河南農業大學2 0 1 0 屆碩上研究生學位論文 摘要 自2 0 世紀初，小鼠的遺傳學研究從寵物農場進入哈佛大學的實驗室只有短短一百年的歷 史；但是，由于小鼠基因組與人類基因組高度同源、小鼠基因組改造手段非常成熟以及小鼠 近交系、突變系和工具小鼠品系種類繁多，小鼠遺傳學已成為發育生物學、功能基因組學和 疾病機理研究的核心研究領域，小鼠也成為最重要的模式生物之一。 d d k 近交系小鼠，是日本學者從一種屬于m m d o m e s t i c u s 亞種起源的德國小鼠培育而 成，其表現出一種被稱為“d d k 綜合癥”( d d ks y n d r o m e ) f f j 奇特繁殖現象：如同品系內交配 一樣，d d k 雄鼠能夠使其它近交系雌鼠正常受孕。但是，當d d k 雌鼠與同亞種內其它近 交系雄鼠交配時，f l 受精卵在妊娠3 5 日因胚泡形成障礙而死亡，使得d d k 雌鼠幾乎不孕。 后經研究證明這種極性不育的特性是由d d k 卵子細胞質物質和其它品系精子因子之間存在 不親和性引起的，它們二者均受到位于小鼠第l i 條染色體上的卵子突變( o v u mm u t a n t 或o m ) 位點的一對等位基岡所控制。 近年來，趙衛東等發現b 6 遺傳背景中存在著卵子突變基因的修飾基因，這些修飾基因使 o m 位點雜合型的雌鼠胚胎死亡率隨著其b 6 背景基因頻率的增加而升高。同時，也有學者采 用不同的方法和手段先后發現和報道了o m 修飾基岡的存在，但在修飾基因的數目多少和表 達方式上，存在著不同的認識。 本實驗旨在探明b 6 小鼠品系中存在的o m 基岡修飾基因的數目及其在染色體上的位置， 從而為研究修飾基因的作用機理打下基礎。在趙衛東前期收集1 6 4 個樣本的基礎上，通過三 年來的努力，順利獲得1 2 5 個樣本的表型數據，并完成其中8 6 個樣本的全基因組掃描工作。 運用w i n q t l c a r t 軟件對8 6 個樣本數據進行復合區間作圖分析，發現在第4 條染色體上可能 存在胚胎著床數的q t l ，其l o d 值為3 0 ：另外，在第l 、9 、1 4 和1 7 條染色體上也可能 存在q t l s ，它們的l o d 值均達到1 5 以上，此結果與趙衛東的定位結果基本吻合。 本實驗還揭示了小鼠胚泡形成過程中多基因調控的事實，初步了解和認識到卵子突變基 因的影響作用及作用規律，為以后開展卵子突變基因的修飾基因( o m m f ) 的功能表達研究 提供了必要的準各。 關鍵詞：小鼠卵子突變基因d d k 綜合癥修飾基因q t l s 河南農業人學2 0 1 0 屆碩士研究生學位論文 l o c a t i n g o fo v u mm u t a n tm o d i f l e rg e n e ( o m m f ) b yq t l si nm i c e s u p e r v i s o r ：p r o f z h a ow e i d o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：h u ax i n x i n a b s t r a c tt h eh i s t o r yo fm o u s e g e n e t i c ss t a r t e dw h e nm i c es t r a i n sw e r e i m p o r t e df r o mp e tf a r mt oc a s t l e sl a b o r a t o r yi nh a r v a r du n i v e r s i t ya b o u to n e h u n d r e dy e a r sa g o m o u s eg e n o m ei sh i g h l yh o m o l o g o u st oh u m a na n dc a l lb e m o d i f i e db yv a r i o u sa p p r o a c h e s m o r e o v e r ，t h o u s a n d so fi n b r e ds t r a i n s ，m u t a n ts t r a i n s a n di m p l e m e n t a ls t r a i n sh a v eb e e nd e v e l o p e d t h e r e f o r e ，m o u s eh a sb e c o m et h ek e y m o d e la n i m a lf o rt h er e s e a r c ho fd e v e l o p m e n tb i o l o g y ，f u n c t i o n a lg e n o m i c sa n d d i s e a s em e c h a n i s m t h ei n b r e ds t r a i no fd d km i c ew e r eb r e e d e db yj a p a n e s ef r o mak i n do fg e r m a n i c m i c ew h i c ha t t r i b u t et h em 歷d o m e s t i c u ss u b s p e c i f i c a n di ts h o