.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及無血清培養(yǎng)研究進(jìn)展摘要：細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)中一項(xiàng)重要技術(shù)，應(yīng)用較為廣泛，目前已滲透到細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。其中動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程中最常用的技術(shù)手段，而且動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。本文主要介紹了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和其中發(fā)展較快的無血清培養(yǎng)技術(shù)的研究應(yīng)用進(jìn)展。為未來實(shí)際的研究和生產(chǎn)作一些總結(jié)和展望。關(guān)鍵詞：動(dòng)物細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；無血清培養(yǎng)基1 引言組織培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建于18世紀(jì)末，之后于1907 年美國生物學(xué)家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基在試管中培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織宣告成功后，才逐漸發(fā)展成為一種從機(jī)體獲取細(xì)胞，模擬體內(nèi)生存環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖并維持結(jié)構(gòu)和功能的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。這種技術(shù)為細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)的研究和應(yīng)用做出了重要貢獻(xiàn)。近年來生命科學(xué)迅速發(fā)展，各種在分子水平的實(shí)驗(yàn)如核移植、細(xì)胞雜交、DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移等，都是借助細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)而得以實(shí)現(xiàn)的。然而各領(lǐng)域的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展并不平衡，存在許多的局限性，使用范圍有限，還未出現(xiàn)適合整個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域的培養(yǎng)體系。因此本文對細(xì)胞培養(yǎng)及大規(guī)模培養(yǎng)、無血清培養(yǎng)做一些總結(jié)。2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式包括原代和傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)方式有貼壁、懸浮以及固定化培養(yǎng)等方式。2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)指的是從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，并為其提供一個(gè)無菌、具有適當(dāng)溫度及酸堿度的環(huán)境，給予充分營養(yǎng)，使其生長繁殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)式細(xì)胞培養(yǎng)最初的階段，也稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)式細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)中重要的必經(jīng)環(huán)節(jié)。原代培養(yǎng)細(xì)胞生長到一定時(shí)候后，由于受群體環(huán)境影響，需要轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器，這種培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。傳代后的動(dòng)物細(xì)胞與原代培物形狀一致的話，則表示傳代成功，這些細(xì)胞稱為細(xì)胞系或細(xì)胞株。2.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的內(nèi)容2.2.1培養(yǎng)的環(huán)境要求1）無菌無毒：無菌無毒的操作環(huán)境是保證動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)成功的前提。體外培養(yǎng)細(xì)胞面臨著被微生物感染或受自身代謝物質(zhì)影響的難題，因此，在進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要及時(shí)清除細(xì)胞產(chǎn)生的代謝廢物，確保為體外培養(yǎng)的細(xì)胞提供一個(gè)無菌無毒的生存環(huán)境。2）氣體：氣體主要是O2 和CO2，O2 可以給細(xì)胞提供能量，而CO2 不僅是細(xì)胞增殖所需的物質(zhì)，也是其自身的代謝產(chǎn)物，此外，CO2 還有著調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 的作用。3）溫度：適宜的溫度能夠維持細(xì)胞持續(xù)旺盛生長，若溫度超出適宜溫度范圍，不僅會(huì)影響到細(xì)胞的正常代謝，損傷細(xì)胞，甚至?xí)蛊渲滤馈?）緩沖環(huán)境：緩沖環(huán)境的作用是為細(xì)胞提供一個(gè)酸堿度在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)的培養(yǎng)液，提供水分和無機(jī)鹽，維持細(xì)胞的正常代謝。