與耐藥機制有關藥敏試驗的規范化 與耐藥機制有關的藥敏試驗的規范化操作。前言，細菌耐藥已成為一個全球性的問題，已對人類健康構成嚴重的威脅。耐藥細菌感染導致病人住院時間延長、費用增加、死亡率增高，同時也給臨床醫生抗感染治療帶來困難。因此，檢測細菌耐藥機制是當今細菌學的一個重要課題，也是正確指導臨床醫生合理使用抗生素的重要依據。在細菌耐藥機制檢測方面，包括分子生物學等許多實驗方法被廣泛運用。但這些方法的技術要求普遍較高，大多數被用于基礎研究。真正應用到臨床微生物實驗室的試驗方法，要求操作簡便、重復性好，結果準確、可靠，試驗成本不能太高。我國衛生部于1998年規定：我國藥敏試驗暫按clsi歷年頒布的所有微生物藥敏試驗文件作為部頒標準，此決定至今未改變。本節所講內容，主要是clsi（m100-s22）文件推薦的臨床微生物實驗室常規檢測方法。也是我們從事臨床微生物檢驗技術人員必須掌握的內容。包括兩個內容，第一個就是革蘭陽性球菌耐藥機制的實驗室檢測項目。第二個內容是革蘭氏陰性發酵細菌以及其他細菌的耐藥機制。首先介紹青霉素酶的檢測。檢測青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和顯色頭孢菌素法等，臨床應用較多的是顯色頭孢菌素法。其原理是將受菌株與頭孢硝噻吩作用一段時間后，如受試菌株產生青霉素酶，則可水解頭孢硝噻吩的 - 內酰胺環，產生由黃色向紅色轉變的顏色反應，即為青霉素酶試驗陽性。頭孢硝噻吩法是目前檢測嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌屬產生 - 內酰胺酶的最好方法，具有快速、靈敏和簡便的特點，但價格相對較昂貴。方法，檢測時用1滴無菌水將nitrocefin紙片濕潤，將受試菌直接涂抹于濕潤后的nitrocefin紙片上，即可觀察顏色的反應，產生紅色者為產酶陽性。質控菌株，陰性株為金黃色葡萄球菌atcc25923；陽性株為金黃色葡萄球菌atcc29213。注意事項，目前實驗室多采用bd公司生產的非頭孢硝噻吩顯色頭孢菌素紙片，這個紙片進行 - 內酰胺酶測試，效果稍好于頭孢硝噻吩，可降低金黃色葡萄球菌陽性結果的反應時間。葡萄球菌可誘導 內酰胺酶的檢測。這項內容呢是 clsim100 s21 。方法，如果青霉素對葡萄球菌的mic值小于等于0.12每毫升微克的時候 或者抑菌環直徑大于等于 29毫米 的時候，應該對其進行可誘導 - 內酰胺酶的檢測。將待檢菌株傳代到血瓊脂平板或者是mha瓊脂平板上，用苯唑西林紙片或者是頭孢西丁紙片作為誘導劑，具體方法可參照紙片擴散法藥敏試驗，大氣環境孵育16到18小時后，檢測抑菌圈周邊細菌的產酶情況。可誘導 - 內酰胺酶檢測陽性的菌株，應報告對不耐酶青霉素耐藥。質控菌株，陰性株用金黃色葡萄球菌 atcc25923；陽性株用金黃色葡萄球菌 atcc29213。cxim100 s22 文件中增加了用10單位青霉素紙片作為誘導劑檢測葡萄球菌可誘導 內酰胺酶的方法，具體方法同苯唑西林和頭孢西丁紙片法。第二個內容介紹甲氧西林耐藥葡萄球菌，也就是mrs檢測。檢測meca基因和其表達的青霉素結合蛋白 2a ，是預報葡萄球菌對甲氧西林耐藥最準確的方法，它也被用于證實從嚴重感染病人分離的葡萄球菌紙片擴散法藥敏試驗結果。攜帶meca 基因或者是產pbp 2a 的葡萄球菌分離株，應報告對苯唑西林耐藥。不攜帶meca或不產pbp 2a 菌株應報告對苯唑西林敏感。由于罕見的非meca基因介導的苯唑西林耐藥機制，在紙片擴散法確定為苯唑西林耐藥時，應加測苯唑西林mic，若mic值大于等于4個每毫升微克，即使meca基因和pbp 2a 檢測為陰性，也應報告苯唑西林耐藥。可用紙片擴散法檢測這些菌株對頭孢西丁的敏感性。苯唑西林紙片擴散法篩選試驗，方法，使用含1個微克的苯唑西林紙片，而不是甲氧西林或萘夫西林來檢測金黃色葡萄球菌對甲氧西林的耐藥性。用直接菌落懸液法制備接種物，配成0.5麥氏比濁濃度菌液，接種mh瓊脂平板，待瓊脂表面的水份干后，貼苯唑西林紙片，于33至35度，大氣環境孵育24小時，檢測抑菌圈直徑。