w sa u n i q u ep r o p e r t y k n o w na s “d d ks y n d r o m e ：t h ed d km a l e sc a l ln o r m a l l yf e r t i l i z et h ef e m a l e so f o t h e rs t r a i n sl i k ei nt h es a m es t r a i n ，w h i l et h ef e m a l e so fd d ks t r a i na r en e a r l y i n f e r t i l ew h e nc r o s s e dt om a l e so fo t h e rs t r a i n s ，o w i n gt ot h ef ie m b r y o sf a i l u r eo f b l a s t o c y s tf o r m a t i o nb e t w e e n3 - 5d a y sa f t e rp r e g n a n c y s t u d i e ss u p p o r t e dt h a tt h e p o l a ri n f e r t i l ec h a r a c t e r i s t i ci sc a u s e db ya l li n c o m p a t i b i l i t yb e t w e e nt h ec y t o p l a m i c m a t e r i a l si nd d k o o c y t ea n ds p e r mf a c t o r si no t h e rs t r a i n s ，t h e yw e r ea l lc o n t r o l l e db y a na l l e l eo fo ml o c u sw h i c hh a sb e e nm a p p e do r nm o u s ec h r o m o s o m e11 r e c e n t l yy e a r s ，p r o f e s s o rz h a of o u n dt h e r ew e r et h eo v l l l im u t a n tm o d i f i e r s ( o m m y ) i nb 6b a c k g r o u n d ，w h i c hm a d et h em o r t a l i t yo fe m b r y oa d v a n c e dw i t ht h ea l t e r a t i o n o ft h eg e n e t i cb a c k g r o u n d m e a n w h i l e ，t h e r ew e r es o m es c h o l a r sf o u n dt h em o d i f i e r s t h r o u g hd i f f e r e n tw a y sa n dm e t h o d s ，b u td i f f e r e n tc o n c l u s i o n sw e r ee x i s t e da b o u tt h e n u m b e ro ft h em o d i f i e ra n dt h ew a yi te x p r e s s e d i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w em a i n l yt of i n do u tt h en u m b e ro ft h eo v u mm u t a n t m o d i f i e r s ( o m m j ) ，i tw o u l db et h ef o u n d a t i o no fl a u n c h i n gt h ew a y so fm o d i f i e r s s t u d y a f t e r3y e a r s h a r dw o r k i n g ，w ea d dt h ea m o u n to fs a m p l e sa tt h eb a s i co f16 4 d a t aw h i c hp r o f e s s o rz h a oc o l l e c t e da n dh a v eo b t a i n e dt h ep h e n o t y p ed a t ao fa l lt h e 13 7s a m p l e s ，a n da c c o m p l i s h e dt h eg e n o m es c a n n i n go f8 9s a m p l e s a p p l y i n gt h e s o f t w a r eo fw i n q t l c a r ，w ea n a l y z e dt h e8 9s a m p l e sw i t hc o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n g i ti ss h o w e dt h a tt h e r em a y b ee x i s t e dt h eq