專題1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，又叫做DNA重組技術。（一）基因工程的基本工具1.“分子手術刀”限制性核酸內切酶（限制酶）（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。（3）結果：經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。2.“分子縫合針”DNA連接酶(1)兩種DNA連接酶（DNA連接酶和DNA連接酶）的比較： 相同點：都縫合磷酸二酯鍵。 區別：EcoliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而T4DNA連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。(2) 與DNA聚合酶作用的異同:DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。3.“分子運輸車”載體（1）載體具備的條件：能在受體細胞中復制并穩定保存。具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入。具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。（2）最常用的載體是質粒,它是一種裸露的、結構簡單的、獨立于細菌擬核DNA之外，并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子。（3）其它載體： 入噬菌體的衍生物、動植物病毒4在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改選的。(2) 基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的獲取(1) 目的基因是指： 主要是指編碼蛋白質的基因 ，也可以是一些具有調控作用的因子（2）獲取目的基因的: 從基因文庫中獲取：基因組文庫 或cDNA文庫 PCR技術擴增 人工合成： 化學方法人工合成 (DNA合成儀) 或 反轉錄法PCR技術擴增（多聚酶鏈式反應）目的基因（1）原理：DNA雙鏈復制（2）過程：第一步：加熱至9095DNA解鏈；第二步：冷卻到5560，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至7075，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。（3）前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物。需要熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）第二步：基因表達載體的構建（核心）1.目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。2.組成：目的基因啟動子終止子標記基因（1）啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。（2）終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段 ，位于基因的尾端。（3）標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。第三步：將目的基因導入受體細胞_1.轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2.常用的轉化方法：導入植物細胞：采用最多的方法是 農桿菌轉化法（農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上），其次還有 基因槍法和 花粉管通道法等。導入動物細胞：最常用的方法是 顯微注射技術。此方法的受體細胞多是 受精卵。導入微生物細胞：原核生物作為受體細胞的原因是 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少 ，最常用的原核細胞是 大腸桿菌 ，其轉化方法是：先用 Ca2+ 處理細胞，使其成為 感受態細胞 ，再將 重組表達載體DNA分子 溶于緩沖液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。 4.重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。