5）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩種，它是細(xì)胞生長繁殖的直接環(huán)境，為細(xì)胞提供所需的營養(yǎng)。天然培養(yǎng)基是從動(dòng)物體液或組織中分離提取獲得的。血漿、血清以及淋巴液等物質(zhì)都可作為天然培養(yǎng)基。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用的是合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基含細(xì)胞生長所需的無機(jī)鹽、糖類、維生素、氨基酸等基本物質(zhì)，有特殊要求的還會(huì)添加適量血清。2.2.2培養(yǎng)方式1）貼壁培養(yǎng)：對于那些具有貼壁依賴性的細(xì)胞一般使用貼壁培養(yǎng)的方式。一般這樣的細(xì)胞需貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)的表面生長，最終在表面生長至單層，當(dāng)整個(gè)平面被鋪滿時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象。2）懸浮培養(yǎng)：懸浮適應(yīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等非貼壁依賴性細(xì)胞不需要生長的支撐面，細(xì)胞可懸浮于液體培養(yǎng)基，并大量增殖。因此，懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的理想方式。盡管，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)中存在著各式各樣的困難，科研人員還是會(huì)不斷提高分子生物學(xué)的研究水平，擴(kuò)大研究范圍，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是多個(gè)學(xué)科研究領(lǐng)域當(dāng)中重要的工具。3）固定化培養(yǎng)：無論是貼壁依賴性細(xì)胞還是非貼壁依賴性細(xì)胞都可用固定化培養(yǎng)方式進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)屬于包埋培養(yǎng)方式，目前已有的固定化培養(yǎng)方式包括微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)以及微囊發(fā)培養(yǎng)三種方式。固定化培養(yǎng)不僅剪切力較低，傳遞效果較好，而且還易于收集并分離純化細(xì)胞產(chǎn)物。用此種方式培養(yǎng)的細(xì)胞也具有較強(qiáng)的抗污能力，細(xì)胞生長較為集中，生長密度也高。2.2.3原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)將動(dòng)物的器官或組織用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放在適宜的條件下培養(yǎng)，一般細(xì)胞繁殖110 代，就發(fā)生接觸抑制，這種培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞由于接觸抑制不再分裂，還要用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理后，再分瓶培養(yǎng)，讓細(xì)胞繼續(xù)增殖，這種培養(yǎng)叫傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)一般傳至1050代就不能再分裂了，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)未發(fā)生變化，形成的細(xì)胞群叫細(xì)胞株。傳代培養(yǎng)過程中有個(gè)別細(xì)胞傳至50代以后，由于遺傳物質(zhì)改變，失去接觸抑制，成為無限增殖的癌細(xì)胞形成的細(xì)胞群，叫細(xì)胞系。3無血清培養(yǎng)3.1血清血清是一種很好的營養(yǎng)物質(zhì)，絕大多數(shù)細(xì)胞在含有胎牛或新生牛血清的培養(yǎng)基中生長得最好，但它來源比較難，而且它的成分不確定，使得生長過程不易檢測和控制。任何血清使用前必須經(jīng)過鑒定，只有無菌、無內(nèi)毒素、無溶血或低溶血、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)素達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)以上的血清才能使用。有的細(xì)胞，能在無血清培養(yǎng)基中生長，用漸適法可使本來需要血清的細(xì)胞適應(yīng)于在無血清培養(yǎng)基中生長。3.2無血清培養(yǎng)1976 年，Sato等發(fā)現(xiàn) GH3細(xì)胞株能在添加了少量生長因子的無血清培養(yǎng)基中維持生長。此后，無血清培養(yǎng)技術(shù)得到了逐漸完善發(fā)展。21 世紀(jì)后，隨著生命科學(xué)研究的不斷深入和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，細(xì)胞有血清培養(yǎng)表現(xiàn)出嚴(yán)重的不足，因而動(dòng)物細(xì)胞的無血清培養(yǎng)技術(shù)日益引起同行專家的高度關(guān)注。2003年4月5日至7日，Vera Baumans 等組織召開了題為“改進(jìn)體外培養(yǎng)技術(shù)方法，替換胎牛血清”的會(huì)議，并號召在全球范圍內(nèi)減少 FBS 的使用。3.2.1特點(diǎn)分類自從第一次使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功之后，至今無血清培養(yǎng)基的研制與應(yīng)用大約經(jīng)歷了三個(gè)不同的階段。第一代無血清培養(yǎng)基是一類用各種可替代血清功能的生物材料配制成的細(xì)胞培養(yǎng)基。由于這類培養(yǎng)基含有大量動(dòng)物來源蛋白和不明的添加成分，許多廠商基于生物藥物安全和藥品開發(fā)報(bào)批考慮，致力于開發(fā)第二代無血清培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基中完全無動(dòng)物來源組分，對于從事生物藥物開發(fā)生產(chǎn)的廠家來說，既加快了藥品申報(bào)的進(jìn)程又保證了藥物的使用安全和產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)也在一定程度上降低了成本，提高了效率，在生物醫(yī)藥的研發(fā)和生產(chǎn)領(lǐng)域深受歡迎。