t l so fi m p l a n t a t i o ni nt h ef o u r t h 河南農業大學2 0 1 0 屆碩j j 研究生學位論文 c h r o m o s o m ew i t ht h el o ds c o r eo f3 o ；i na d d i t i o n ，t h e r em a yb eq t l si nt h e f i r s t ，t h en i n t h ，t h ef o u r t e e n t ha n dt h es e v e n t e e n t hc h r o m o s o m ea n dt h e i rl o ds c o r e s a r ea l la b o v e1 5 t h er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t hp r o f e s s o rz h a o s b e s i d e s ，t h ep o l y g e n er e g u l a t i o ni nt h ep r o c e s so fm o u s e sb l a s t o c y s tf o r m a t i o ni s c o n f i r m e di nt h i se x p e r i m e n t w h i c hc a nh e l pt of i l a do u tt h ee f f e c ta n da c t i o nl a wo f m o u s e so v u mm u t a n t ，a n dm a k en e c e s s a r yp r e p a r a t i o n sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo f o m m f sf u n c t i o ne x p r e s s i n go fo v u mm u t a n t k e yw o r d s ：m o u s e ；o v u mm u t a n tg e n e ；d d ks y n d r o m e ；m o d i f i e rg e n e ；q t l s ； 3 7 致謝 感謝導師趙衛東老師三年來對我學習、研究和生活等方面給予的教導和關 心。在導師的悉心指導下，我順利的完成了碩士學位論文，在理論知識和科研能 力上都有了很大提高。導師進取的精神、創新的意識、執著的追求和嚴謹的工作 態度永遠是我學習的榜樣，高尚的人格魅力將永遠激勵著我前進。 感謝導師組鄭振宇、李春麗老師三年來對我學習、實驗以及生活等方面給予 的大力幫助和熱心照顧。感謝河南農業大學生命科學學院吳建宇副院長、邱立友 老師、王明道老師等在我研究生學習、論文開題及實驗中所提供的寶貴建議和指 導。 感謝河南農業大學動物遺傳工程實驗室的師兄弟武剛、張天星、郭杰、宋根 娣、雷建、柴保國、宋佳晟、周鑫、王棟、王善強，師姐妹徐雪麗、王婷婷、趙 炎蔥、韓露、黃仙仙、張晶在我們朝夕相處的日子里給予我的友愛和幫助。 感謝家人和朋友多年來對我的鼓勵和支持，再次感謝所有關心和幫助過我 的老師、同學、朋友和親人們。 華欣欣 2 0 1 0 年6 月 河南農業大學2 0 1 0 屆碩士研究生學位論文 1 文獻綜述 小鼠( m i c e ) ，學名：m u s m u s c u l u s ，俗名：鼷鼠。從動物分類學的角度講，它屬于動 物界( k i n g d o m ) 、脊椎動物f - l ( p h y l u m ) 、哺乳綱( c l a s s ) 、嚙齒( o r d e r ) 、鼠科( s e c t i o no rf a m i l y ) 、 小鼠屬( g e n u s ) 、小家鼠種( s p e c i e s ) l l 】。小鼠具有喜歡群居、體型較小、性情溫順、易 于飼養管理等生活習性，以及發育迅速、性成熟早、性周期短、繁殖力強等生殖特征，尤其 是它們還與人類同屬于哺乳類物種，因而被作為常用的實驗動物，應用于動物的生理學、解 剖學、遺傳學，以及醫學、獸醫學等領域的教學和科研之中1 2 d 1 。 由于小鼠基因組與人類基因組高度同源、小鼠基因組改造手段非常成熟以及小鼠近交 系、突變系和工具小鼠品系種類繁多，小鼠遺傳學已成為發育生物學、功能基因組學和疾病 機理研究的核心研究領域，小鼠也成為最重要的模式生物之一1 4 】。近年來，隨著小鼠基因組 序列測序的完成【5 1 ，不同小鼠近交系品系特異的微衛星標記或單核苷酸多態性不斷被發現 降引，小鼠生理生化表型分析手段和數據也越來越完善，這些前期工作導致了目前大規模的 基岡剔除計劃、基因突變計劃及構建和分析重組近交系計劃的實施。這些計劃可能構成未來 1 0 - - 2 0 年中生命科學和醫學研究領域最重要的內容之一。 1 1 小鼠的研究歷史及現狀 目前生物醫學研究領域通常所研究的是小家鼠( m u s c u l u s ) ，是一類和人類共居的小型嚙 齒動物，在地球上分布廣泛，種類繁多。小鼠作為實驗材料的最早記載是在1 6 6 4 年，r o b e r t h o o k e 在空中觀察了小鼠的反應，這也是小鼠做為科學研究的第一個報告。