細胞衰老與細胞凋亡 1 學習資料 衰老和死亡是生命的基本現象 生命要不斷的更新 種族要不斷的繁衍 而這種過程就是在生與死的矛盾中進行的 至少從細胞水平來看 死亡是不可避免的 衰老過程發生在生物界的整體水平 種群水平 個體水平 細胞水平以及分子水平等不同的層次 2 學習資料 衰老是細胞的一種重要的生命活動 Hayflick界限 第1節細胞衰老 CELLAGING CELLSENESCENCE 細胞衰老的研究 3 學習資料 成人早衰癥 Werner氏綜合癥 嬰幼兒早衰癥 Hayflick Guilford綜合癥 4 學習資料 決定細胞衰老的因素在細胞內部 而不在外部環境 決定細胞衰老的表達是細胞核而不是細胞質 長壽基因和衰老基因 細胞在體內條件下的衰老 5 學習資料 衰老細胞結構的變化 細胞核 核膜的內折 染色質固縮化 內質網 有序排列被破壞 彌散于核周胞質中糙面內質網解體 減少 線粒體 數目減少 體積增大 有時可看到嵴 致密體 積累增多 是由溶酶體或線粒體轉化 膜系統的變化 凝膠相或固相 通透性和流動性降低細胞間間隙連接減少組成間隙連接的膜內顆粒聚集體變小 6 學習資料 皮膚干燥 發皺 頭發變白 老人斑 吸收能力下降 細胞水分減少 體積減小 細胞內的酶活性降低 細胞內色素 脂褐素 的累積 細胞膜通透性功能改變 無力 細胞內呼吸速度減慢 衰老癥狀與原因分析 7 學習資料 就生物個體而言 在其整個的生長發育過程中也不斷地發生細胞選擇性地死亡 這對保證機體的生存 保持機體對內外環境變化的適應能力 維持其正常的發育均具有重要意義 此種細胞死亡稱為編程性細胞死亡 programmedcelldeath PCD 也稱細胞凋亡 apoptosis 編程性細胞死亡 8 學習資料 細胞凋亡 apoptosis 由基因控制的自主性有序死亡 亦稱程序性死亡 programmedcelldeath PCD Apo ptosis來源于希臘語 fromfall 細胞的死亡猶如秋天樹葉的凋落1965年Kerr J F R 對大鼠肝臟門靜脈結扎后肝細胞溶酶體的觀察 JPathol Bacteriol 90 419 1965 1972年澳大利亞Kerr和Curry提出 9 學習資料 10 學習資料 線蟲 C elegant 中的細胞程序性死亡 線蟲 成體959個細胞 但在發育過程中有131個細胞會注定發生PCDPCD發生時間 1h左右參與線蟲PCD的基因 目前已知的有14個 凋亡的回顧 11 學習資料 programmedcelldeath PCD 經典凋亡模型 12 學習資料 PCD已經提出20多年了 但是發現其生物學上的重大意義還是近年的事 PCD和遺傳 進化 發育 病理及至腫瘤的發生 發展及其放療 化療等均有密切的關系 年諾貝爾生理學或醫學獎分別授予了英國科學家悉尼 布雷內 美國科學家羅伯特 霍維茨和英國科學家約翰 蘇爾斯頓 以表彰他們發現了在器官發育和 程序性細胞死亡 過程中的基因規則 13 學習資料 SydneyBrenner1 3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley CA USAb 1927 inUnionofSouthAfrica H RobertHorvit1 3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology MIT Cambridge MA USAb 1947 JohnE SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge UnitedKingdomb 1942 THE2002NOBELPRIZEWINNER 14 學習資料 