第四步：目的基因的檢測和表達1.首先要檢測 轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術。2.其次還要檢測 目的基因是否轉錄出了mRNA，方法是采用 用標記的目的基因作探針與 mRNA雜交。（分子雜交技術）3.最后檢測 目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取 蛋白質，用相應的 抗體進行抗原抗體雜交。4.有時還需進行 個體生物學水平的鑒定。如 轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。（三）基因工程的應用1.植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的品質。2.動物基因工程：提高動物生長速度、改善畜產品品質、用轉基因動物生產藥物。用轉基因動物生產藥物：乳腺生物反應器（乳房生物反應器）大概過程：目的基因（蛋白基因+乳腺蛋白基因的啟動子） 顯微注射方法 導入哺乳動物受精卵 母體子宮內 能產生藥品蛋白質轉基因動物3.基因治療：把正常的外源基因導入病人體內，使該基因表達產物發揮作用。基因診斷,基因治療包括：體外基因治療和體內基因治療工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系一般稱為工程菌。轉基因動物作器官移植的供體：最大的難題是解決免疫排斥問題基因工程的優點：克服不同生物遠緣雜交的障礙。目的性強，能定向的改變生物的品質。 縮短育種周期。（四）蛋白質工程的概念蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質）轉錄 翻譯蛋白質工程的基本途徑： 從預期的蛋白質功能出發設計預期的蛋白質結構 推測應有的氨基酸序列 找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因） 蛋白質工程與基因工程區別 專題2 細胞工程細胞工程：是指導應用細胞生物學和分子生物學的原理和方法，通過細胞水平或細胞器水平上的操作，按照人的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得細胞產品的一門綜合科學技術，（一）植物細胞工程 1.理論基礎（原理）：細胞全能性（分化的細胞，仍具有形成完整植株所需要的全部遺傳信息）全能性表達的難易程度：受精卵生殖細胞干細胞體細胞；植物細胞動物細胞植物全能性表達的條件：離體的，提供人為條件（營養，激素，適宜的外界條件）愈傷組織：細胞排列疏松而無規則是一種高度液泡化的呈無定形狀態的薄壁細胞2.植物組織培養技術（1）過程：（2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體育種、細胞產物的工廠化生產。（3）地位：是培育轉基因植物、植物體細胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。3.植物體細胞雜交技術（1）過程：（2）誘導融合的方法：物理法包括離心、振動、電刺激等。化學法一般是用聚乙二醇（PEG）作為誘導劑。（3）去細胞壁：纖維素酶和果膠酶 等到雜種細胞再生出細胞壁即細胞雜交結束，意義：克服了遠緣雜交不親和的障礙。打破物種之間的生殖隔離，擴大遺傳重組范圍。微型繁殖的優點：可以保持優良品種的遺傳特性，可以高效快速地實驗種苗的大量繁殖人工種子的優點：無性繁殖，完全保持優良品種的遺傳特性，不受季節限制，方便運輸及貯藏單倍體育種的優點：極大縮短了育種的年限，節約了大量的人力物力。（二）動物細胞工程 常用的技術手段：動物細胞培養，動物細胞核移植，動物細胞融合，生產單克隆抗體。其中動物細胞培養技術是基礎技術 1. 動物細胞培養（1）概念：動物細胞培養就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和繁殖。（2）動物細胞培養的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）剪碎用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞制成細胞懸液轉入培養瓶中進行原代培養貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續傳代培養。（3）細胞貼壁和接觸抑制：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞數目不斷增多，當貼壁細胞分裂生長到表面相互抑制時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。