然后在1 9 0 0 年， 退休的中學教師a b b i el a t h r o p 在其位于馬薩諸塞州g 啪b y 的農場里開始飼養一種名為 “f a n c y ”的小鼠，最初這種小鼠作為一種寵物，后來它成了研究中的重要材料。直至1 j 1 9 0 2 年， 哈佛大學的c a s t l e 才在當時孟德爾遺傳學研究的影響下開始了小鼠遺傳學研究，并在其學生 的幫助下對小鼠的遺傳和基岡變化進行系統的分析【9 l 。1 9 0 8 年，w i l l i a mc a s t l e 開設t h a r v l o p b u s s e y 研究所，許多早期的小鼠遺傳學家都源于那里。后來為了更好的進行科學研究，人們 開始培育近交系小鼠。1 9 0 9 年c a s t l e 實驗室的l i t t l e 得到了第一個近交系小鼠d b a 品系 后，在c o l ds p r i n gh a r b o fl a b o r a t o r y 和t h ej a c k s o nl a b o r a t o r y l 作中陸續得到了c 5 7 b l 6 、 c 3 h 、c b a 和b a l b c 等多種近交系小鼠，這些近交系構成了目前世界上使用最廣泛的幾種 品系。在這一百年里人們已經建立了近4 0 0 個近交系1 1 0 1 。 近交系是指通過同窩交配保持2 0 代以上，且除自發性突變外，基本上保證全部基因位 點同種性的一種品系。它是在血緣關系極為相近的個體之間或遺傳組成相似的個體之間進行 交配繁殖。通過近交使一個種群達到接近完全純合，即所有同源染色體的相對位置都具有相 同基因的狀態。因此，通過同胞兄妹或親子交配可以較快獲得近交系動物。近交可以降低雜 合性，并將群體分離為不同的品系。近交系繁殖是小鼠遺傳學研究史中的重要階段之一，它 徹底改變了發育生物學、癌癥研究、組織移植以及免疫學等多領域的研究狀況。使用近交系 小鼠的主要優點有【l u ：1 具有相同的基因型，表現型也一致，所以其反應是一致的，實驗 2 河南農業大學2 0 1 0 屆碩七研究生學位論文 結果上e 確、可靠。由于連續近交繁殖，同一近交系的各個體具有相同的基因型，在相同的環 境條件下又具有相同的表現型，故其性狀即其各種生物學特性比較一致，對外來刺激反應也 一致。2 各品系均有其獨特的特性，根據實驗目的可選用不同品系來作實驗，實驗重復性 好，所用動物少，實驗周期短，節省人力、物力和時間。3 國際上分布廣泛，不同國家的 科研單位由于使用同一近交系動物所得結果是相似的，便于國內和國際問學術交流和實驗重 復。4 可以作為有價值的病理學模型，如有致癌品系、抗癌品系、致白血病品系，嗜酒性 品系、易抽搐品系等，是研究人類疾病的重要實驗材料。5 它是標準的實驗材料，動物生 長發育到一定時間就有一定的規格。6 有大量的歷史資料可查，每個品系均有其詳細的遺 傳學資料，遺傳背景明確，其生物學特性、生理生化特點、常見疾病( 包括自發性疾病) 等 都有過系統的研究，便于研究者查閱和選擇應用。因此，近交系小鼠倍受遺傳學、醫學、獸 醫學等領域科研工作者的青睞。 小鼠作為模式生物相對于其他物種有自身優勢。首先，從進化的角度上看小鼠作為哺乳 動物的代表有其不可動搖的地位。除了小鼠以外的四種模式動物至少在2 7 億年前就在進化 上與人類走到了不同的分支，而小鼠在6 千萬年前還和人類共同擁有一個祖先。在2 0 0 2 年 小鼠基因組的測序工作初步完成時，研究者們分析了9 6 小鼠基因組序列。在這其中有9 9 的基岡能在人的基因組序列中找到同源序列，證實了小鼠與人類在基因水平上的高度同源。 同樣，小鼠的生理生化指標及其調控機制和人類相同或相似，因此小鼠的研究成果就可以推 演到人類，所以對小鼠進行研究有很大的應用價值。其次，和狗、猴等大型哺乳動物相比， 小鼠的繁殖能力強，生殖周期短。通常實驗用的近交系小鼠一胎生育5 1 0 只幼鼠，而遠交 群的小鼠的生殖能力更強。這些幼鼠在6 - - - 8 周之后就能達到性成熟的狀態，開始繁殖下一 代。同時小鼠沒有親子相殘的習性，這樣生產后的雌鼠和幼鼠仍可以和雄鼠同籠。這樣不但 確保了幼鼠的成活率，同時也能提高交配的頻率，確保了繁殖的高效率。小鼠飼養也相對簡 單，由于小鼠體積小( 通常成年鼠的體重在2 0 - - 4 0 9 之間) ，所以可以在有限的空間內進行大 規模飼養，因而十分利于進行大規模的實驗。再次，小鼠交配時會形成陰栓，這有助于判斷 交配的時間，對研究中判斷不同發育階段十分重要。因為其他動物的受精時間通常要通過觀 察交配行為來確定，而小鼠的這種特性就使研究人員不必時刻注意實驗動物的行為，為工作 提供了便利。小鼠的大多數品系比較溫順，容易抓取和進行實驗操作。最后，由于小鼠的這 些特點使其在世界范圍內廣泛使用，而且形成了各種實驗用近交系，使用有基本一致遺傳背 景的近交系小鼠所做出的實驗結果容易在不同的實驗室重復，這就使實驗結果更容易被接 受。這也是小鼠作為模式生物的主要優勢之一。 小鼠的分子生物學研究進展為揭秘小鼠全部生命遺傳奧秘提供了可能。由于不同的小鼠 近交系在生長、發育、代謝、行為等指標上存在著明顯的差異，因此，通過這些近交系基因 組的多態性連鎖分析，可以建立特定功能表型在基因組上的定位，發現和確定表型與基因型 之間的關系。從最早的簡單分析不同近交系的分子多態性，進而采用微衛星標記，最新發展 3 河南農業大學2 0 10 屆碩士研究生學位論文 到單核苷酸多態性，使在基因組中將一個表達特定功能或表型的基因定位到l k b 將不再是夢 想【l 玉1 4 】。