近幾年來，由于生命科學(xué)研究和基因工程藥物開發(fā)的需要，第三代化學(xué)組分限定培養(yǎng)基也已被開發(fā)出來，并在市場上獲得了很好地效果。這類完全不含血清、無蛋白或蛋白含量極低的培養(yǎng)基亦被稱之為雙無培養(yǎng)基。與過去的培養(yǎng)基相比，具有無可比擬的優(yōu)越性，成分明確，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和可靠性；性能一致，使得細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)結(jié)果有更好的重復(fù)性。無蛋白成分，有利于純化和下游加工;；最大程度上減少了細(xì)胞生長和表達(dá)的不利因素，使得生長更好和產(chǎn)量更高； 可以從根本上消除了血清源性污染等。3.2.2無血清培養(yǎng)基的構(gòu)成無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子兩部分組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基通常是按一定比例的葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽和維生素等組合而成的合成培養(yǎng)基，它是維持組織或細(xì)胞生長代謝必不可少的物質(zhì)。而補(bǔ)充因子，替代了傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的血清，既能有效避免血清帶來的諸多問題，也能滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的要求。補(bǔ)充因子根據(jù)需求的必要性一般分為必需補(bǔ)充因子和特殊補(bǔ)充因子。必需補(bǔ)充因子是所有細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時(shí)都需要的，包括胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白等。特殊補(bǔ)充因子一般含有激素、生長因子微量元素、貼壁和鋪展因子、維生素和酶抑制劑等。3.2.3無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用無血清培養(yǎng)基最初主要用于生物制品和生物藥物的研制與生產(chǎn)，隨著近年來生物技術(shù)和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，無血清培養(yǎng)基已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、生命科學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞工程等各個(gè)領(lǐng)域。其應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面: 1）研究細(xì)胞的分化條件: 許多在含血清的培養(yǎng)基中不能保持原代細(xì)胞分化現(xiàn)象的細(xì)胞系，在無血清培養(yǎng)基中成功地保留著分化能力和分化現(xiàn)象。2）用于激素、生長因子和藥物等與細(xì)胞相互作用的研究。3）用于從多種細(xì)胞混雜的培養(yǎng)中選擇目的細(xì)胞，通過對無血清培養(yǎng)基中的某些成分的取舍，可抑制原代組織培養(yǎng)物中非目的細(xì)胞的過度生長，達(dá)到選擇目的細(xì)胞的目的。3.3研究水平與應(yīng)用狀況3.3.1無血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)優(yōu)化在無血清培養(yǎng)基的具體應(yīng)用中，可以通過選擇或優(yōu)化適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充因子的種類及用量，使其更符合培養(yǎng)要求。例如，細(xì)胞工程的常用細(xì)胞CHO往往是利用DMEM F12RPMI 1640（2：2：2）或者EXCELLTM320作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而Vero的常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基則為M199、DMEM或F12等。如必需補(bǔ)充因子中的胰島素，因其費(fèi)用昂貴，目前有研究報(bào)道可利用金精三羧酸作為胰島素替代物培養(yǎng)CHO細(xì)胞，細(xì)胞的生長正常，并極大降低了成本。Rourou等在研究Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基時(shí)認(rèn)為，維生素C和檸檬酸鐵混合使用可以替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，這為尋求轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品提供了參考。3.3.2無血清培養(yǎng)應(yīng)用狀況目前已有越來越多的藥用蛋白在 CHO 細(xì)胞中獲得了高效表達(dá)，其中部分藥物已投放市場，例如 EPO、t PA、EGF、GCSF 等多種重組蛋白和細(xì)胞因子。常用的 CHO 細(xì)胞包括原始 CHO 細(xì)胞株和二氫葉酸還原酶雙倍體基因缺失型( DHFR ) CHO 突變株。CHO 細(xì)胞是目前重組糖基蛋白生產(chǎn)的首選體系，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，CHO 表達(dá)系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能、貼壁懸浮兼性生長、較高的耐受剪切力和滲透壓能力、產(chǎn)物胞外分泌功能且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白以及適于高密度培養(yǎng)等多方面的優(yōu)點(diǎn)。