北京化工大學碩士學位論文 水華束絲藻碳氮代謝的特征及相互作用 摘要 藍綱菌通過光合作用利用太陽能固定無機碳并釋放出氧氣 是地 球上氧 碳 氮 氫等元素循環的主要參與者 又是有機物的初級生 產者 由于藍細菌細胞結構簡單 主要營養代謝方式與真核生物和高 等植物相似 尤其某些藍細菌具有特殊的固氮能力和方式 因此 采 用藍細菌作為細胞代謝研究模式 可以必生物學基礎研究提供平臺 也為微藻生物技術的發展奠定了基礎 本論文采用水華束絲藻9 4 3 作為研究對象 測定了一系列生理 生化指標及代謝關鍵酶的變化 在細胞水平上考察不同影響因子的作 用和效栗 研究了不同無機碳源對藍細菌細胞的生長 分化和衰亡的 作用 以及對生長過程中氮源圊化作用的影響 并結合文獻報道對可 能熊調控方式進行了探討 t 實驗首先對水華束絲藻9 4 3 進行搖瓶培養 確定其生長條件尊結 果發現 水華束絲藻在溫度為2 1 2 2 起始p h 值為6 3 7 以及 0 4 u 隨瑟的通氣量下有較好的生長 培養基中適合的無機碳源和氮源 比例有利予藍藻細胞維持碳氮代謝聞平衡 單獨提高氮源 n 3 讖 或碳源 c 0 2 都會影響藻細胞的生長 在實驗條件下 銨根離子可徹 底抑制水華束絲藻9 4 3 生長 培養基中的無機氮源對水華束絲藻的異形胞分化有一定抑制作 用 但通入c 0 2 可以誘導水華束絲藻細胞分化產生異形胞 異形胞的 北京化工大學碩士學位論文 分化頻率在一定時間內與c 0 2 的通入量有對應關系 表現為隨著c 0 2 通入量的增加而增加 當n a h c 0 3 為無機碳源時 異形胞的分化頻率 幾乎沒有變化 c 0 2 濃度的增加導致細胞內碳氮比例失衡后 藻細胞 沒有增加吸收培養基中的結合態氮源 而是產生異形胞固氮 說明藻 細胞的氮代謝存在多層次多途徑的代謝調控 為進一步考查碳氮代謝關系 實驗過程中測定了硝酸還原酶及 6 磷酸葡萄糖脫氫酶活性 結果顯示 當c 0 2 含量增加時 硝酸還原 酶活性有所下降 證明c 0 2 抑制藻細胞對n 0 3 的吸收利用 測定碳 氮中間代謝產物2 酮戊二酸在細胞中的積累發現 2 酮戊二酸的含量 與異形胞的發生頻率有一定對應關系 在異形胞發生頻率較高的培養 液中 2 酮戊二酸的含量相應增高 在上述結論的基礎上 考察了不同無機碳對其他經濟藻種生長的 影響 改變培養基中無機碳源含量 測定三角褐指藻和小球藻的生長 曲線 硝酸根吸收速率以及碳氮比等參數 三角褐指藻和小球藻分別 在1 和3 c 0 2 含量下達到最高生長速率 測定細胞中總糖 總蛋白 的積累以及碳氮比 發現細胞中總糖含量和碳氮比隨著c 0 2 通入濃度 的增加有一定增加 可能是由于c 0 2 濃度升高后對細胞光合作用有一 定的促進作用 細胞中總糖含量升高 總蛋白積累量變化不明顯 關鍵詞 水華束絲藻 異形胞 二氧化碳 硝酸還原酶 2 酮戊二酸 i i 北京化工大學碩士學位論文 c h a r a c t e r i s t i c sa n dr e g u l a t i o 玨o fc a r b o na n i d ln i t r o 譬e 建 m e t a b o l i s mi 玨么矽蟊露囂l 知搬移攆穢籜 勛s 躇露鼯露矽 a b s t r a c 量 q 舊n o b a c t e r i a ap h y l u mo fb a c t e r i am a to b t a i nm e i re n e r g yt h r o u g h p h o t 0 8 y i l m e s i s i sam a i nc o n t r i b u t o ro ft h e9 1 0 b a lp r i 賊呵p r o d u c 既a s m em a i nn u t r i t i o n a la n dm e t a b 0 1 i cm o d e l si nc y a l l o b a c t e r i aa r es i l n i i a rt o p h o t