近年來，在基因組計劃完成的基礎上，通過化學誘變、d n a “基因陷阱”或轉座 子轉座作用建立新的突變小鼠品系成為一種時尚，這種以新突變品系的病理表型為出發點， 然后通過突變的染色體定位，最終克隆突變基岡的方法已經大大推動了疾病模型的研究，并 在短期內提供了大量的新的小鼠品系i ”d 7 l 。經典的小鼠遺傳學家也找到了新的思路，他們正 在建立上百種通過現有近交系雜交而形成的新的重組近交系t 1 8 1 。通過對這些新的近交系與 母本近交系在生理生化表型和基因型的連鎖比較，我們有望對一些復雜性狀( 如代謝過程) 的 調控作深入的遺傳學分析，從而發現復雜疾病( 包括糖尿病、肥胖癥、高血壓、免疫失調、 及神經性疾病等) 的發病機理機制。從2 0 0 5 年起，大規模開展基因剔除的研究計劃分別在美 國、歐盟和加拿大實施，第一期總投資達l 億多美元。該計劃的最終目標是要將小鼠的3 萬多 個基因逐一進行基因剔除，建立基因剔除小鼠品系，從而分析基因的功能i 悖l 。可以預見， 小鼠的突變品系，將在不遠的將來達- 至l j 4 5 萬個品系。 1 2d d k 小鼠的研究歷史及現狀 d d k 近交系小鼠，是日本學者從一種屬于m 研d o m e s t i c u s 亞種起源的德國小鼠培育而 成1 2 0 】，其攜帶有卵子突變基因( o v u mm u t a n t 或o m ) ，并表現出一種被稱為“d d k 綜合癥”( d d k s y n d r o m e ) 的奇特繁殖現象：如同品系內交配一樣，d d k 雄鼠能夠使其它近交系雌鼠正常受 孕。但是，當d d k 雌鼠與其它近交系雄鼠交配時，f l 受精卵在妊娠3 5 日岡胚泡形成障礙而 死亡，使得d d k 雌鼠幾乎不孕【2 1 2 3 1 。 有關“d d k 綜合癥”及o m 基因的研究，國外主要集中在3 個國家：美國、法國和日本【2 啦6 1 。 美國小組的研究方向主要是o m 位點的基岡傳遞率扭曲和鋤基因在小鼠克隆胚胎中的表達 等方面【2 7 。2 9 j ；法國小組的研究集中在對o m 基因堿基序列的解析方面1 3 0 , 3 1 】；日本研究小組則 主要集中于d d k 綜合癥的組織胚胎學和o m 修飾基因的研究 3 2 , 2 5 1 ；國內除河南農業大學趙衛 東研究小組外，尚未見相關研究報道。趙衛東曾在日本參與相關研究，回國后主要致力于 o m 修飾基岡和精卵親和性研究1 3 3 - 3 5 l 。 1 2 1o m 基因的發現 1 9 6 0 年，日本學者t o m i t a j l 匝過d d k 品系與k k 品系的正反交實驗發現：當d d k 品系雌鼠 與k k 品系雄鼠交配時，平均胎仔數為2 24 - 0 5 ，但是當k k 品系雌鼠與d d k 品系雄鼠交配時， 平均胎仔數為6 74 - 0 8 。同時，他在d d k 品系與k s a 品系的交配實驗中也發現了類似的情況 【2 們。1 9 9 0 年，b a b i n e t 等以d d k 品系和b a l b c 品系作為實驗動物，得到了與t o m i t a l 9 6 0 年研 究相類似的結果，并把這種奇特的繁殖現象命名為“d d k 綜合癥”p 6 1 。1 9 6 7 年，w a k a s u g i 在 t o m i t a l 9 6 0 年研究的基礎上，采用d d k 品系、k k 品系與n c 品系作為實驗動物，通過采集 d d k 早x k k 3 和d d k 2 n c 3 不同時期的受精卵，研究發現2 細胞期、4 細胞期、8 細胞期與 桑葚胚胚胎發育正常，但當胚胎發育從桑葚胚到胚泡的過程中( 妊娠3 5 日) ，胚泡形成障 礙，胚胎因不能著床而死亡1 2 。七十年代，基于交配實驗結果的遺傳分析，w a k a s u g i 提出 4 河南農業大學2 0 1 0 局頂一七研究生學位論文 了解釋這一現象的遺傳假謝”j ，其要點如圖1 所示i ”】： ( 1 ) ( d d k 早x 其它品系d ) fz 代胚 胎死亡的原因，是由于卵子細胞質因子( c y t o p l a s m i cf a c t o ro f e g g s ) 與精子岡子( s p e r mf a c t o r ) 的不親和性造成的，而這些不親和性因子的產生均受到位于染色體同一位點上的一對等位基 岡控制；( 2 ) d d k 占i ! n 系染色體上存在的是卵子突變基因( 鋤) ，它分別控制著0 卵子細胞 質因子和s 精子因子的合成：而其它品系的相同位點上存在的是正?；颉? ”，它分別控 制著“o ”卵子細胞質岡子和“s ”精子因子的合成；( 3 ) 在這些因子形成的四種組合中，只有 當帶有“o ”的卵子和帶有“s ”的精子相遇( o s ) 時，才形成卵子細胞質岡子與精子因子的不 親和型，導致胚胎正常發育受阻并最終死亡；而其余三種組合( o s 、o s 、o s ) ，則 全部為親和型，從而使胚胎能夠正常發育并最終產仔。后來，這一假說得到了卵子細胞質移 植和受精卵原核移植實驗的證明1 36 1 ，d d k f i ；j 子細胞質岡子作為一種r n a 分子的存在也已被 確認( 改稱為卵子細胞質物質) p8 1 。 