項目四 超氧化物歧化酶 SOD 的生產 任務一 SOD制備方案的制定 生藥1121第五組2011423242楊恪鑒 一 SOD的概況 1 SOD的概念超氧物歧化酶 SuperoxideDismutase簡稱SOD 是一種新型酶制劑 它在生物界的分布極廣 幾乎從動物到植物 甚至從人到單細胞生物 都有它的存在 SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶 人體內的垃圾清道夫 SOD是氧自由基的自然天敵 是機體內氧自由基的頭號殺手 是生命健康之本 全球118位科學家發表聯合聲明 自由基是百病之源 SOD是健康之本 體內的SOD活性越高 壽命就越長 2 SOD的分類 3 作用原理 基本原理SOD屬于金屬蛋白酶 按照結合金屬離子種類不同 該酶有以下三種 含銅與鋅超氧化物歧化酶 Cu ZnSOD 含錳超氧化物歧化酶 Mn SOD 和含鐵超氧化物歧化酶 Fe SOD 三種SOD都催化超氧化物陰離子自由基 將之歧化為過氧化氫與氧氣 人體內的自由基 在細胞由于自由基非?；顫?化學反應性極強 參與一系列的連鎖反應 能引起細胞生物膜上的脂質過氧化 破壞了膜的結構和功能 它能引起蛋白質變性和交聯 使體內的許多酶及激素失去生物活性 機體的免疫能力 神經反射能力 運動能力等系統活力降低 同時還能破壞核酸結構和導致整個機體代謝失常等 最終使機體發生病變 4 SOD的理化性質3 1SOD對氰化物和H2O2的敏感性3 2SOD的吸收光譜特性3 3SOD穩定性及影響因素 5 SOD的作用 它催化超氧陰離子轉化為H2O2和O2的反應 即催化超氧陰離子自由基O2 發生歧化反應 從而清除O2 2O2 2H H2O2 O2 在生命體的自我保護系統中起著極為重要的作用 在免疫系統中也有重要的功 因而它能防御氧毒性 增強機體抗輻射損傷能力 防衰老 6 測定 超氧化物歧化酶 SOD 的催化底物是O2 一般多以一定時間內產物生成量或底物的消耗量作為酶活性單位 由于O2自身很不穩定 且不易制備 測定SOD的方法除少數采用直接法外 一般多為間接法 常用的有 鄰苯三酚自氧化法 細胞色素C還原法 McCord法 化學發光法 免疫學方法 電泳法 3 1SOD對氰化物和H2O2的敏感性 長時間用過氧化氫處理可使CuZn SOD和Fe SOD失活 而Mn SOD不受影響 3 2SOD的吸收光譜特性 CuZn SOD具有獨特的紫外吸收光譜 由于色氨酸和酪氨酸的含量較低 它在280nm處并沒有最大吸收峰 CuZn SOD的可見光最大吸收波長都在680nm左右 這反映了酶分子中Cu2 的光學特性 3 3SOD穩定性及影響因素 PH 熱 蛋白酶的影響 SOD在pH5 3 9 6間催化性能良好 在pH4 5 pH11間能穩定存在 pH3 6時 CuZn SOD中95 的Zn要脫落 在pH12 2時 SOD的構象會發生不可逆的轉變而使酶失活 SOD對熱的穩定性與溶液中離子強度有關 當離子強度很低時 即使加熱到95 其活性損失也很少其他因素 SOD活性受飲料的色澤 成分 酸堿度 乙醇含量等多種因素的影響 只有在無色 近中性 無乙醇飲料中SOD活性較穩定 另外還發現有機溶劑和Cl對SOD的活性具抑制作用 二SOD的運用 1 藥物SOD是一種新型的抗炎癥藥 根據SOD作用機制和毒性試驗 它對治療因O2 引起的各種疾病都有一定的療效 為此 SOD可作為抗衰老 抗炎癥 自身免疫疾病患者廣泛應用的醫藥品 此外 SOD對治療貝切特氏癥 心肌梗塞等血虛性心臟病 膠原病 新生兒呼吸困難綜合癥 防御放射性傷害等也可望有效 二SOD的運用 2 添加劑國外不少高級化妝品都添加SOD 國內也有數家工廠或公司在開發和生產SOD化妝品 如大寶SOD密 康妮SOD SOD康舒達霜劑等 SOD作為化妝品添加劑主要有3個優點 1 有明顯的防曬效果 2 可防皮膚衰老 阻止紫褐質 老年斑 的形成 3 有明顯的抗炎效果 