結果判斷，按clsi解釋標準判斷結果。金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于10個毫米為耐藥，大于 13毫米 為敏感。質控菌株用金黃色葡萄球菌atcc25923。注意事項，試驗溫度超過35度不能檢測出mrs；孵育時間不能少于24小時；在透射光下仔細觀察苯唑西林紙片周圍抑菌圈內有沒有細小菌落或者輕微彌漫生長，如果有生長提示苯唑西林耐藥；如果金黃色葡萄球菌紙片擴散法結果中，結果為中介時也就是直徑在11到 12毫米 時，或者 mic 為0.5到2個每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶陰性葡萄球菌引起嚴重感染時，必須進行meca基因或者是pbp 2a 測定，或者是頭孢西丁紙片試驗、苯唑西林mic試驗或者是苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗，來確定是否為mrs菌株，選擇其中一種試驗結果進行報告。苯唑西林鹽瓊脂篩選試驗，試驗用的mh瓊脂中含苯唑西林每毫升6個微克，并添加有4%的氯化鈉，或者是每毫升0.68摩爾。方法，直接菌落懸浮液獲得0.5麥氏單位濃度。進行試驗時，使用1微升接種環蘸取菌液，在平板上涂成直徑10到 15毫米 斑點。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點或劃滿四分之一區域。將瓊脂平板置33到35度，大氣環境孵育24小時后用透射光檢查有無細菌生長，任何生長都表示對苯唑西林耐藥。注意事項，試驗溫度超過35度不能檢測出mrs；為從凝固酶陰性葡萄球菌中檢測出甲氧西林耐藥菌株，需將瓊脂平板孵育48小時。質控菌株，敏感株atcc29213；耐藥株atcc43300。頭孢西丁紙片法。方法，應用標準的紙片擴散法試驗條件接種mh瓊脂平板，使用含30微克頭孢西丁紙片，33到35度大氣環境孵育。金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌孵育16到18小時報告結果，凝固酶陰性葡萄球菌除路鄧葡萄球菌以外要孵育24小時，如耐藥則在孵育18小時后可報告結果。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗結果。結果判讀，頭孢西丁對金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于 21毫米 時，應報告對苯唑西林耐藥，大于等于 22毫米 應報告對苯唑西林敏感。除路鄧葡萄球菌外其他凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑小于等于 24毫米 時，應報告對苯唑西林耐藥，大于等于 25毫米 應報告對苯唑西林敏感。注意事項，試驗溫度超過35度不能檢測出mrs；檢測凝固酶陰性葡萄球菌對苯唑西林的耐藥性，頭孢西丁紙片試驗是首選方法，因為頭孢西丁較苯唑西林的敏感性高。meca基因及pbp 2a 檢測，方法，可采用乳膠凝集或分子生物學等方法進行檢測。結果判斷，meca基因或pbp 2a 檢測陽性的葡萄球菌分離株，應報告對苯唑西林和甲氧西林耐藥。不攜帶meca基因或不產pbp 2a 菌株應報告對苯唑西林和甲氧西林敏感。質控菌株，meca陰性用atcc29213；meca陽性用atcc43300。苯唑西林mic試驗方法，可采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法或etest等方法進行檢測。結果判讀，若苯唑西林mic值大于等于每毫升4個微克，即使meca基因和pbp 2a 檢測為陰性，也應報苯唑西林耐藥。可同時用紙片擴散法檢測這些菌株對頭孢西丁的敏感性。注意事項，一，試驗溫度超過35度不能檢測出mrs；二，孵育時間不能少于24小時；三，在透射光下觀察瓊脂上有無細小菌落或輕微彌漫生長，如果有生長提示苯唑西林耐藥。