c o m p a t i b l ec o m p a t i b l ei n c o m p a t i b l ec o m p a t i b l e a l i e ne 9 8 ( o ) a n d d d ks p e r m ( s ) a l i e n e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d k e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d ke g g ( o ) a n d d d k s p e r m ( s ) 圖i小鼠1l 號染色體上卵子突變基因控制的卵子細胞質物質與精子因子相互作用 注：實驗室大多數小鼠的正常卵子突變位點產生的卵子細胞質物質和精子因子分別表示為“0 s ”，d d k 小鼠卵子突變位點產生的卵子細胞質物質和精子因子分別表示為“o ”“s ”，在卵子細胞質物質與精子因子 的組合中，只有在“o ”和“s ”的組合中是不親和的，其它三種組合( o s ，o s 手l l o s ) 均為親和的。 f i g i i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y t o p l a s m i cf a c t o r so fe g g sa n ds p e r mf a c t o r sc o n t r o l l e db yt h ea l l e l e sa to v u m m u t a n tc o r n ) l o c u so nm o u s ec h r1i n o t e ：t h en o r m a la l l e l ea tt h eo ml o c u sp o s s e s s e db yt h em a j o r i t yo fl a b o r a t o r ym o u s es t r a i n sp r o d u c e sa c y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) i nt h eo o c y t ea n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ea l l e l eo fd d k s t r a i nm a k e sac y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ec y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n dt h es p e r mf a c t o r ( s ) i s i n c o m p a t i b l e ，a n do t h e rt h r e ec o m b i n a t i o n s ( o - s ，o - sa n do s ) a r ec o m p a t i b l e 1 2 2o m 基因的定位 九十年代，許多學者分別通過微衛星分子標記等方法，對o m 基因定位展開了研究：1 9 9 2 年，b a l d a c c i 等采用d d k 品系3 1 1 b a l b c 品系作為實驗動物，將o m 基因定位在第1 1 條染色體 上，且與酒p 位點緊密連鎖；1 9 9 2 年，s a p i e n z 等采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作為實驗 動物，將o m 基因定位在第1 l 條染色體上接近) c m v 4 2 位點的位置【4 0 】：1 9 9 6 年，b a l d a c c i 等采 河南農業大學2 0 1 0 屆碩士研究生學位論文 用d d k 品系和b a l b c 品系作為實驗動物，將o m 基因定位在第1 1 條染色體上引物s e y a 2 和 d l l m i t 3 6 之間2 c m 的位置【4 l l ：1 9 9 6 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系 作為實驗動物，將o m 基因定位在第l l 條染色體_ l d l l m i t 3 8 和d 1 1 m i t 6 6 芝l 剮4 2 1 ；1 9 9 7 年， p a r d o m a n u e ld ev i l l e n a 采：用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作為實驗動物，將o m 基因定位在第1 l 條染色體上接近瑚，位點的位置 4 3 1 ；2 0 0 0 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和 c 5 7 b l 6 品系作為實驗動物，將o m 基因定位在第ll 條染色體j _ d l l m i t 3 5 4 和d j n 衙配之間大 約4 7 c m 的位置l ( 圖2 ) ，從此，“d d k 綜合癥”也已作為研究小鼠早期胚胎發育中雙親基 因型與卵子細胞質相互作用機理的很好模式而被應用。 