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文檔簡介

TUNEL TdT mediateddUTPnickendlabeling 法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法 對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色 能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征 可用于石蠟包埋組織切片 冰凍組織切片 培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定 并可檢測出極少量的凋亡細胞 靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高 因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用 TdT介導的dUTP缺口末端標記技術 TUNEL TUNEL TUNEL的原理 TUNEL的操作步驟 結果及注意事項 主要試劑 1 緩沖液 LabelingBuffer 用于維持一定的反應條件 含有以下成分 500mmol L二甲胂酸鉀 pH7 210mmol LCoCl2 氯化鈷 1mmol LDTT 二硫蘇糖醇 2 末端脫氧核糖核酸轉移酶 TdT 催化3 OH末端dUTP反應的關鍵酶3 熒光素 dUTP TdT的底物和本實驗的標記物4 蛋白酶K 消化組織 增加細胞通透性 凋亡細胞的特征是 內源性核酸內切酶被激活 細胞自身的染色質DNA被切割 出現單鏈或雙鏈缺口 并產生與DNA斷點數目相同的3 OH末端 末端脫氧核糖核酸轉移酶 TerminaldeoxynucleotidylTransferaseTdT 能將脫氧核糖核苷酸連接到DNA的3 末端 TUNEL的原理是 用熒光素 fluorescein 標記的脫氧核糖核苷酸 在TdT的作用下連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3 OH末端 用熒光顯微鏡即可觀察結果 在此基礎上連接辣根過氧化酶標記的熒光素抗體 可進一步放大檢測信號 并且普通顯微鏡觀察實驗結果 由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂 因而沒有3 OH形成 很少能夠被染色 TUNEL原理 標本處理 實驗步驟 實驗流程 結果 注意事項 極少數細胞凋亡時沒有DNA斷裂或DNA裂解不完全 此時不適用TUNEL法檢測 進而產生假陰性結果 在個別類型的壞死細胞中也發現TUNEL檢測呈陽性 在高度增殖 代謝的組織細胞中可產生

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