近年來，為降低生產(chǎn)成本和減少血制品帶來的潛在危害性，動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)開始使用無血清培養(yǎng)基( SFM) 。但 SFM 往往導(dǎo)致細(xì)胞活力差，貼壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺點(diǎn)。有研究者嘗試將類胰島素生長因子 IGF 基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入 CHO 細(xì)胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級 CHO”，無需在培養(yǎng)基中添加轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細(xì)胞可在 SFM 中生長良好。Gaurav Backliwal 等用編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子 p18、p21 及堿性成纖維細(xì)胞生長因子( aFGF) 的基因序列對表達(dá)載體進(jìn)行優(yōu)化，可以大大提高載體的表達(dá)能力。而且，他們在培養(yǎng)液中添加適量的丙戊酸使得 HEK293E 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的最高生長濃度為 8 106 cells / ml，重組蛋白的表達(dá)水平達(dá)到 1g / L 以上。3.3.3大規(guī)模培養(yǎng)20 世紀(jì) 50 年代后，以疫苗為主的生物制品生產(chǎn)迅速擴(kuò)大，細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)成為細(xì)胞生產(chǎn)的主要方式。1967 年，Van Wezel A L開發(fā)了適合貼壁細(xì)胞生長的微載體?，F(xiàn)在微載體培養(yǎng)系統(tǒng)最大規(guī)模達(dá) 2 000 L，從而大大提高了生產(chǎn)率。1975 年，Kohlor 創(chuàng)立了細(xì)胞融合技術(shù)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)顯得尤為迫切，氣升式培養(yǎng)裝置被用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)生產(chǎn)抗體，規(guī)模達(dá)到 10 000L 以上。近年來，細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟，促進(jìn)了大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展。由于生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展和基因工程藥物需求的不斷擴(kuò)大，使得哺乳動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)和生物反應(yīng)器技術(shù)日益緊密地結(jié)合起來，大大促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和生產(chǎn)效率的提高。哺乳動(dòng)物細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)的建立，使得細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)從小型反應(yīng)器到大型反應(yīng)器，乃至超大型生物反應(yīng)器的級聯(lián)放大。先進(jìn)的自動(dòng)化控制系統(tǒng)和完善的過程控制策略使得細(xì)胞培養(yǎng)過程更加穩(wěn)定，產(chǎn)物表達(dá)效率更高。清晰明確的培養(yǎng)物成分以及完善的質(zhì)控體系使得產(chǎn)品質(zhì)量更加安全可靠。研究表明，無血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度已在107 cells / ml 以上，抗體表達(dá)水平也達(dá)到 1g / L 以上。4討論目前，無血清培養(yǎng)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在一些問題，如培養(yǎng)基的保存與應(yīng)用穩(wěn)定性、研制成本高、細(xì)胞適用譜窄等等；在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中，乳酸和氨等抑制細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)的代謝產(chǎn)物的去除以及實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與表達(dá)產(chǎn)物的在線分離目前仍無有效的方法；大多數(shù)外源蛋白的表達(dá)會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致外源基因不能持久穩(wěn)定地表達(dá)，尤其是培養(yǎng)基中去除血清后，表達(dá)量會(huì)明顯下降。但是相信隨著代謝組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷完善，資源共享的無血清培養(yǎng)基在線數(shù)據(jù)庫的建立，以及更多科學(xué)設(shè)計(jì)方法的運(yùn)用，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化必將會(huì)得到更快的發(fā)展。特別是生產(chǎn)高效性、培養(yǎng)通用性、安全風(fēng)險(xiǎn)和降低成本等方面應(yīng)成為今后無血清培養(yǎng)基深入改進(jìn)的重點(diǎn)方向，從而使其能在生物醫(yī)藥行業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域得到更為廣泛而安全的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1Hauster H，Gross G，Brunsw，et al. 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