7 10c mi l 陋1 7 l l m i t 2 0 1 m i t 6 7 i m 誣6 l j m i l l 6 8 圖2 第l l 條染色體上o m 位點的連鎖圖 f i g 2 m e i o t i cm a po f t h eo mr e g i o no nm o u $ ec h r o m o s o m e ，j 1 2 3o m 基因的其他相關研究 d d k 綜合癥的胚胎死亡發生在8 細胞到1 6 細胞期的過渡期，細胞學觀察發現，這個時 期的胚胎自發的發生了去聚縮化，胚胎細胞因無法正常形成內細胞團和滋養外胚層而死亡， m i a b u e h r 等在細胞培養實驗中發現，用甲胺處理培養基提高細胞內p h 值可以明顯提高 d d k c 3 h 型胚胎在1 6 細胞期的存活率，但是一旦去聚縮化發生，這種處理已經沒有效果。 6 硒強 一一一|萋 巧 綰腮巧o i 室 腳嬲刪枷 ， d d d d d d d d d d 河南農業大學2 0 1 0 屆碩上研究生學位論文 用間隙連接抗體處理胚胎細胞d d k d d k 型合子細胞和d d k c 3 h 型胚胎，一樣發生了凋亡 1 4 列。據此推測，d d k 綜合癥影響了細胞的間隙連接，造成細胞間通訊或物質交流異常，導 致胚胎發育阻斷。最新研究證實，f l ( d d k 早b 6 古) 的胚胎在發育中和細胞內有機酸和羧 酸代謝相關的基因與對照組胚胎表達量相比顯著升耐4 6 1 ，這便可以解釋f l ( d d k 早x b 6 8 ) 胚胎在發育過程中細胞p h 值偏低以及細胞間隙連接弱化的現象：這些基因的高表達導致細 胞內p h 值下降，而細胞間p h 的下降正是導致間隙連接滲透率下降的主要原因1 4 卯。 o m 基因已經精細定位在小鼠第l l 號染色體上遠端4 7 e m 處大約2 c m 的范圍內， c o h e n t a n n o u d j i 4 7 1 以及s t e 7 p h a n i el eb r a s 等使用外顯子捕獲等技術篩選了若干候選基因 【4 3 l ，這為o m 基因的圖位克隆或定位候選克隆提供了重要依據。r e n a r d 等發現所謂的卵子 細胞質物質是以r n a 分子的形式存在的1 3 引，并且通過二維變性聚丙烯酰胺蛋白電泳，c h a r l e s b a b i n e t 等在d d k 胚胎中發現并分離到了一個特異表達的蛋白d 1 4 ，這種蛋白在胚胎發育的 一細胞期( 生發泡破裂后幾個小時) 開始合成，在2 細胞期的合成停止，繼而穩定存在到8 細 胞期，這種蛋白合成的停止與合子基因組的活動并無直接的關系，并且在其它供試的7 種純 系小鼠中未檢測到d 1 4 的表達。但r i c h o u x l 4 4 1 等人在w m p ( d o m e s t i c s ) 、m b t 、m a i 和p w k 這幾種小鼠的胚胎發育過程中發現有特異蛋白的合成，其中w m p 的特異蛋白為d 1 4 ，在 p w k 中檢出的蛋白和d 1 4 極為相似，并且細胞學定位發現，d 1 4 在小鼠早期胚胎的胞質和 細胞核內均有表達，對在合子基因轉錄激活前的蛋白質功能的研究將有助于揭示母源岡子對 合子發育的影響【4 9 1 。 1 3 基因定位方法 基因定位( g e n el o c a t i o n ) 是用一定的方法將基因確定到染色體的實際位置。這是現代 遺傳學的重要研究內容之一。將不同的基岡確定于染色體的具體位置之后，即可繪制出基因 圖( g e n em a p ) ?；蚨ㄎ豢蓮募蚁捣治?、細胞、染色體和分子水平進行研究，同時由于使 用手段的不同派生出多種方法，不同方法又可聯合使用，互為補充?，F僅就幾個主要方法加 以說明。 1 3 1 體細胞雜交法 體細胞是生物體除生殖細胞外的所有細胞，將從身體分離的體細胞做組織培養進行遺傳 學研究的學科稱為體細胞遺傳學( s o m a t i cg e n e t i c s ) 。體外培養細胞可人為控制或改變環境 條件，并可建立細胞株，長期保存，進行各種正常和病理研究。與基因定位有關的是體細胞 雜交( s o m a t i cc e l lh y b r i d i z a t i o n ) 。細胞雜交又稱細胞融合( c e l lf u s i o n ) ，是將來源不同的 兩種細胞融合成一個新細胞。大多數體細胞雜交是用人的細胞與小鼠、大鼠或倉鼠的體細胞 ( h y b r i dc e l l ) 進行雜交。這種新產生的融合細胞稱為雜種細胞( h y b r i dc e l l ) ，含有雙親不同 的染色體。雜種細胞有一個重要的特點是在其繁殖傳代過程中出現保留嚙齒類一方染色體而 人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明。這種僅保留少數甚至一條 人染色體的雜種細胞正是進行基因連鎖分析和基因定位的有用材料。 7 河南農業大學2 0 1 0 屆碩 ：研究生學位論文 1 3 2 克隆嵌板法 克隆嵌板法( c l o n ep a n e lm e t h o d ) 是應用雜種細胞保留或丟失人染色體有時有重疊現象 而設計的一種簡便有用的基因定位方法。如表l 所示，選擇3 個都保留有4 條人染色體的雜 種細胞克隆，但染色體各不相同。如果某一表型特征只出現于克隆a 、c 而不見于b ，就可 決定該特征的基因只能在3 號染色體上，因為a 、c 克隆都有3 號染色體，而b 克隆則無， 其它亦可同理判斷。