微生物與發酵工程 本章知識結構及教學要求 微生物的類群 微生物 魏泰克的五界說 原核生物界 細菌 放線菌等原生生物界 藻類 原生動物等真菌界 酵母 霉菌植物界動物界 病毒 細菌 一 形態 球狀 桿狀 螺旋狀 基本形態 1 細胞壁 如果將桿菌接入濃度為0 2mol l的蔗糖等滲溶液和盛有玻璃珠的三角瓶中加以搖動 可以使細胞壁破裂 細胞內含物流出 這樣就可以得到細胞壁的空殼 空殼成桿狀 而細胞內含物卻是圓的 原生質體 在人為條件下 用溶菌酶處理或在含青霉素的培養基中培養而抑制新生細胞壁合成而形成的僅由一層細胞膜包裹的 圓球形 對滲透壓變化敏感的細胞 一般由革蘭氏陽性細菌形成 特點 對環境條件變化敏感 低滲透壓 振蕩 離心甚至通氣等都易引起其破裂 五肽交聯橋五個甘氨酸 聚糖骨架g n 乙酰葡萄胺m n 乙酰胞壁酸 四肽側鏈l 丙 d 谷 l 賴 d 丙 主要成分肽聚糖 g 菌肽聚糖結構 細胞壁 2細胞膜 證明細胞膜的存在 質壁分離 選擇性染色 原生質體破裂或電鏡觀察等方法 細胞膜的生理功能 選擇性地控制細胞內 外的營養物質和代謝產物的運送 合成細胞壁和糖被的各種組分 肽聚糖 磷壁酸 莢膜多糖等 的重要基地 膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代謝的酶系 是細胞的產能場所 含有抗藥性基因 固氮基因 抗生素生成基因 3細菌質粒 4 核糖體 不同于真核生物 鏈霉素等抗生素通常作用于核糖體從而抑制蛋白質的合成 但對人核糖體不起作用 所以可用鏈霉素治療由細菌引起的疾病 主要成分是多糖 多肽或蛋白質 尤以多糖居多 經特殊的莢膜染色 特別是負染色 又稱背景染色 后可在光學顯微鏡清楚地觀察到它的存在 b 莢膜等并非細胞生活的必要結構 但它對細菌在環境中的生存有利 莢膜 某些細菌在其生長發育后期 在細胞內形成一個圓形或橢圓形 厚壁 含水量極低 抗逆性極強的休眠體 稱為芽孢 內生孢子 芽孢 細菌芽孢的特點 整個生物界中抗逆性最強的生命體 是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標 芽孢是細菌的休眠體 在適宜的條件下可以重新轉變成為營養態細胞 產芽孢細菌的保藏多用其芽孢 芽孢的有無 形態 大小和著生位置是細菌分類和鑒定中的重要指標 6細菌的二分裂 放線菌是具有菌絲 以孢子進行繁殖的一類原核微生物 放線菌 形態與結構 單細胞 大多由分枝發達的菌絲組成 菌絲直徑與桿菌類似 約1mm 細胞壁組成與細菌類似 細胞的結構與細菌基本相同 按形態和功能可分為營養 氣生和孢子絲三種 1 營養菌絲 匍匐生長于培養基內 吸收營養 也稱基內菌絲 一般無隔膜 直徑0 2 0 8mm 長度差別很大 2 氣生菌絲 營養菌絲發育到一定階段 伸向空間形成氣生菌絲 疊生于營養菌絲上 可覆蓋整個菌落表面 在光學顯微鏡下觀察 顏色較深 直徑較粗 1 1 4mm 有的產色素 3 孢子絲 氣生菌絲發育到一定階段 其上可分化出形成孢子的菌絲 即孢子絲 又稱產孢絲或繁殖菌絲 其形狀和排列方式因種而異 常被作為對放線菌進行分類的依據 分布特點及與人類的關系 放線菌常以孢子或菌絲狀態極其廣泛地存在于自然界 土壤中最多 其代謝產物使土壤具有特殊的泥腥味 能產生大量的 種類繁多的抗生素 其中90 由鏈霉菌產生 少數寄生型放線菌可引起人 動物 如皮膚 腦 肺和腳部感染 的疾病 藍細菌 也稱藍藻或藍綠藻 是一類含有葉綠素a 能以水作為供氫體和電子供體 通過光合作用將光能轉變成化學能 同化co2為有機物質的光合細菌 以前曾歸于藻類 因為它和高等植物一樣具有光和色素 葉綠素a 能進行產氧型光合作用 典型病毒粒的構造 核心和衣殼合稱核衣殼 為病毒的基本結構 有些復雜的病毒在衣殼的外面包裹著一層由脂類 蛋白質和多糖組成的囊膜 有的囊膜上還長有刺突 8病毒 8病毒 學生提出的問題 囊膜的成分為什么與細胞膜的成分相同 囊膜上的蛋白質是否決定病毒抗原特異性 囊膜的作用是什么 刺突的作用 病毒粒子并無個體的生長過程 而只有其兩種基本成分的合成和裝配 即 核酸復制 蛋白質合成 核蛋白 