質控菌株，敏感株atcc29213；耐藥株 a tcc43300。mrs的臨床報告，對于甲氧西林耐藥的葡萄球菌即 m rs，應報告對所有 - 內酰胺類藥物耐藥，而不考慮這些藥物的體外試驗結果是否敏感。因為大多數文獻報告了mrs感染對 - 內酰胺類治療反應差或者沒有令人信服的臨床數據證實這些藥的臨床效果。萬古霉素耐藥葡萄球菌的篩選試驗，一，紙片篩選法；方法，應用標準的紙片擴散法試驗條件接種mh瓊脂平板，使用含30微克萬古霉素紙片，35度加減2度，大氣環境孵育24小時。結果判斷，clsi m100-s19中已經取消了萬古霉素對葡萄球菌的紙片擴散法判斷折點。紙片擴散法只能檢測vana基因型的萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌，這種菌株無抑菌圈，應確認該菌株的鑒定結果。對未測定萬古霉素mic，而萬古霉素抑菌圈直徑大于等于 7毫米 的葡萄球菌，不能報告其對萬古霉素敏感。注意事項，紙片擴散法檢測萬古霉素結果不可靠。紙片擴散法不能區分萬古霉素敏感，也就是mic范圍在0.5至2個微克每毫升和萬古霉素敏感性減低的菌株，也就是mic值在4到8每毫升微克。萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌mic大于16每毫升微克，在萬古霉素紙片周圍僅見輕微生長。因此，用含每毫升6個微克萬古霉素的bhi 瓊脂平板篩選平板，可提高檢測萬古霉素中介和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。瓊脂篩選法，用含每毫升6個微克萬古霉素腦心浸液瓊脂對耐萬古霉素金黃色葡萄球菌進行篩選試驗。方法，直接菌落懸液獲得0.5 麥氏濁度，使用微量吸管吸取菌液10個微升，點種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余的菌液，在平板上涂成直徑10 到 15毫米 斑點或在部分區域劃線接種，35加減2度，大氣環境孵育24小時，觀察結果。結果判斷，在透射光下仔細觀察，如果點種位置出現1個以上菌落，推測菌株對萬古霉素敏感性減低。注意事項，用含每毫升6個微克萬古霉素bhi瓊脂篩選平板，可提高檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌的敏感性。 但瓊脂篩選法不能可靠檢測visa，這是葡萄球菌對萬古霉素中介的菌株，mic值等于4個每毫升微克菌株不生長。質控，敏感株 atcc29212；耐藥株 atcc51299。萬古霉素mic確認試驗。方法，可采用瓊脂或肉湯稀釋法或etest等方法進行檢測。結果判斷，金黃色葡萄球菌mic值小于等于每毫升2個微克為敏感，mic值在4到8每毫升微克為敏感性降低，mic值大于16每毫升微克為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌mic值小于等于每毫升4個微克為敏感，mic值在4到16每毫升微克為敏感性降低，mic值大于等于32每毫升微克為耐藥。注意事項，檢測到萬古霉素mic值大于等于每毫升8個微克的金黃色葡萄球菌，或者是mic值大于等于每毫升32微克的凝固酶陰性葡萄球菌，應送參考實驗室進一步確認。誘導性克林霉素耐藥試驗檢測，耐藥機制，對大環內酯耐藥的葡萄球菌或者是 - 溶血鏈球菌，可能存在有結構性或者是誘導性對克林霉素的耐藥，或者只對大環內酯類耐藥。檢測方法，誘導克林霉素耐藥試驗又稱“d”抑菌環試驗。配養基，用 mh 瓊脂，加或不加5%的綿羊血。接種物，直接菌懸液法，相當于0.5麥氏標準濃度。孵育，35度加減2度，大氣環境16到18小時。方法，貼紅霉素紙片和克林霉素紙片，紙片間距離15至26毫米。結果判斷，若靠近紅霉素紙片一側克林霉素的抑菌環出現“截平”現象，也就是稱為“d”抑菌環，則菌株存在克林霉素誘導耐藥，應報告對“克林霉素耐藥”。