對防治皮膚病有一定效果 國外把SOD作為食品添加劑的例子是加在口香糖和飲料中 我國貴州農學院已開發出刺梨SOD飲料 SOD及修飾過的SOD還可作為外用藥膏 眼藥及牙膏等的添加劑 二SOD的運用 3 生化試劑國外已有數家公司如Sigma公司等出售SOD試劑 國內也有廠家批量生產SOD試劑 如中科院上海生化所東風試劑廠 南京建成生物工程研究所等 此外 SOD有可能作為某些疾病的探針 如郭彥等人認為腦瘤組織線粒體Mn SOD降低是轉化細胞的可靠生化指標之一 并可作為評估腦瘤分化程度的參考 綜上所述 隨著人們對SOD更廣泛深入的研究 不同類型SOD SOD修飾物及人工有機合成SOD模擬酶將在醫療 保健 食品 農業增產等方面發揮出更大的作用 三 SOD的生產 1 SOD酶的提取稱取5克大蒜蒜瓣 加入石英砂研磨破碎細胞后 加入pH7 8 0 05mol L的磷酸緩沖液 pH7 8 15ml 繼續研磨20min 使SOD酶充分溶解到緩沖液中 然后6000r min冰凍離心15min 放棄沉淀 取上清液 2 去除雜蛋白上清液中加入0 25倍體積的氯仿 乙醇混合液攪拌15min 6000r min離心15min 放棄沉淀 得到的上清液即是粗酶液3 SOD酶的沉淀分離粗酶液在攪拌下緩慢加入固體硫酸銨至飽和濃度60 持續攪拌15min 6000r min離心15min 得到SOD酶沉淀 三 SOD的生產 4 將沉淀溶入pH7 8 0 05mol L的磷酸緩沖液5mL中 然后6000r min離心15min 放棄沉淀 取上清液 用凝膠sephacylS 200進行純化 然后超濾濃縮 5 用紫外分光光度計測定濃液的蛋白含量6 將濃縮冷凍干燥后即得成品 四 超氧化物歧化酶 SOD 的測定 原理連苯三酚在堿性條件下 能迅速自氧化 釋放出O2 生成帶色的中間產物 在自氧化過程的初始階段 黃色中間產物的積累在滯后30 45s后就與時間呈現性關系 中間產物在325nm處有強烈的光吸收 在有SOD存在時能催化生成O2和H2O2 從而阻止了中間產物的積累 通過計算就可以求出SOD的活力 儀器紫外分光光度計 pH計 離心機 試劑 0 05mol L連苯三酚溶液 稱取3 15g連苯三酚用0 01mol L鹽酸溶液溶解并定容至500ml pH 8 3Tris HCl緩沖溶液 0 1mol L三羥甲基氨基甲烷 Tris 溶液 NH2C CH2OH 3121 14取12 114g 溶解 定容至100ml 0 1mol L鹽酸 取8 6 9 ml濃鹽酸 稀釋至1000ml 50毫升0 1mol L三羥甲基氨基甲烷 Tris 溶液19 9 毫升0 1mol L鹽酸混勻并稀釋至100毫升 保存溫度 常溫密封避光保存 測定步驟 酶液的制備稱取6g樣品 加于現在冰箱中放置的緩沖液60ml 樣品的10倍 視情況定 在冰浴中研磨成勻漿 四層紗布過濾 濾液經4000r min離心20min 取上清液用于酶活測定 連苯三酚自氧化速率的測定取4 5ml緩沖液 在25 水浴中保溫15min 加入10連苯三酚液 迅速搖勻空白 取4 5ml緩沖液 在25 水浴中保溫15min 加入10緩沖液 迅速搖勻倒入光徑1cm的比色杯中 在325nm波長下于恒溫池中每隔30s測A值一次計算線形范圍內 每1minA的增值 此即連苯三酚的自氧化速率 要求自氧化速率控制在0 07OD min 酶活測定測定方法與測連苯三酚自氧化速率相同 取1 5ml緩沖液 在25 水浴中保溫15min 加入3ml酶液 加入10連苯三酚液 迅速搖勻空白 取1 5ml緩沖液 在25 水浴中保溫15min 加入3ml酶液 加入10緩沖液 迅速搖勻計算加酶后連苯三酚自氧化速率 結果計算 樣品酶活單位表示 SOD酶活單位 U g鮮重樣品酶活單位 式中 酶樣品在325nm處每分鐘光密度變化值V 反應液體積n 酶液稀釋倍數 若酶液足夠多 可不稀釋即n為1 五 SOD使用及生產時的注意事項 1