病毒粒子 一般可分五個階段 即吸附侵入增殖 復制與生物合成 成熟 裝配 裂解 釋放 病毒繁殖 艾滋病毒侵染 1病毒特點 無細胞結構 專性活細胞內寄生 沒有酶或酶系統極不完全 不能進行代謝活動 個體極小 能通過細菌濾器 對抗生素不敏感 對干擾素敏感 小結 細菌 放線菌和病毒的比較表 碳源 氮源 生長因子 無機鹽和水能源 1 碳源 微生物生長過程中能為微生物提供碳素來源的物質 微生物營養 目前在微生物工業發酵中所利用的碳源物質主要是單糖 淀粉 麩皮 米糠等 對于為數眾多的化能異養微生物來說 碳源是兼有能源功能營養物 微生物利用的碳源物質主要有糖類 有機酸 醇 脂類 烴 co2及碳酸鹽等 凡是能被用來構成菌體物質中或代謝產物中氮素來源的營養物質稱為氮源 1 氮源 氮源譜 有機氮 無機氮 nh3銨鹽硝酸鹽n2 蛋白質核酸氨基酸尿素 氮源 1 微生物的氮源譜也很廣 大大廣于動物或植物的 2 氨基酸自養型生物 綠色植物 很多微生物 尿素 銨鹽 硝酸鹽和氮氣 氨基酸異養型生物 動物 大量異養微生物 3 n c h o 類營養物常是異養微生物的能源 碳源兼氮源 3生長因子 事實 問題 如何證明某種物質是某種微生物的生長因子 幾種微生物所需的生長因子 生長因子小結 對微生物正常代謝必不可少有機物需要量一般很少生長因子種類 維生素 堿基 卟啉及其衍生物 甾醇 胺類 c4 c6的分枝或直鏈脂肪酸 氨基酸 總結 微生物的營養類型 光能自養型 以無機物如h2 h2s s等作為供氫體或電子供體 使co2還原為細胞物質 例如 藻類及藍細菌等和植物一樣 以水為電子供體 供氫體 進行產氧型的光合作用 合成細胞物質 而紅硫細菌 以h2s為電子供體 產生細胞物質 并伴隨硫元素的產生 光能異養型 以有機物作為供氫體 利用光能將co2還原為細胞物質 例如 紅螺菌屬中的一些細菌能利用異丙醇作為供氫體 將co2還原成細胞物質 同時積累丙酮 培養基的配制原則 一 目的明確二 營養協調三 物理化學條件適宜 目的明確 何菌 何目的 例如 發酵產物生產次級代謝產物b12加co 1營養物質濃度合適 過低 不能滿足正常生長 過高 可能對微生物生長起抑制作用 2營養物質間比例 c n 營養協調 c n 培養基中所含的c源中c原子的摩爾數 n源中n原子的摩爾數 例如 谷氨酸發酵c n 4 1菌體大量繁殖 產生的谷氨酸少c n 3 1菌體繁殖抑制 產生的谷氨酸多 三 物理化學條件適宜 ph微生物種類最適ph 一般 放線菌7 5 8 5細菌6 5 7 5霉菌4 0 5 8酵母菌3 8 6 0 為了維持培養基ph的相對恒定 通常在培養基中加入ph緩沖劑 或在進行工業發酵時補加酸 堿 培養基的種類 據物理性質分 液體培養基半固體培養基 凝固劑瓊脂 固體培養基 凝固劑瓊脂 據用途的不同 選擇培養基鑒別培養基教法 自學 表格 歸納 瓊脂 主要成分 多聚半乳糖的硫酸酯特性 極難分解 無營養價值 起支撐作用 透明度好 粘著力強 耐加壓 三種培養基的比較 用途分 分離 微生物的特殊營養要求或對其某化學 物理因素抗性 某種指示劑與某一菌的無色代謝產物發生顯色反應 鑒別 選擇培養基參考資料 加入青霉素的培養基分離酵母菌 霉菌等真菌 抑制細菌 放線菌 加入高濃度食鹽的培養基分離金黃色葡萄球菌 抑制多種細菌 不加氮源的無氮培養基分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養基分離自養型微生物加入氨基喋呤 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養基分離雜交瘤細胞 鑒別培養基 伊紅美藍乳糖培養基 emb 機理 染料抑制g 在低酸度時 結合形成沉淀 起著產酸指示劑的作用 用途 多種腸道菌鑒別 微生物的代謝 資料1 若干微生物和動物 植物組織的呼吸速率 代謝特點 資料2 發酵乳糖的細菌在1小時內可分解其自重1000 10000倍的乳糖 產朊假絲酵母合成蛋白質的能力比大豆強100倍 比食用牛強10萬倍 結論 代謝旺盛探究其原因 體積小 面積大 有利于吸收 排泄和信息的交換 初級代謝產物和次級代謝產物的不同 