在報告單中可注明“經誘導克林霉素耐藥試驗推測此菌株對克林霉素耐藥，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若無“截平”現象，則應報告菌株對克林霉素敏感。質控菌株，陰性對照，金黃色葡萄球菌 atcc 25923或者是金黃色葡萄球菌 atcc baa-976。陽性對照，金黃色葡萄球菌 atcc baa-977。金黃色葡萄球菌，高水平莫匹羅星耐藥性檢測。紙片擴散法，方法，用標準的紙片擴散法試驗條件接種mh瓊脂平板，使用含200微克莫匹羅星紙片，35度加減2度，大氣環境孵育24小時。在透射光下仔細觀察紙片周圍抑菌圈內有無細小菌落或輕微彌漫生長，如果有生長提示莫匹羅星耐藥。結果判讀，無抑菌圈等于高水平莫匹羅星耐藥； 有抑菌圈等于非高水平莫匹羅星耐藥。質控菌株，atcc25923莫匹羅星抑菌圈直徑在29至38毫米；atcc baa1708無抑菌圈。肉湯微量稀釋法，用調節陽離子m-h肉湯配成單一的莫匹羅星，也就是每毫升256微克試驗孔。方法，應用標準的肉湯微量稀釋法試驗條件進行接種，在35加減2度，大氣環境孵育24小時。結果判讀，在透射光下進行判讀。如果有生長等于高水平莫匹羅星耐藥；無生長等于非高水平莫匹羅星耐藥。質控菌株atcc 29213， mic 值應該在0.06至0.5每毫升微克；atcc 29212 mic 值應該在16到128每毫升微克；atcc baa1708應該在256每毫升微克生長。解釋，盡管clsi m100-s22中未提供莫匹羅星的折點，但紙片擴散法和mic篩選試驗能識別出莫匹羅星mic值大于512每毫升微克的菌株即高水平耐藥株。腸球菌對青霉素或者氨芐西林耐藥性檢測。腸球菌對青霉素和氨芐西林耐藥是因為產生了低親和力的青霉素結合蛋白，個別菌株是產生 - 內酰胺酶。紙片擴散法藥敏試驗可準確測定pbp改變的菌株，但對產 - 內酰胺酶的菌株結果不可靠。此類菌株應檢測 - 內酰胺酶。高水平氨基糖苷類耐藥腸球菌的檢測。方法，用高濃度慶大霉素也就是每片120微克，或者是鏈霉素每片300微克紙片可以篩選出此類耐藥性。結果判斷，無抑菌圈為耐藥，抑菌圈直徑大于等于 10毫米 時表示為非高水平耐藥。抑菌圈直徑在7到 9毫米 的菌株應使用稀釋篩選試驗進行檢測。對于慶大霉素，稀釋法的mic值大于每毫升500微克即為耐藥。對于鏈霉素，微量肉湯稀釋法的mic值大于每毫升1000微克，瓊脂稀釋法的mic值大于每毫升2000微克，即為耐藥。hlar的臨床意義：對高濃度氨基糖苷類敏感，表示氨基糖苷類與作用于細胞壁的抗菌藥物聯合用藥時對該腸球菌菌株將具有協同作用，也是敏感的。對氨基糖苷類高水平耐藥，表示當青霉素或糖肽類與一種氨基糖苷類抗生素聯合用藥時對該腸球菌菌株不會產生協同效果。萬古霉素耐藥腸球菌的檢測。要想使用紙片擴散法準確檢測出耐萬古霉素腸球菌，需要將平板孵育滿24小時而不是16到18小時,借透射光仔細檢查抑菌圈內有無細小菌落或彌漫生長。紙片擴散法結果為中介度也就是在8到 16毫米 時應選mic值。可采用瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法或etest等方法進行mic值的檢測。篩選試驗，用每毫升6個微克萬古霉素的腦心浸液瓊脂篩選試驗，35加減2度，大氣環境孵育24小時，點種位置出現1個以上菌落，推測菌株對萬古霉素敏感性減低。青霉素耐藥肺炎鏈球菌的檢測。一，肺炎鏈球菌的耐藥機制，青霉素耐藥肺炎鏈球菌的耐藥機制是肺炎鏈球菌有6種青霉素結合蛋白發生改變，改變后使pbp與青霉素的結合力下降，因而導致耐藥。二，紙片擴散法檢測。方法，使用含1個微克的苯唑西林紙片而不是青霉素紙片，來檢測肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥性。培養基用 mh 瓊脂加5%綿羊血。接種物，使用綿羊血瓊脂平板上過夜生長的菌落制備接種物，采用直接菌落懸液法，相當于0.5麥氏標準。孵育，35加減2度，在5%二氧化碳環境，孵育20到24小時。