THENOBELDIPlOMA 15 學習資料 2002年諾貝爾醫學與生理學頒獎儀式 瑞典斯德哥爾摩音樂廳 16 學習資料 SydneyBrennerreceivinghisNobelPrizefromHisMajestytheKingattheStockholmConcertHall Photo HansMehlin Nobele Museum 17 學習資料 1 細胞凋亡和一般性衰老死亡區分開來 證明了細胞凋亡的必然性 2 基因分析與細胞的分裂 分化以及器官的發育聯系起來 3 細胞凋亡機理為艾滋病 腫瘤和癌癥等疾病的治療提供了尋找新方法的可能 18 學習資料 程序性細胞死亡 是細胞的一種生理性 主動性的 自覺自殺行為 這些細胞死得有規律 似乎是按編好了的 程序 進行的 其死亡過程猶如秋天片片樹葉的凋落 所以這種細胞死亡又稱為 細胞凋亡 19 學習資料 包括人類在內的生物是由細胞組成的 細胞的誕生固然非常重要 但細胞的死亡也重要 20 學習資料 早在 世紀 年代初期 科學家就開始探索 程序性細胞死亡 的奧秘 但要揭開這一奧秘 需要選擇一個合適的研究對象 像細菌這樣的單細胞生物太簡單 而像哺乳動物這樣由大量細胞組成的生物又太復雜 科學家最終選擇了線蟲 線蟲長僅 毫米 細胞數量不多 功能也不復雜 而且它身體透明 便于用顯微鏡觀測 21 學習資料 這 位獲獎者的成果為其他科學家研究 程序性細胞死亡 提供了重要基礎 后來科學家又在這一領域取得了一系列新成績 科學家們發現 控制 程序性細胞死亡 的基因有兩類 一類是抑制細胞死亡的 另一類是啟動或促進細胞死亡的 兩類基因相互作用控制細胞正常死亡 22 學習資料 如果能發現所有的調控基因 分析其功能 研究出能發揮或抑制這些基因功能的藥物 那么就可加速癌細胞自殺 達到治療癌癥的目的 而同時提高免疫細胞的生命力 則達到抵御艾滋病的目的 23 學習資料 細胞凋亡與壞死的區別 1 細胞凋亡 細胞凋亡多發生于生理情況下 故可稱為生理性死亡 部分病理刺激也可誘導凋亡 其特征為 1 細胞骨架的擾亂 粘附力降低 伴隨細胞皺縮而產生的胞質和核的濃縮 2 膜發泡 3 核中沿核周緣染色質凝集 繼而染色質降解 凝膠電泳檢測呈現180 200bp及其倍數的特征梯度 ladder 24 學習資料 膜通透性增高 細胞水腫 內質網膨脹 線粒體膨脹破裂 酶被釋放 染色質凝集 核固縮 細胞溶解 胞質內容物釋放 導致炎癥反應 2 細胞壞死 細胞壞死 necrosis 是區別于細胞凋亡的另一種細胞死亡方式 由多種致病因子如局部缺血 物理 化學和生物因子的作用而產生的急性損傷所致 故稱為病理性死亡 25 學習資料 細胞凋亡與壞死的比較 壞死凋亡 強刺激 弱刺激 溶酶釋出 炎癥反應 ATP ATP 26 學習資料 Apoptoticbodies 凋亡小體 哺乳類的細胞凋亡過程 Apoptosis 27 學習資料 28 學習資料 檢測細胞凋亡的方法 組織切片中的凋亡細胞分散 數量少 迅速為巨噬細胞所吞食 Giemsa染色 孚爾根染色或Hoechest33342等熒光染色 在光鏡下鏡檢 可觀察到染色質凝集 邊緣化 凋亡小體出現 巨噬細胞的吞食等現象 1 形態學 組織切片中壞死灶周圍有炎癥反應 淋巴細胞集中 死亡 凋亡 29 學習資料 在小鼠肌肉中生長的P815腫瘤細胞中因缺血誘導的壞死 示濃縮的染色質塊的病態的邊緣 膨脹的線粒體和分解的膜 30 學習資料 孚爾根染色 DNA熒光染色可顯示染色質凝集 斷片等現象 臺盼藍染色 凋亡細胞仍是拒染而壞死細胞是著色的 表明凋亡細胞還保持著一定生物活性 壞死細胞胞質不濃縮而是明顯腫脹 無凋亡小體 電鏡下凋亡細胞的核縮小 染色質邊緣化 凝集 電子密度高 晚期則形成核碎片和胞質內的細胞器混合在一起被細胞膜包圍的凋亡小體 