教法 自學表格交流 微生物代謝的調節 重點 微生物細胞代謝的調節主要是通過控制酶的作用來實現的 調節類型 酶合成調節 酶活性調節 通過酶分子結構的改變來調節變構調節 可逆性 通過調節酶的合成進而調節代謝速率的調節機制 是在遺傳學水平上發生的 酶合成的調節和酶活性的調節的比較 合成條件基因和誘導物只基因控制 調節教法建議 實例1谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的調節實例2大腸桿菌合成半乳糖苷酶的調節 微生物代謝調節的兩種主要方式 總結比較表 問題 半糖苷酶為什么在葡萄糖和乳糖同時存在時不能合成 酶合成調節有兩種形式 誘導和阻遏 葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成 稱為葡萄糖效應 阻遏 微生物代謝的人工控制 重難點 措施 改變微生物的遺傳特性 例如誘變處理控制發酵條件 例如改變細胞膜的透性 控制細胞膜的滲透性 加入亞適量生物素 培養條件控制 在谷氨酸發酵生產中 生物素的濃度對谷氨酸的累積量有明顯的影響 只有把生物素的濃度控制在亞適量的情況下 才能分泌大量的谷氨酸 因此控制生物素的含量可以改變細胞膜的成分 進而改變膜的透性 谷氨酸的分泌和反饋調節 高絲氨酸缺陷型菌株不能合成高絲氨酸酶 故不能合成高絲氨酸 也不能合成蘇氨酸和甲硫氨酸 在補給適量的高絲氨酸就可產生大量的賴氨酸 示圖 協同抑制現象及結果控制目的 原理 方法 微生物的生長 細菌數目的對數 時間 1 2 3 4 群體生長的實質是包含著個體細胞生長與繁殖交替進行的過程 調整期 延遲期 適應期 特點 菌數不立即增加 或增加很少 生長速度接近于零 代謝活躍 通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使之縮短 利用對數生長期的細胞作為 種子 盡量使接種前后所使用的培養基組成不要相差太大 適當擴大接種量等方式縮短 克服不良的影響 在工業發酵和科研中通常采取一定的措施縮短延滯期 對數期 細菌個體形態 化學組成和生理特性等均較一致 代謝旺盛 生長迅速 代時穩定 是研究微生物基本代謝的良好材料 在生產上用作種子 以最大的速率生長和分裂 細菌數量呈對數增加 穩定期 營養物質消耗 代謝產物積累和ph等環境變化 逐步不適宜于細菌生長 原因 采取措施 補充營養物質或取走代謝產物或改善培養條件 如對好氧菌進行通氣 攪拌或振蕩等 生長速率降零代謝產物大量積累的產物如外毒素 內毒素 抗生素 以及芽胞等 衰亡期 細菌代謝活性降低 細菌衰老并出現自溶 產生或釋放出一些產物 細胞呈現多種形態 有時產生畸形 細胞大小懸殊 該時期死亡的細菌以對數方式增加 現象 教法建議 給出某種細菌的生長曲線得到此曲線需要的條件 如何測定 請參考教師教學用書 分析各期的特點和成因 分析其的實踐意義 參考問題如下 1 調整期的特點是什么 如何縮短 2 對數期有何特點 處于此期的微生物有何實際應用 3 穩定期有何特點 為什么在對數期后 如果不創造特殊條件 就必然進入穩定期 在工業發酵過程 需要延長穩定期 以提高代謝產物的產量 如何解決 連續培養 連續培養的基本原則 微生物培養過程中不斷的補充營養物質和以同樣的速率移出培養物 優點 縮短發酵周期 提高設備利用率 便于自動控制 降低動力消耗及體力勞動強度 產品質量較穩定 缺點 雜菌污染和菌種退化 環境因素對微生物的影響 影響因素 氧 溫度 ph值 一 溫度 微生物生長的最適溫度不同 可以將微生物分為嗜冷 兼性嗜冷 嗜溫 嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型 最適生長溫度 某菌分裂代時最短或生長速率最高時的培養溫度 二 ph 三 氧 根據氧與微生物生長的關系可將微生物分為 好氧 微好氧 耐氧型 兼性厭氧 專性厭氧 能源工業酒精 利用酵母發酵生產酒精技術已相當成熟 氫 而某些海洋光合細菌 如假單細胞 能利用玉米甚至制糖廠 造紙廠的廢液直接發酵放氫 這方面研究一旦突破其效益是不可估量的 環