結果判讀，苯唑西林大于等于 20毫米 對青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19毫米 時，應測定青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松和美羅培南的mic值。質控菌株用肺炎鏈球菌 atcc 49619 。結果報告，當苯唑西林抑菌圈大于等于 20毫米 時可報告肺炎球菌對青霉素敏感，并同時可報告氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉維酸、頭孢克羅、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、亞胺培南、氯碳頭孢和美羅培南敏感，而不需要再檢測這些藥物的敏感性。當苯唑西林的抑菌圈直徑小于等于 19毫米 的菌株應當檢測青霉素、頭孢噻肟或頭孢曲松及美羅培南的mic值，因為抑菌環直徑小于等于 19毫米 時，可以發生在青霉素耐藥、中介或敏感的某些菌株中，不能僅僅根據苯唑西林的抑菌環直徑小于等于 19毫米 ，就報告對青霉素耐藥或中介。肉湯稀釋法檢測。方法，用加2%到5%融血馬血的調節陽離子m-h肉湯做肺炎鏈球菌的稀釋法藥敏試驗，35加減2度，大氣環境孵育20到24小時，瓊脂稀釋法應放在二氧化碳環境下孵育。結果判讀，一，口服青霉素v，青霉素mic值小于等于0.06每毫升微克時為敏感， mic 值大于等于每毫升2個微克為耐藥。二，青霉素注射液，腦脊液分離株，青霉素mic值小于等于0.06每毫升微克為敏感， mic 值大于等于0.12每毫升微克為耐藥。非腦脊液分離株，青霉素mic值小于等于每毫升2個微克為敏感，mic值大于等于每毫升8個微克為耐藥。質控菌株，肺炎鏈球菌atcc 49619。第二部分， - 內酰胺酶介導的革蘭陰性發酵細菌的耐藥機制檢測。革蘭陰性發酵細菌對 - 內酰胺類抗生素的主要耐藥機制，一，產生 - 內酰胺酶水解滅活藥物；二，細菌外膜通透性下降；三，主動泵出藥物。其中產生 - 內酰胺酶是革蘭陰性發酵細菌對 - 內酰胺類抗生素耐藥的主要原因。臨床上重要的 - 內酰胺酶有以下幾種：一，超廣譜 - 內酰胺酶，也就是esb l ；二，頭孢菌素酶，也就是ampc酶；三，碳青霉烯酶，主要包括kpc酶。超廣譜 - 內酰胺酶的檢測。clsi根據pk-pd性能評價和有限的臨床資料，首次于2010年1月也就是 clsi m100-s20文件修訂了頭孢菌素和氨曲南的解釋標準。因此，在使用新修訂的解釋標準時不需要常規檢測esbl，除非是在使用舊的解釋標準或者是為了流行病學調查以及感染控制的目的仍需要檢測esbl。初篩試驗，按常規的標準呢紙片擴散法進行操作對肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌和大腸埃希菌，如果下列紙片抑菌圈直徑，提示菌株可能產生 esbl 。對奇異變形桿菌抑菌圈直徑和上述菌有所不同。按常規的標準肉湯稀釋法進行操作。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌判斷標準：頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松或頭孢噻肟任何一種藥物對的mic值大于等于每毫升2個微克，頭孢泊肟 mic 值大于每毫升8個微克，提示菌株可能產生 esbl 。奇異變形桿菌判斷標準：頭孢泊肟、頭孢他啶或頭孢噻肟mic值大于每毫升2個微克，提示菌株可能產生esbl。雙紙片協同法。按照常規的紙片擴散法在mh瓊脂上涂布好受試菌，先在瓊脂平板中心貼上阿莫西林加克拉維酸紙片，然后在其上下左右貼上頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟和氨曲南紙片，各紙片中心距復合紙片中心距離為20到 30毫米 ，35加減2度，大氣環境孵育16到18小時。結果解釋，如周圍4個藥物紙片，其中任何一個抑菌圈在靠近復合劑紙片一側的邊緣出現擴大或加強，說明該菌株產esbl。