內質網到后期膨脹成泡狀 胞質密度增高 胞膜絨毛減少 凋亡小體最后脫離胞體 被巨噬細胞所吞噬 31 學習資料 正常細胞核 凋亡細胞核 細胞發生凋亡時 染色質會固縮 所以Hoechst染色時 細胞核會呈致密濃染 或呈碎塊狀致密濃染 32 學習資料 返回 前進 33 學習資料 ApoptosisofANA 1cellinducedbyCurcumin 34 學習資料 Humanlymphomacellstreatedwiththechemotherapyagentcamptothecin Thecellsthatareundergoingapoptosisappearyellowandshowthecharacteristicmembraneblebbing bubbleformation seenincellsdyingviaapoptosis 35 學習資料 線蟲 C clegans 凋亡細胞是自身cdc3和ced4基因表達依賴性的 凋亡細胞被鄰近細胞吞食 36 學習資料 2 DNA電泳 提取細胞基因組DNA 通過瓊脂糖凝膠電泳 凋亡細胞DNA顯示出180 200bp及其不同倍數的梯帶 被視為最典型的凋亡指標 因被激活的核酸內切酶選擇性地在核小體的連接段 linker 處切斷所致 壞死細胞DNA則被核酸內切酶無規則地切斷 在培養液中細胞溶解后放出DNA片段 故在電泳膠上呈彌散的涂抹狀 37 學習資料 DNA電泳 necrosis apoptosis 38 學習資料 3 流式細胞光度術 由于核酸內切酶對DNA的降解成小片段 通過固定改變膜通透性 經PI或Hoechest33342染色 G1期出現低于2CDNA含量的峰 成為細胞凋亡的重要標志之一 39 學習資料 全反式維甲酸處理人HL 60細胞后 流式細胞光度儀對細胞DNA含量分析藥物處理后第5 6天明顯出現Gl期小峰 40 學習資料 4 凋亡細胞的原位標記 由于凋亡細胞DNA為核酸內切酶降解產生3 OH的缺口和末端 故可用原位缺口平移法 insitunicktranslation 或原位末端標記法 TUNEL 顯示凋亡細胞 根據需要可采用生物素 地高辛 熒光素和同位素等標記物 如標記的熒光素可以在流式細胞儀上進行定量分析凋亡與非凋亡細胞 原位標記法的最大優點在于 能在組織切片上識別難于判斷的凋亡細胞 不足之處為缺乏專一性 但可結合形態學予以正確判斷 41 學習資料 HL 60cells 急粒 p53缺陷 被喜樹堿誘導3小時 DNA段端被熒光標記的脫氧核苷酸末端轉移酶標記 42 學習資料 5 細胞膜磷脂酰絲氨酸 PS 熒光顯示 PS在非凋亡細胞中分布于細胞內膜 細胞凋亡后 細胞內膜轉至膜外 PS被巨噬細胞識別后被吞噬 而PS出現在細胞膜外 可作為凋亡細胞的標志 鈣結合蛋白 annexinV 依靠Ca2 與PS結合 使用熒光標記的鈣結合蛋白 annexinV fluos 及PI兩種熒光可在流式細胞儀上定量地區別凋亡 壞死和正常的細胞 亦可用熒光顯微鏡鑒定個別的凋亡細胞 43 學習資料 Jurkat人類白血病T細胞經喜樹堿處理 ps外翻 早期凋亡特異性的特征被annexin 5檢測到 晚期凋亡和壞死細胞被pi染色 44 學習資料 45 學習資料 46 學習資料 confocalmicroscopy共聚焦顯微鏡用于檢測凋亡 47 學習資料 48 學習資料 細胞凋亡的生物學意義 細胞凋亡是機體自我保護機制 是長期遺傳 進化的結果 以保證生物的世代延續 確保正常發育生長 清除多余的細胞 維持內環境穩定 清除受損 突變 衰老的細胞 積極防御功能 對病毒感染細胞阻止復制 49 學習資料 細胞凋亡的過程 1 凋亡信號轉導 啟動信號Ca2 cAMP 神經酰胺2 凋亡基因激活 表達酶類和其他物質3 