（4）動物細胞培養需要滿足以下條件無菌、無毒的環境：培養液應進行無菌處理。通常還要在培養液中添加一定量的抗生素，以防培養過程中的污染。此外，應定期更換培養液，防止代謝產物積累對細胞自身造成危害。營養：合成培養基成分：糖、氨基酸、促生長因子、無機鹽、微量元素等。通常需加入血清、血漿等天然成分。溫度：適宜溫度：哺乳動物多是36.50.5；pH：7.27.4。氣體環境：95%空氣5%CO2。O2是細胞代謝所必需的，CO2的主要作用是維持培養液的pH。（5）動物細胞培養技術的應用：制備病毒疫苗、制備單克隆抗體、檢測有毒物質、培養醫學研究的各種細胞。2.動物體細胞核移植技術和克隆動物（1）哺乳動物核移植可以分為胚胎細胞核移植（比較容易）和體細胞核移植（比較難）。（2）選用去核卵(母)細胞的原因：卵(母)細胞比較大，容易操作；卵(母)細胞細胞質多，營養豐富，細胞質中含促進細胞核全能性表達的物質（3）體細胞核移植的大致過程是：（4）體細胞核移植技術的應用：加速家畜遺傳改良進程，促進良畜群繁育； 保護瀕危物種，增大存活數量；生產珍貴的醫用蛋白； 作為異種移植的供體；用于組織器官的移植等。（5）體細胞核移植技術存在的問題：克隆動物存在著健康問題、表現出遺傳和生理缺陷等。3.動物細胞融合（1）動物細胞融合也稱細胞雜交，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程。融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞，稱為雜交細胞。（2）動物細胞融合與植物原生質體融合的原理基本相同，誘導動物細胞融合的方法與植物原生質體融合的方法類似，常用的誘導因素有聚乙二醇、滅活的病毒、電刺激等。（3）動物細胞融合的意義：克服了遠緣雜交的不親和性，成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段。4.單克隆抗體（1）抗體：一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體。從血清中分離出的抗體產量低、純度低、特異性差。（2）單克隆抗體的制備過程： （3）雜交瘤細胞的特點：既能大量繁殖，又能產生專一的抗體。（4）單克隆抗體的優點：特異性強，靈敏度高，并能大量制備。（5）單克隆抗體的作用： 作為診斷試劑：準確識別各種抗原物質的細微差異，并跟一定抗原發生特異性結合，具有準確、高效、簡易、快速的優點。 用于治療疾病和運載藥物：主要用于治療癌癥治療，可制成“生物導彈”，也有少量用于治療其它疾病。 專題3 胚胎工程胚胎工程：是指對動物早期胚胎或配子所進行的多種顯微操作和處理技術，如胚胎移植、體外受精、胚胎分割、胚胎干細胞培養等技術。經過處理后獲得的胚胎，還需移植到雌性動物體內生產后代，以滿足人類的各種需求。胚胎工程的許多技術，實際是在體外條件下，對動物自然受精和早期胚胎發育條件進行的模擬操作。（一）體內受精和早期胚胎發育1、精子的發生場所：睪丸（精巢） 時間：初情期變形：細胞核-精子頭的主要部分 高爾基體-頂體 中心體-尾 線粒體-鞘膜 其它物質-原生質滴-脫落2卵子的發生場所：卵巢 時間：胚胎在性別分化以后-（精子與卵子在發生時間上的差別是重要的區別）減數第一次分裂是在雌性動物排卵前后完成的，其結果產生一個次級卵母細胞和第一極體，進入輸卵管，準備與精子受精（不同的動物排卵的時間不同）。意思是排出的卵細胞是次級卵母細胞，不是成熟細胞。減數第二次分裂是在精子和卵子結合的過程中完成的，當卵細胞膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體時，這是判斷卵子是否受精的重要標志。3受精：場所：雌性的輸卵管內完成的準備階段1：精子獲能：剛排出的精子不能立即與卵子受精，必須在雌性動物生殖道發生相應的生理變化后，才能獲得受精能力準備階段2：卵子的準備：動物排出的卵子成熟程度不同，但都在要輸卵管內進一步成熟，達到減數第二次分裂的中期，才具備與精子受精的能力。受精階段：過程主要包括：精子穿越放射冠，透明帶，進入卵細胞膜，原核形成和配子結合。過程：通過頂體反應精子穿越放射冠-接觸透明帶后穿越透明帶接觸卵細胞膜（發生透明帶反應）-精子與卵細胞膜融合，精子進入卵（卵細胞膜反應）-尾總脫離，核膜破裂形成雄原核，卵子完成減數第二次分裂，形成雌原核，雌雄原核結合，受精結束。4、動物胚胎發育的基本過程（1）卵裂期：特點：細胞有絲分裂，細胞數量不斷增加，但胚胎的總體體積并不增加，或略有減小。 （2）桑椹胚：特點：胚胎細胞數目達到32個左右時，胚胎形成致密的細胞團，形似桑椹。