o s y n t h e t i ce u k a 噦o t ea i l dh i 曲e rp l a l l t s c y a n o b a c t e r i ai sag o o d m e t a b 0 1 i s mr e s e a r c hm o d e lf o rb i o l o g ys t u d y 面 1t h i sw o r k 卻五口以揚d 珂e 療d 萬伽一口口甜掰p9 4 3w a sc h o s e na sr e s e a r c h m a t e r i a l 和磊口胛瑟d 玎z e 忍d 聆 泌一口g 群口8 i sa 矗l a l n e n t o u sc y a n o b a c t e u l 髓 c a p a b l eo fb o t hp h o t o s y n t h e s i sa n dd i 缸拍g e n 蠡x a t i o n 磁l d e fa e b i e c 強d i t i 鋤s as e 蠢e so fp h y s i o l o g i e a l b i c h e 武e 蕊蠲d糙e t 兩文i e i n d 主c a t o f sw e f es 埡d 主e d c h 鑫r a c t e 矗s 專主e s 黼d 羚g 毪l 撕 穩糯1 e so fe 拍 穩 搬e t a b l i s m 鋤do 也o f 纛i 鼬g e 建鑫s s i 瓶l 毹i o np 燦a y w e 忿i n v e s t i g 越e di 建 t h e 吡o l ee e l ll e v e l t h e 印t 主觀me o n d i t i 濰是r 也e 伊o w mo f 卻辦理殘切瓏繃d 擺歹凇一a 鳥攔以8 w a ss 拋d i e di nb gllm e d i u m b ye x a m i n i n ge 恐c t so ft e m p e r a t u r e i n i t i a l p hv a l u e m t m g e ns o u r c e s 矩da i rf l o wd u r i n gt h ec u l t i v a t i o n 1 k s u l t s i 王i 北京化正大學碩士學位論文 s h o w e dt h a tf i t t e s tc i r c u l 粥t a n c e sf o r 和?？阱鰖 z d 班翻d 力夕瓠一口g 越翻呈鄹 w m w a s t e i n p e r a 衄eo f2 1 2 2 t h ei i l i t i a lp hv a l u eo f6 3 7 o 4 l m i na i r n o w i m p r 0 v e dn i 仃0 9 e n n 0 3 一n 0 rc a r b o n c 0 2 r e s o u r c e sp r o m 1 d t e d t h eg f o 姒ho fa l g a ee e l l s 始l y 豫d 篚也eb 越黼c eo fi n 曙a n i ce 積 弧a n d n i 的g e ne l e 黼n t s d e rt h ee x p e r 至芏蕊n t a 圭e o 鬏d i t i o n s m e 舔g 奎c e l l se a n n o tu s e 黜o n i u mn i 昀g e ni nm em e d i 啪d i r e c t l y a n dh e t e r o c y s to f 卻辦以 z 丘刀 靠 艦d 弼 刀缸一口g a ec e n sc u l t u r e di nb g 11w i ma m l n o n i u mc a n n o tb eo b s e r v e d i tm e a n st h a ta i m l o n i u mi o nc a i