細胞凋亡的執行 核酸內切酶 DNase 和Caspases4 凋亡細胞的清除 被臨近的M 或其他細胞吞噬分解 50 學習資料 凋亡時細胞的主要變化 形態學改變 胞膜空泡化 固縮 出芽 染色質邊集 脫接觸 凋亡小體 51 學習資料 52 學習資料 53 學習資料 細胞凋亡的生化改變 1 DNA的片段化 梯狀條帶形成 核小體連接區被切開 染色質 300kb 50kb 180 200bp或其整倍數片段 5min 90min 54 學習資料 2 內源性核酸內切酶激活及其作用 由一系列胞內信號轉導環節激活 執行染色質DNA切割 55 學習資料 Caspase8的激活 需要FADD Fasassociatedproteinwithdeathdomain Caspase9激活 需要通過CARD caspase recruitmentdomain Apaf 1 細胞色素c ATP等多個因子的參與 細胞色素C Apaf 1和pro caspase9組成了 Apoptosome 凋亡體 56 學習資料 3 凋亡蛋白酶 caspases 的激活及其作用 是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用 其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶 cysteine containingaspartate spicificprotease 至少有13個成員Cysteine半胱氨酸Aspartate天冬氨酸spicificprotease 57 學習資料 caspases功能 滅活細胞凋亡的抑制物 如Bcl 2 水解蛋白質結構 細胞解體 凋亡小體 在凋亡級聯反應中水解相關活性蛋白 使其獲得或喪失功能 58 學習資料 細胞凋亡的調控 細胞凋亡是細胞自殺現象 是受到一定程序的控制的 如細胞接受凋亡信號 通過一系列的信號傳遞 凋亡有關的正負調節基因的表達 Ca2 的變化 酶的激活等 最終導致細胞凋亡 目前發現與細胞凋亡有關的基因有三類 即促進細胞凋亡的基因 抑制細胞凋亡的基因和在細胞凋亡過程中表達的基因 若按基因效應劃分 則可分為原癌基因 抑癌基因 病毒基因 生長及其抑制因子基因 細胞受體基因和蛋白激酶基因等 59 學習資料 誘導性因素 激素 生長因子 理化因素 免疫 微生物 細胞凋亡相關因素 抑制性因素 細胞因子 IL 2 神經生長因子激素 ACTH 睪酮 雌激素其它 Zn2 苯巴比妥 半胱氨酸蛋白酶抑制劑 EB病毒 中性氨基酸 60 學習資料 細胞凋亡信號的轉導 誘導信號 cell R 神經酰胺 多途徑 R SAPK JNK P53基因 NF kB JNK AP 1途徑 激活baxor下調bcl 2 ROS mtDNA 61 學習資料 凋亡信號轉導系統特點 多樣性 不同種類的細胞系統不同 偶聯性 與增殖分化的信號系統交叉偶聯 同一性 多因素 共用同一系統觸發 多途性 同一誘導因素啟動多條信號轉導途徑 62 學習資料 凋亡相關基因 抑制凋亡基因 bcl 2促進凋亡基因 fas P53雙向調控基因 c myc bclx 63 學習資料 1 ced基因 在線蟲中已發現14個與細胞凋亡相關的基因 其研究得比較深入的有ced 3和ced 4以及促進細胞凋亡的有關基因 ced 4的詳細功能尚不十分清楚 但Ced 3蛋白有530個氨基酸 其中含有約100個氨基酸長度的絲氨酸富含區 提示磷酸化在細胞凋亡中有十分重要的作用 64 學習資料 在哺乳動物中克隆出一個與ced 3相似的基因為白細胞介素1 轉化酶 inter leukin 1 convertingenzyme ICE 是一種底物特異性半胱氨酸蛋白酶 可裂解IL 1 前體為17 