（一）、細胞的甲醛交聯與超聲破碎*。1、收集細胞（1-2x107），加入37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（0.7%）。2、室溫孵育10min（精確計時）。3、及時終止交聯：加10x甘氨酸終濃度為1x。混勻后，在室溫下放置5min。4、沉淀細胞（700g 4 2-5min），用冰冷的PBS清洗細胞2次。5、棄上清（細胞沉淀可以暫時凍存于-80備用）。6. 準備裂解液（1ml SDS lysis buffer+5ul protease inhibitor cocktail）；按照細胞量（1x107 hela細胞對應1ml SDS lysis buffer）加入SDS Lysis Buffer，重懸細胞。分裝成300-400ul1管（裂解產物可以-80凍存備用）。7、超聲破碎（根據具體情況調整）：普通超聲儀： 3檔 沖擊15s 冰上放置45s 共5次Bioruptor超聲神器： 中檔 沖擊15s 停頓45s 14次（更均一更集中）8、瓊脂糖凝膠電泳鑒定：取1x105個細胞，加入CHIP dilution buffer至終體積50ul，進行解交聯后電泳Option1a. 加入RNase A（10mg/ml）1ul，37孵育30分鐘。b. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小時。c. 取上清跑膠（2%瓊脂糖凝膠 電壓130V 時間20min），smear條帶集中在200-1000bp即可，500左右為佳。 Option2a. 加入蛋白酶K 1ul，62孵育2小時。 b. 每50ul樣本加入0.25ml結合試劑A（5倍體積），充分混勻。 c. 將上述混合液轉移至吸附柱中，吸附柱放在收集管內。 d. 1000015000g離心30秒，去下清。 e向吸附柱內加入洗滌液B 500ul，1000015000g離心30s，去下清。 f. 空離30s，1000015000g。 g. 將吸附柱轉移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脫液C，1000015000g離心30s，洗脫液即為純化回收的DNA。 h. 取上清跑膠（2%瓊脂糖凝膠 電壓130V 時間20min），smear條帶集中在200-1000bp即可，500左右為佳。9、離心去除不溶物質（1000015000g 4 10min），收集上清，分裝至100ul 1管，-80可保存2個月。【實驗補充及注意事項】：1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的為X-ChIP，而不需要固定的為N-ChIP。native ChIP主要用于組蛋白修飾、核小體定位的研究,由于組蛋白與DNA之間的作用力較強，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是讓DNA結合蛋白與DNA之間保持一種自然狀態，采用微球菌核酸酶對染色質進行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交聯反應, 因為它們本身來說和DNA結合的非常緊密. 組蛋白H2A和H2B并不是緊密聯接,但是在native ChIP中依然可以不需要交聯反應.X-CHIP適用于結合力較弱的DNA-蛋白質相互作用的研究。2、當用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會產生共價鍵。例如細胞內，當TF與Promoter相互結合（生物意義上的結合）時，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產生共價鍵。甲醛的交聯反應是完全可逆的，交聯的進程可被加入的甘氨酸終止。3、交聯時間需要預實驗來確定。交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失，另外基因組上結合了太多的蛋白，也會增加背景；交聯時間如果過短，則交聯不完全，產生假陰性。4、超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。使用普通超聲儀時超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。5、有研究建議解交聯后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，具體步驟如下：取5ul超聲破碎后產物，加入5MNaCl（終濃度為0.2M NaCl），65處理2h解交聯，電泳檢測超聲效果。一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp1000bp（以3個核小體左右大小為宜，大約500bp左右）。普通超聲儀效果：Bioruptor超聲效果：（二）、預清潔及抗體孵育。10、準備足夠Dilution buffer（900ul dilution buffer+4.5ul protease inhibitor cocktail）。11、每100ul的超聲破碎產物中（冰上解凍），加入900ulChIPDilutionBuffer。再各加入60ulProteinGAgarose/SalmonSpermDNA（預清潔），4旋轉混勻1h*。12、1h后，在4靜置2min沉淀，4 3000-5000g離心1min。13、取上清，每個樣本留取10ul做為input，4保存備用*。14、收集剩余約1ml上清至新EP管，加入IP抗體（具體加入抗體量具體調整）*。 陽性對照：加入1ug anti-RNA polymerase抗體 陰性對照：加入1 ug目的抗體來源種屬的IgG 實驗組：加入目的抗體（1-10ug，可根據抗體說明書決定用量，一般3ug左右）15、4旋轉混勻過夜（12-16h）。【實驗補充及注意事項】1、吸取瓊脂糖珠子的中號tip需減頭，避免機械力破壞珠子，且珠子需充分混勻。2、鮭魚精子DNA包被瓊脂糖珠子，因為鮭魚精子用于降低降低染色質DNA與瓊脂糖珠子的非特異性結合。Proterin A/G可以與抗體Fc段結合。蛋白質A結合到IgG的Fc部分。蛋白質G選擇性結合到IgG的Fc部分，但也能結合到Fab區域，因此可用于純化IgG1的Fab片段。 3、input是用來檢查PCR系統是否work。4、抗原抗體之間的結合是通過抗體特異性的識別抗原表位并結合的，有的抗體識別的抗原表位比較小，不容易暴露，在ChIP實驗中容易被DNA包裹，從而使抗體無法結合，因此用來做ChIP的抗體一般是需要經過chip實驗驗證的，必須是IP級別的抗體。5、單抗與多抗的選擇：單抗特異性強，背景低。但是單抗有一個致命的弱點，就是識別位點單一，而在ChIP甲醛交聯的過程中，很有可能該位點被其它蛋白或核酸結合而被封閉，導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題，但是多抗特異性較差，背景可能會偏高。