li 曲i b i tt h e 伊o w mo f 卻磊露囂z z d 7 籜掰l p 露 7 轟粥 露垡掰口ge o l l 攀1 e t e l y 址 磚髏協s 拋d ym ee f 斃c t o fm o 略張i ee 拍舳 o 魏k t e e t d e v e l o p m e n t a i rw i t hd i 鼠r e n tc 0 2 c o n c e n 鋤t i 鋤sw a sb u b b l e dt ot h e m e d i u m c o m p a r i n gw i t ha i r c 0 2m a r k e d l yi m p r o v e dt h e 斟o w t hr a t eo f 卻辦脬 z 泐m 繃伽加s 凹 口穢a n dh e t e r o c y s td i 虢r e n t i a t i o n a n dh e t e r o c y s t d i 鼠辯n t i a t 主 髓骶q u e n e y 蕊ae e r t a i n 倦n ef e l a t e dt oc 0 2 c o 髓e e n t r a t i o n h o w e v e r t ka d d i 矗齷o fn a h c 0 3 擊dn o ti n d u e e 也ep 妁d u c t i 馓o f h e t e r o c y s t s t h ei n c r e a s e dc 0 2c o n c e n 眥i o ni nt 1 1 em e d i u mc a u s e dt h e i n l b a l a n c eb e 船e e nc a r b o na n dn i 仃o g e ne l e m e n t s w h i c he n h a n c e d h e t e r o c y s t 能q u e n c i e sr a m e rt h 題i n c r e a s i n gt h ea b s o 破i o n o fc e l l st o n i t r o g 鉍s o u 愆e 王專m e a n st h ea l g a ee e l l s 靛i 拄o g 鐮m e t a b o l i s me x i s 搬l c eo f a 趲u l 乏童 l e 張l 越疆l t 主一e h 越滋e l 懋e 圭曲o l i e 托窟 u l 撕 戇 n i t r a t er e d u c t a s ea n d 酉u c o s e 一6 p h o s p h a t ed e h y d f o 咎n a s ea c t i i 夠 w e r ec a l c u l a t e dr e s p e c t i v e l y n i t r a t er e d u c t a s ea c t i v i 妙d e c r e a s e db yt h e i v j 匕褒化工大學碩士學位論文 a d d i t i o no fc 0 2 t h ed e t e h l 缸n a t i o no f2 k e t o g l u t a r a t es h o dt h a tt h e a c c u 枷l a t i o no f2 一k e t o 百u t a 矗ca c i dw a sc o r r e s p o n d i n gi n e r e a s e dt ot h e m l 斑b e ro fh e t e r o c y s tc e l l s 弧ee 毹c t so fd 主虢r e n t i n o 鴉a n i ec a f b 讎髓o m 貿s p e e i e s 醴 搬i c 咯g l ew e 羚s 蝕d i e 文 場戳昭施 覷瓏護泐磁豁級耀嬲d 鰳腸愆z 融 c 玨l 缸嗣戤1 粕d3 c 0 2e o 囂t 髓 