5kDa的成熟形式的IL 1 65 學習資料 由果蠅 D melanogaster 中克隆出rpr reaper 基因 編碼65個氨基酸的短鏈多肽 其迅速表達可誘導細胞凋亡 但并非參加一切細胞的凋亡 其在進化中的保守性有待深入研究 2 rpr基因 66 學習資料 它定位于人的第18號染色體 在淋巴瘤中極易發生染色體易位 14 18 使bcl 2與14號染色體上IgH基因并列而導致過表達 它編碼26kDa的Bcl 2a及22kDa的Bcl 2 蛋白 bcl 2是一個不斷在擴增的多基因家族的原型 prototypes 其在哺乳類中的家族成員有Bcl Mcl 1 Bax Bak Bad A1和Bik 1 3 Bcl 2 67 學習資料 Bcl 2 229aa構成 鼠236 分在線粒體內膜 細胞內膜表面 內質網 核膜等處 Bcl 2 Bcelllymphoma leukemia 2 Bcl 2和C elegans中的ced 9有很高的同源性 具有促進細胞存活的功能 68 學習資料 大量實驗證明它是多細胞動物中普遍存在的 長壽 基因 如神經元壽命長 bcl 2的表達則高于其他類型細胞 Bcl 2的功能是延長細胞的壽命 而不是刺激細胞的增殖 69 學習資料 Bcl 2抗凋亡機制 直接的抗氧化 抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質 抑制促凋亡的Bax Bak細胞毒作用 抑制Caspases激活 維持細胞鈣穩態 70 學習資料 線蟲C elegans和哺乳類細胞的死亡途徑比較 71 學習資料 它是一個多功能的原癌基因 c myc可促進細胞分裂 參與細胞的轉化 c myc存在于核仁 并可結合在特異的DNA序列上發揮轉化因子的作用 它既可誘導細胞凋亡 又可抑制細胞凋亡 4 c myc基因 72 學習資料 c myc轉錄調節因子依賴GFBcl xBcl xl抑凋亡Bcl xs促凋亡 73 學習資料 p53是腫瘤抑制基因 野生型p53可誘導細胞凋亡 缺乏p53功能的癌細胞若轉染p53基因并使其過表達p53時 導致生長抑制 p53誘導細胞周期阻斷的能力 長期以來認為其機理是抑制了腫瘤細胞生長 現在認為p53促進細胞凋亡可能是腫瘤生長抑制的主要原因 5 p53基因 74 學習資料 P53 野生型誘導凋亡 在G1期發揮卡點功能 有缺陷DNA CIP表達 啟動修復 失敗 啟動凋亡CIP cyclindependentkinase interactingprotien 1P53 molecularpoliceman 75 學習資料 G1 S G2 M CyclinA CDK CyckinA CDK1 CyclinB CyclinD p53 Bax Bcl 2 molecularpoliceman BlockingIGF R 76 學習資料 Fas和Apo 1是分別從人的T琳巴細胞瘤KT3細胞株及人B細胞淋巴瘤SKW6 4株分離的兩個cDNA克隆 序列分析證明兩者完全一致 為同一分子 1993年在美國Boston召開的第五屆人類白細胞抗原分型國際會議上 正式命名Apo 1 Fas為CD95 6 Fas Apo 1 77 學習資料 FasL Fasligand 為人和鼠的Fas的配體 激活的T淋巴細胞高表達FasL Fas和FasL結合則誘導細胞凋亡 但如何激活細胞凋亡的機理尚不清楚 78 學習資料 ICE基因是由哺乳類中克隆出的cdc 3的同源基因 ICE的前體為p45 有p20及p102個亞基 p45可能自身參與這一催化過程 p20 p10 2形成有活性的ICEI Rat 1細胞中ICE過量表達可導致細胞凋亡 如將ICE的催化位點Cys285突變 則細胞不能凋亡 7 ICE基因 79 學習資料