一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結合的區域），選擇多抗比較穩妥一些。第二天：【實驗材料準備】： 1000ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號tip，1.5ml EP管。【實驗儀器準備】： 臺式低溫離心機，旋轉混勻儀，層析柜，水浴鍋（調節水浴鍋溫度到65備用）。【實驗試劑準備】：室溫充分溶解1M NaHCO3。（一）、免疫復合物的沉淀及清洗。16、孵育過夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4旋轉孵育1h。17、4靜置10min后，4 30005000g離心1min。除去上清。18、依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟：加入1ml洗滌液，在4旋轉孵育3-5min，4靜置2min沉淀，3000-5000g離心1min，除去上清。洗滌溶液*：a.low salt wash buffer-1次b.highsalt wash buffer-1次c.LiCl wash buffer-1次d.TE buffer-2次19、洗脫：洗脫液的配方：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3，170ulddH2O，共200ul。Input管加入200ul洗脫buffer，室溫下備用；IP管加入100ul洗脫液，輕柔彈勻，室溫孵育15min，離心（4 3000-5000g 1min）后，收集上清至新EP管。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管200ul。20、解交聯*：每管中加入8ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。混勻，65解交聯，時間4-5h或者過夜。（解交聯后樣本可凍存在-20備用）【實驗補充及注意事項】： 1、頭四次洗滌不要求完全棄上清，避免反復及不必要的樣本丟失，最后一次要求盡量去除干凈上清。 2、雖然說明書上說4小時已經足夠，但是建議解交聯過夜。因為在那樣環境里，DNA不會降解，過夜解交聯更充分些。注意在EP管口封上封口膜（避免樣本蒸干）。 第三天：【實驗材料準備】： 1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小號tip，1.5ml EP管。【實驗儀器準備】： 臺式低溫離心機，水浴鍋（調節水浴鍋溫度到37備用）。【實驗試劑準備】：充分解凍RNaseA、蛋白酶K，準備足量0.5MEDTA及1MTris.HC，CHIP配套DNA回收試劑、收集管、吸附柱，或者Promega回收試劑盒A9281，95%乙醇，漂浮板。（一）、DNA樣品的純化回收21、解交聯結束后，每管加入1ul RNaseA，37孵育30min。22、每管加入4ul 0.5MEDTA，8ul1MTris.HCl，1ul蛋白酶K（可預先配成mix）。水浴鍋45處理1-2h。23、DNA片段的回收Millipore：a. 每管加入1ml 結合試劑A（5:1體積），混勻，終體積1200ul。 b. 將樣本與結合試劑混合液分兩次轉移至吸附柱（吸附柱放置在收集管內），每次600ul，離心（10000-15000g 30s）棄下清。 c. 500ul 洗滌試劑B洗滌吸附柱，離心（10000-15000g 30s）棄下清。 d. 空離（10000-15000g 30s）后，將吸附柱轉移至新收集管。 e. 向吸附柱中央吸附膜上滴加50ul洗脫試劑C，離心（10000-15000 30s），棄吸附柱，收集管內洗脫液即為純化回收的DNA樣本，可以凍存在-20供后續分析。promega膠回收試劑盒：a. 第一次打開試劑盒時，MWS中加入95%乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。b. 加等倍體積的MBD至膠中（膠體350mg，點離；c. 55-65C水浴10分鐘，水浴過程中每隔2-3分鐘振蕩EP管一次，以幫助凝膠溶解；d. 將SV微型柱置于2ml的收集管中，待上一步的所有液體冷卻至室溫后，將其加入離心柱中，室溫孵育1min，13,000rpm離心1分鐘；e. 棄掉廢液，將離心柱放回收集管中；f. 向離心柱中加入700ul的MWS，13,000rpm離心1分鐘，倒掉廢液，將離心柱放回收集管中；g. 向離心柱中加入500ul的MWS，13,000rpm離心5分鐘； h. 倒掉廢液，將離心柱放回收集管中， 13,000rpm再離心2分鐘；i. 將離心柱放入干凈的1.5mlEP管中，室溫干燥2分鐘，再向離心柱的膜中央懸空滴加50ul的無酶水，室溫孵育1分鐘后，13,000rpm離心1分鐘，所得液體即為純化的PCR產物。j. 將上述所得液體重新懸空滴加至離心柱膜中央，室溫孵育1分鐘后13,000rpm離心1分鐘。k. 純化后的PCR產物于-20C保存。【實驗補充及注意事項】;1、樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產物回收試劑盒回收，很有可能會在最終的樣品中混入SDS，影響PCR實驗結果。小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀（網絡意見尚未驗證）。實驗結果分析【CHIP-qPCR】：假設對照組S1，實驗組S2計算如下：Input Dilution Factor=100（fraction of the input chromatin saved) -1 (-1次方)）% InputNormalized (S1)：1） Ct normalized ChIP (S1)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor) Ct normalized ChIP (IgG/NIS)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Dilution Factor)2）% InputAntibody = Log2 (-Ct normalized ChIP) % InputIgG/NIS = Log2 (-Ct normalized ChIP)3）%InputNormalized (S1)= % InputAntibody - % InputIgG/NIS% InputNormalized (S2)計算：1)Ct normalized ChIP (S2)= (Ct ChIP - (Ct Input -Log2 (Input Diluti