孔撕e v e 也eh 適k s 妻g 羚w t h 怒t e 愆s p e 嘶v e 垃罰t a l 虹如e a r b o n 姒a 1p 灼鈀i na l l dc a 南o nn i 的g 鉍r a t 幻 w e 托c a l c u l a t e 鸝t h e 地 出o c a r b o na c c u m u l a t e di nt h ec e l lw a si 芏l c r e a s e d2 l s w e l la st h ea nr a t i oc o m p a r e dw i t ht h ea c c e s st ot h ec o n c e n n a t i o no f c 0 2 d u et o i 1 1 c r e a s e dc 0 2c o n c e n t r a t i o n p r o m o t e dp h o t o s y n m e t i c a c t i v i t i e s k e y w o r d s 和而口 z 泐 衍p 胛d 聰 d s a g 口e h e t e r o c y s t c a r b o nd i o x i 1 e n i 仃a t er e d u c t a s e 2 k e t o g l u t a l i a t e v 北京化工大學位論文原創性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學位論文 是本人在導師的指導下 獨立進行研究工作所取得的成果 除文中已經注明引用的內容外 本 論文不含任何其他個人或集體已經發表或撰寫過的作品成果 對本文 的研究做出重要貢獻的個人和集體 均己在文中以明確方式標明 本 人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔 作者簽名 至壘緝 日期 立竺堇型蘭 關于論文使用授權的說明 學位論文作者完全了解北京化工大學有關保留和使用學位論文 的規定 即 研究生在校攻讀學位期間論文工作的知識產權單位屬北 京化工大學 學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印 件和磁盤 允許學位論文被查閱和借閱 學?？梢怨紝W位論文的全 部或部分內容 可以允許采用影印 縮印或其它復制手段保存 匯編 學位論文 保密論文注釋 本學位論文屬于保密范圍 在上年解密后適用 本授權書 非保密論文注釋 本學位論文不屬于保密范圍 適用本授 權書 作者簽名 至 魚坌日期 趨堡蘭 導師簽名 邀艘日期 迦金玉五 北京化工大學碩士學位論文 i 1 水華束絲藻簡介 第一章文獻綜述 1 1 1 水華束絲藻的形態特點 水華束絲藻是一種固氮藍藻 可固定空氣中游離氮為簡單氮化合物以供藻細 胞利用 其藻絲直或稍彎曲 單一或藻絲側蘑相連成束狀群體 藻絲中部細胞短 柱形 里方形 細胞內具假空泡 有遮強光和漂浮的功能 末端細胞尖細 延長 成無色細胞 膠鞘模糊不清 l 異形胞閡生 異形胞由營養細胞特化露成 是絲 狀藍藻類產生的 種與繁殖有關的特別類型的細胞 形狀與一般細胞不同 圓形 色淡 成熟的異形胞是透明的 其細胞壁在與栩鄰細胞相接處有鈕狀增厚部 水 華柬絲藻可在富營養水體中大量繁殖 形成水華 且細胞破裂后可釋放貝蛤類毒 素 對動物和人類有潛在危險翻 水華束絲藻的細胞增殖主要靠藻絲的斷裂和段殖體的形成進行 段殖體系藍 藻藻絲上兩個營養細胞問生出的膠質隔片 凹面體 或由聞生異形胞斷開后形成 的若干短的藻絲分段 又稱藻殖段或連鎖體 即在絲狀群體中 有一段群體與其 他絲狀體部分脫離 再分裂增殖形成新絲狀群體 3 舄時又能在細胞內產生孢予 這種孢予不經休眠而直接萌發形成新個體 除此以外也能形成厚壁孢予 即休眠 孢子 由普通營養細胞增大體積 積累豐富營養 然焉細胞壁增厚面成 厚壁孢 子大多出現于絲狀體類型的種類上 它的有無 形狀 數目以及位置等 均為分 類的依據 