這樣3 個克隆可對8 條( 2 3 = 8 ) 染色體作出判斷：如果是5 個克隆( 2 5 = 3 2 ) 就可對人類2 2 條常染色體和2 條性染色體作出判斷。例如半乳糖激酶( g k ) 、尿苷磷酸 激酶( u m k ) 和氨基已糖菅酶a ( h e x a ) 的基因就是用此法分別定位于人的1 7 號、1 號 和1 5 號染色體上的。此外，還可對雜種細胞進行特殊染色，來識別雜種細胞中人和鼠染色 體，以助基岡定位。 表l 克隆嵌板法示意 t a b l e1t h ec l o n ep a n e lm e t h o d 1 3 3 原位雜交和熒光原位雜交 原位雜交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是分子雜交技術在基因定位中的應用，也是一種直接 進行基因定位的方法。其基本原理是堿基的互補配對，同源的d n a d n a 雙鏈或d n a r n a 鏈在一定條件下能結合成雙鏈，用放射性或非放射性物質標記的d n a 或r n a 分子作為探 針，可探測到細胞基因組中的同源部分。原位雜交的特點是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色 體標本上進行。所謂原位即指標本上d n a 原位變性，在利用放射性或非放射性標記的已知 核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異d n a 或r n a 順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區帶出現的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位 置，從而進行準確的基岡定位。但原位雜交必須在已知探針的情況下方可進行，而在未知致 病基因時，則無法進行基因定位。放射性同位素標記核酸探針與染色體顯帶結合進行原位雜 交仍有不少缺點和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實驗室，自顯影曝光時間長， 同位素標記的探針不易保存，放射污染不利健康，特別是高質量的中期染色體標本在細胞培 養基礎上難以得到，觀察費時，對間期核的研究難以進行等。 熒光原位雜交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是一種非放射性原位雜交方 法。用特殊熒光素標記核酸( d n a ) 探針，可在染色體、細胞和組織切片標本上進行d n a 雜交，對檢測細胞內d n a 或r n a 的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是 將熒光染料與抗體蛋白結合進行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的 8 河南農業大學2 0 1 0 屆碩十研究生學位論文 分辯率。現已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多 色f i s h 技術近年來發展迅速，已成為基因定位作圖和醫學診斷的重要手段。 1 3 4 連鎖分析 基因定位的連鎖分析是根據基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的 原理，即應用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。生 殖細胞在減數分裂時發生交換，一對同源染色體上存在著兩個相鄰的基因座位，距離較遠， 發生交換的機會較多，則出現基因重組；若兩者較近，則重組機會較少。重組d n a 和分子 克隆技術的出現，發現了許多遺傳標記位點，利用某個擬定位的基因是否與某個遺傳存在連 鎖關系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體的一定部位，使經典連鎖方法獲得 新的廣闊用途，成為人類基因定位的重要手段。 從分子水平進行基因定位，還有不少有效的新技術，它們相互配合使用，使基因定位得 到迅速發展。例如，利用染色體自身結構及染色體畸變法進行缺失作圖和基因劑量法等?？?之，人們已不只是用單一技術進行基因定位，而是將細胞、染色體和分子水平技術結合起來， 綜合分析，互相印證，以達到快速、準確基因定位的目的。 1 4 分子標記技術 1 4 1 分子標記的概念 分子標記是以個體間遺傳物質內核營酸序列變異為基礎的遺傳標記，是d n a 水平遺傳 多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相 比，d n a 分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分 便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量兒乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同 組織的d n a 都可用于標記分析；分子標記揭示來自d n a 的變異；表現為中性，不影響目 標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，現 在d n a 分子標記技術已有數十種，