是全能細胞。（3）囊 胚：特點：細胞開始出現分化（該時期細胞的全能性仍比較高）。聚集在胚胎一端個體較大的細胞稱為內細胞團，將來發育成胎兒的各種組織。中間的空腔稱為囊胚腔。滋養層發育成胎膜和胎盤（4）原腸胚：特點：有了三胚層的分化，具有囊胚腔和原腸腔。（二）體外受精和早期胚胎培養1 體外受精主要過程包括：卵母細胞的采集，精子的獲取，和受精 (1)卵母細胞的采集和培養：主要方法：用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然后，從輸卵管中沖取卵子，直接與獲能的精子在體外受精。第二種方法：從剛屠宰母畜的卵巢中采集卵母細胞；第三種方法是借助超聲波探測儀、腹腔鏡等直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。采集的卵母細胞，都要在體外經人工培養成熟后，才能與獲能的精子受精。(2) 精子的采集和獲能：假陰道法，手握法和電刺激法，在體外受精前，要對精子進行獲能處理。培養法和化學誘導法兩種（把精子放在人工配制的獲能液中如肝素中）(3) 受精：獲能的精子和培養成熟的卵細胞在獲能溶液或專用的受精溶液中完成受精過程。(4)胚胎的早期培養：精子與卵子在體外受精后，應將受精卵移入發育培養液中繼續培養，以檢查受精狀況和受精卵的發育能力。培養液成分較復雜，除一些無機鹽和有機鹽外，還需添加的階段時，可將其取出向受體移植或冷凍保存。不同動物胚胎移維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養成分，以及血清等物質。當胚胎發育到適宜植的時間不同。一般要培育到桑椹胚或囊胚階段才能進行移植（三）胚胎工程的應用及前景1.胚胎移植(1)胚胎移植是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態相同的其它雌性動物的體內，使之繼續發育為新個體的技術。其中提供胚胎的個體稱為“供體”，接受胚胎的個體稱為“受體”。（供體為遺傳性能和生產性能優良品種，受體為健康，有繁殖能力的個體。）地位：如轉基因、核移植，或體外受精等任何一項胚胎工程技術所生產的胚胎，都必須經過胚胎移植技術才能獲得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。(2) 胚胎移植的意義：大大縮短了供體本身的繁殖周期，充分發揮雌性優良個體的繁殖能力。(3) 生理學基礎：動物發情排卵后，同種動物的供、受體生殖器官的生理變化是相同的。這就為供體的胚胎移入受體提供了相同的生理環境。早期胚胎在一定時間內處于游離狀態。這就為胚胎的收集提供了可能。受體對移入子宮的外來胚胎不發生免疫排斥反應。這為胚胎在受體的存活提供了可能。供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯系，但供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受影響。(4) 基本程序主要包括：對供、受體的選擇和處理。選擇遺傳特性和生產性能優秀的供體，有健康的體質和正常繁殖能力的受體，供體和受體是同一物種。并用激素進行同期發情處理，用促性腺激素對供體母牛做超數排卵處理。配種或人工授精。對胚胎的收集、檢查、培養或保存。配種或輸精后第7天，用特制的沖卵裝置，把供體母牛子宮內的胚胎沖洗出來(也叫沖卵)。對胚胎進行質量檢查，此時的胚胎應發育到桑椹或胚囊胚階段。直接向受體移植或放入196的液氮中保存。對胚胎進行移植。移植后的檢查。對受體母牛進行是否妊娠的檢查。2.胚胎分割(1)概念：是指采用機械方法將早期胚胎切割2等份、4等份等，經移植獲得同卵雙胎或多胎的技術。(2)意義：來自同一胚胎的后代具有相同的遺傳物質，屬于無性繁殖。(3)材料：發育良好，形態正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的發育過程中，細胞開始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）(4)操作過程：對囊胚階段的胚胎分割時，要將內細胞團均等分割，否則會影響分割后胚胎的恢復和進一步發育。 （二）胚胎干細胞1、哺乳動物的胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或從原始性腺中分離出來。2、具有胚胎細胞的特性，在形態上表現為體積小，細胞核大，核仁明顯；在功能上，具有發育的全能性，可分化為成年動物體內任何一種組織細胞。另外，在體外培養的條件下，可以增殖而不發生分化，可進行冷凍保存，也可進行遺傳改造。