擴散法質控，esbl陰性質控用大腸埃希菌atcc 25922。esbl陽性質控肺炎克雷伯菌atcc 700603。微量肉湯稀釋法初篩試驗。方法用調節陽離子m-h肉湯，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌選用，頭孢他啶每毫升1個微克，氨曲南每毫升1個微克，頭孢曲松每毫升1個微克或頭孢噻肟每毫升1個微克。奇異變形桿菌選用頭孢泊肟每毫升1個微克或頭孢他啶每毫升1個微克或頭孢噻肟每毫升1個微克。35加減2度，大氣環境孵育16到20小時。結果判斷如果生長提示菌株產esbl。注意事項，使用一種以上的藥物進行檢測可提高檢測的敏感性。質控菌株，atcc 25922不太明顯；肺炎克雷伯菌atcc 700603的生長平等。esbl表型確證試驗。紙片擴散法，使用每片含30微克的頭孢他啶、頭孢噻肟和頭孢他啶加克拉維酸、頭孢噻肟加克拉維酸的復合劑紙片進行試驗，當任何一種復合紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨藥敏紙片抑菌圈直徑 5毫米 ，可確認該菌株產esbl。質控菌株大腸埃希菌atcc 25922小于等于2個毫米，肺炎克雷伯菌atcc 700603，頭孢他啶加克拉維酸大于等于 5毫米 ，頭孢噻肟加克拉維酸大于等于 3毫米 。表型確認試驗。瓊脂稀釋法：使用頭孢他啶 mic 范圍在0.25到128每毫升微克、頭孢他啶加克拉維酸范圍在0.25到4，128到4每毫升微克、頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸進行mic測試，當與克拉維酸聯合用藥，mic小于或等于單獨用藥藥物mic 3個倍比稀釋度，也就是8倍濃度，可確認該菌株產esbl。稀釋法質控，esbl陰性質控，大腸埃希菌atcc25922；esbl陽性質控，肺炎克雷伯菌atcc700603。頭孢菌素酶檢測，對于頭孢菌素酶，clsi酶目前還沒有可供推薦的方法進行檢測，也沒有相應的判斷標準。目前用于頭孢菌素酶定性的檢測方法很多，主要有以下幾種。一，單紙片擴散法；二，雙紙片協同法；三，雙紙片增效試驗；四，三維試驗法。碳青霉烯酶的測定。碳青霉烯酶定義，指所有能水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類 內酰胺酶，分別屬于ambler分類a類、b類、d類酶， 包括kpc 內酰胺酶和金屬酶。 cl si目前還沒有可提供推薦用于臨床實驗室檢測金屬酶的方法，但是2009年的clsi m100-s19文件中增加了對kpc 內酰胺酶的檢測方法，即改良的三維方法，即改良的測序試驗。kpc酶檢測。2001年首次報道從肺炎克雷伯中分離到kpc-1，它屬于bush分類法中的類 2f 組，ambler分子分類中的屬于a類,克拉維酸對其活性有抑制作用。kpc 內酰胺酶目前已有10種亞型，包括kpc-1至kpc-10，他們之間只有個別氨基酸發生了突變。在多個菌屬中都有報道。主要為質粒介導，但在陰溝腸桿菌中可由染色體介導。國外報道， 產kpc 內酰胺酶菌株即可表現為對碳氫霉烯類抗生素耐藥，也可表現為中介或敏感，并存在接種效應，這就增加了對其識別的難度。用于kpc酶定性的檢測方法主要有以下幾種：一，3-氨基苯硼酸雙紙片協同及增效試驗；二，改良三維試驗法；三，分子生物學方法。紙片篩選法，選用厄他培南、美羅培南，亞胺培南不作為碳青霉烯酶篩選用藥物。一，3-氨基苯硼酸雙紙片協同及增效試驗。方法，將0.5麥氏單位的濃度待檢菌液涂抹于mh瓊脂平板上，瓊脂稍干后，把含每片600微克的3-氨基苯硼酸紙片貼于mh平板中間，于紙片周圍分別貼上含厄他培南和美羅培南紙片，紙片中心距離為 20毫米 ，置35加減2度， 大氣環境孵育16到18小時，有協同現象出現為mbl陽性。改良的hodge試驗。改良 hodge 試驗是碳青霉烯酶表型檢測方法，用于檢測kpc的敏感性以及特異性均大于9