厚壁孢子有極強的生命活力 畿在不利環境條件下長期缽眠 當環境 好轉時孢子萌發成新的絲狀體 有人報道 從已貯藏7 0 年的千燥土壤中得出的 孢子仍有萌發能力溺 2 水華束絲藻的利用價值 s e 湖ab 懿蕊文矗等 捌通過研究發現水華柬絲藻的自然提取物對體終紅血球和 皿漿樣品有一定的抗氧化作用 對提取物利用氧化劑進行預溫育 發現6 2 0 刪下 的吸光凌顯著下降 標志著該萃取物中含有一種可快速被氧化的蛋自 并證實該 蛋白為藻藍蛋白 藻藍蛋白是一種屬于光合作用體系的蛋白 6 1 包含有兩個生色 豳的b 亞基和包含一個的謹亞基 可利用魏蝴r o x y a p 蕊t e l 硼蠲 斑t i oa 6 2 餅a 2 8 0o f 4 7 8 層析分離純化 該蛋白的臨床應用尚待進一步研究 m i y 鋤o t o 等 7 利用微生 北京化工大學碩士學位論文 物方法以及有內因子的化學發光方法測定水華束絲藻干細胞中維生素b 2 的含量 其測定結果為6 1 6 3 m l o o g 該化合物是否可被人體利用還需要進一步研究 1 1 3 以水華束絲藻為主的藍藻水華危害 水域中含氮和含磷化合物的增多 造成水體的富營養化 藻類大量繁殖后使 水體變藍或形成其他顏色 稱之為水華 藍藻為引起水華的主要藻類 此外還有 綠藻 裸藻和硅藻等 8 我國近年來水華現象比較普遍 如滇池 巢湖 太湖等幾 大淡水湖泊的嚴重水華至今仍然沒有得到有效控制 其中滇池中形成水華的主要 是微囊藻屬 脅c r d 妒出砌功和束絲藻屬 p 加刀泐聊e 玎d 刀 如肛 藍藻在長期進化中形成了極強的生態競爭優勢 在適合的環境條件下即可獲 得最大生長率 并以指數級迅速增長 研究發現藍藻具有自我強化機制作用的生 態生長調節裂1 0 1 可使其產生盡可能多的后代 從而使產毒菌株密度增加 獲得 競爭優勢 形成種類少而數量大的藍藻水華 藍藻的大量生長可改變水體的理化 環境 透明度降低 水體散發腥臭味 溶解氧減少 當水體中的營養素被藍藻耗 盡時 藍藻大量死亡 各種有害氣體及藍藻毒素大量釋放f 9 最終導致水生態系統 的迅速崩潰 此外 引起人們較大關注的是形成藍藻水華后藍藻毒素帶來的危害 微囊藻屬 魚腥藻屬 顫藻屬和束絲藻屬等都可以產生藍藻毒素 水體中高濃度 微囊藻毒素可影響水生植物種群的多樣性 1 2 j 也可使魚卵變異 魚類行為及生長 異常 并威脅人類健康 有學者認為 l i 藍藻毒素是引起我國南方肝癌高發的主要 危險因素之一 其中 水華束絲藻產生毒素使牛中毒死亡現象早在2 0 世紀初就有報道 但只 針對現象而言 無實質性研究進展 到2 0 世紀6 0 年代初 才真正對水華束絲藻 毒素進行研究和探討 并從水華束絲藻中分離出的具有四氫嘌呤結構的生物堿 經試驗證明為水華束絲藻毒素a p h a n t o 虹ni 藥理實驗表明1 1 3 j a p h a n t o x j ni 毒性 較大 其半數至死量為l o m 眺g 小鼠 不足5 m i n 足以致死 此種毒素是內毒素 藻類溶解后方可釋放出 對魚類毒性極大 水華束絲藻常為春秋季水體水華的優勢藻種 y o s h i m 勰a 的觀察表明 i6 j 從當地 人工優養湖中分離出的水華束絲藻種不能在p h7 1 及1 l 以下生長 其形成水華 時間可從當地七月持續到十月 s h i g e 0t s q i m u r a 等 1 7 研究了1 9 9 9 年b i w a 湖和 y 0 9 0 湖首次發生的以水華束絲藻為主的藍藻水華現象 與這兩個湖中的其他藍藻 如微囊藻和念珠藻相比 在夏季少部分的水華束絲藻可以繼續生長到冬季 說明 其對低溫有一定的耐受性 并利用從b i w a 湖分離得到的無菌藻株進行培養闡明溫 度對其生長的作用 該藻株可在8 以上生長 最適生長溫度在2 3 至2 9 之間 j e 京化工大學碩士學位論文 甚至在5 低光條件下也可存活至少2 5 天 這些結果證實了其在晚秋和冬季產生 水華的可能性 并說明不同地區的水華柬絲藻種可適應不同的生長條件 此外 金傳蒴等u s 利用b