3、胚胎干細胞的主要用途是：可用于研究哺乳動物個體發生和發育規律；是在體外條件下研究細胞分化的理想材料，在培養液中加入分化誘導因子，如牛黃酸等化學物質時，就可以誘導ES細胞向不同類型的組織細胞分化，這為揭示細胞分化和細胞凋亡的機理提供了有效的手段；可以用于治療人類的某些頑疾，如帕金森綜合癥、少年糖尿病等；利用可以被誘導分化形成新的組織細胞的特性，移植ES細胞可使壞死或退化的部位得以修復并恢復正常功能；隨著組織工程技術的發展，通過ES細胞體外誘導分化，定向培育出人造組織器官，用于器官移植，解決供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問題。 專題4 生物技術的安全性和倫理問題（一）轉基因生物的安全性爭論 ：(1)基因生物與食物安全：反方觀點：反對“實質性等同”、出現滯后效應、出現新的過敏原、營養成分改變正方觀點：有安全性評價、科學家負責的態度、無實例無證據(2)轉基因生物與生物安全：對生物多樣性的影響反方觀點：擴散到種植區之外變成野生種類、成為入侵外來物種、重組出有害的病原體、成為超級雜草、有可能造成“基因污染”正方觀點：生命力有限、存在生殖隔離、花粉傳播距離有限、花粉存活時間有限(3)轉基因生物與環境安全：對生態系統穩定性的影響反方觀點：打破物種界限、二次污染、重組出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通過食物鏈進入人體正方觀點：不改變生物原有的分類地位、減少農藥使用、保護農田土壤環境（二）生物技術的倫理問題(1)克隆人：兩種不同觀點，多數人持否定態度。否定的理由：克隆人嚴重違反了人類倫理道德，是克隆技術的濫用；克隆人沖擊了現有的婚姻、家庭和兩性關系等傳統的倫理道德觀念；克隆人是在人為的制造在心理上和社會地位上都不健全的人。肯定的理由：技術性問題可以通過胚胎分級、基因診斷和染色體檢查等方法解決。不成熟的技術也只有通過實踐才能使之成熟。中國政府的態度：禁止生殖性克隆，不反對治療性克隆。四不原則：不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人的實驗。(2) 設計試管嬰兒是指 體外受精 形成的胚胎在植入母體孕育之前 ，根據人們的需要，將胚胎的一個(或少量)細胞取出進行某些 遺傳學診斷 。當檢測結果符合人們的需要時，再把胚胎植入母體孕育。“試管嬰兒”和“設計試管嬰兒”這兩種技術在對人類作用上的區別是：前者主要用于 治療不孕夫婦的不孕癥 ，后者可以用于 治療需要造血干細胞移植（或骨髓移植）的疾病 。設計試管嬰兒引發的倫理問題（1）反對者觀點: 把試管嬰兒當作人體 零配件工廠 ，是對生命的不尊重；早期生命也有活下去的權利，拋棄或殺死多余胚胎，無異于“謀殺”；有人濫用設計試管嬰兒技術，如設計 嬰兒性別 。（2）支持者觀點 ：設計試管嬰兒是為了救人，是救治患者的 最好 、 最快捷 的辦法之一；提供骨髓中 造血干細胞 并不會對試管嬰兒造成損傷，不違背倫理道德；臍帶血為“身外之物”，利用其中的 造血干細胞 是更符合倫理道德的。 (3)基因身份證：否定的理由：個人基因資訊的泄漏造成基因歧視，勢必造成遺傳學失業大軍、造成個人婚姻困難、人際關系疏遠等嚴重后果。肯定的理由：通過基因檢測可以及早采取預防措施，適時進行治療，達到挽救患者生命的目的。（三）生物武器 (1)種類：致病菌、病毒、生化毒劑，以及經過基因重組的致病菌。(2)散布方式：吸入、誤食、接觸帶菌物品、被帶菌昆蟲叮咬等。(3)特點：致病力強、多數具傳染性、傳染途徑多、污染面廣、有潛伏期、不易被發現、危害時間長等。(4)禁止生物武器公約及中國政府的態度生態工程識記要點一、生態工程的基本概念：1、生態工程的概念：指人類應用 生態學和系統學 等學科的基本原理和方法，通過 系統設計 、 調控 和 技術組裝 ，對已被 破壞 的生態環境進行 修復 、 重建 ，對造成 環境污染 和 破壞 的傳統生產方式進行 改善 ,并提高生態系統的 生產力 ,從而促進 人類社會和自然環境 的和諧發展。2、生態工程建設目的：遵循自然界 物質循環 的規律，充分發揮資源的生產潛力，防止 環境污染 ，達到 經濟效益 和 生態效益 的同步發展。3、生態工程特點：少 消耗 、多 效益 、可 持續 。4、生態經濟的概念：主要是通過實行 “循環經濟” 原則，使一個系統產出的污染物，能夠成為本系統或者另一個系統的 生產原料 ，從而實現 廢棄物的資源化 ，而實現循環經濟最重要的手段之一就是 生態工程 。二、生態工程遵循的基本原理項目理論基礎意義實例物質循環再生原理物質循環再生可避免環境污染及影響；系統的穩定和發展無廢棄物農業物種多樣性原理生態系統的穩定性生物多樣性程度高，可提高系統的抵抗力穩定