g ll 培養基培養水華束絲藻n 玨 5 藻株并提取毒素 采用a o a c 小鼠生物檢測法對純種昆明小鼠腹腔注射 小鼠出現腹式呼吸 隨后 抽搐至死亡 證實水華束絲藻n h 5 株能產生麻痹性的貝毒素 它是 種作用于細 胞膜水平上的肌肉神經抑制劑 作饜機理被認為是通過阻止鈉離子流的作用勢能 最后抑制神經傳導 w i l l i 黝等 l 州報道水華束絲藻毒素引起神經肌肉傳導阻滯的機制是阻礙了細 胞膜的鈉通道傳導 而對鉀通道的傳導無影響 且抑制作用有劑量效應關系 與 溽豚毒素 石房蛤毒素的作用相似 該隰滯作用是完全可逆的 即停止染毒焉 會逐漸恢復到原來的動作電位 胡智泉等 2 l 用不同濃度的微囊藻毒素 m c 1 嫁 處理自滇池分離的水華束絲 藻 研究了m c r r 對水華柬絲藻的生理特性和超微結構的影響 結果顯示 l o h 啦 的m c r r 可輕微促進水華束絲藻的生長 面l p g 純 饔l 嘲轉g 厄的撻c 韃己對水 華束絲藻表現為急性致死效應 藻的生理機能完全破壞 可溶性碳水化合物和蛋 白質含量上升 光合系統p si i 活性迅速降為零 藻絲在4 8 h 后開始斷裂 解體 并逐漸溶解 其超微結構顯示細胞膜受損 藻細胞內含物幾乎完全滲漏 微囊藻 毒素對水華束絲藻有顯著的溶藻效應 2 2 微囊藻毒素在束絲藻與微囊藻的季申群更 替中發揮著重要的作用 4 形成藍藻水華的主要影響因素 影響水華發生的首要因子是營養鹽 n p 是藻類生長過程中必需的營養元素 l 捌 它們在水體中的含量直接影響著藻類的生長 從而決定了永華的發生和可能 形成的規模和程度 據報道1 2 叫在富營養化湖泊中 無風或微風時 水面平靜 水 溫2 0 3 0 p h 6 9 時適于水華藻大量繁殖 jl e h t i m a l i 等 2 4 j 研究了環境條件對泡沫節球藻和水華束絲藻生物量和固氮能 力的影響 同時測定泡沫節球藻生成的毒素濃度 較之泡沫節球藻 水華束絲藻 較適合在低光照 低鹽分以及較低溫度的條件下生長 與細菌共同培養或提高磷 酸鹽濃度都可使兩者的生物量提高 而過高的無機氮會使兩者生物量下降 細胞 和培養基中節球藻毒素的濃度以及氮固定化速率 通常在促進生長的條件下達到 最大 在高溫 高磷酸鹽濃度以及強光照條件下細胞內節球藻毒素濃度增加 兩 高鹽和高無機氮培養基中降低 培養基中節球藻毒素濃度隨培養時間增加而增加 說明細胞內毒索隨細胞破裂而釋放到培養基中 l 乏衷化工大學矮 學位論文 e l i 呔a 等貓弼提取水華中藍藻并遙過實驗發現藍藻固氮能力與培養基中氮元素 含量稠鹽濃度呈負相關 面在低氮條件下 增加培養基中磷元素濃度可有效提高 藍藻固氮能力 w 研s b a u 曲等 1 4 l 對加利福尼亞的c lc a r 潮水由水華束絲藻引起的水 華現象進行了研究 加利福尼距的e l e 盯湖水溫暖且較淺 雜質較多 富營養化嚴 重 l 孵5 年 在水華柬絲藻的大規模生長期間 該湖泊的三大水域溶鐵離子水平 從原先的1 5 3 0 燃u g 降低到2 m l l g 在實驗條件下鐵離子的增加可使藍藻氮固定他速 率提高5 0 0 說明鐵離子的增加可顯著提高碳固定速率和葉緣素合成速率 且硝 酸鹽的加入促進了碳固定和葉綠素的合成但限制了氮的豳定化 生物量的測定表 明c l e a f 潮中藍藻和其他藻類的生長常常受到聚合氮源直接限制作用 偶爾也受到 鐵離子和磷含量的影響 通過限制氮固定化 環境鐵離子含量的增加可降低藍藻 對氮源的利用 從而減少藍藻生長 l 2 藍藻的光合碳代謝 藍藻是一類分布廣泛的原核光合白養生物 以葉綠素a 為主要光合色素 通 過c a l 蕊循環固定c 0 2 光合作用過程釋放氧 并生成還原耱供細胞利用 微藻的 營養方式有光囊養 混合培養 異養等三種 2 6 光盤養是指藻細胞利用光能為能 源 利用無機碳作為碳源進行光合作用的營養方式 混合培養是指藻細胞同時利 用光和有機物為能源 同時利用有機物和無機碳為碳源的營養方式 異養是指藻 細胞以有視物為能源和碳源的營養方式 混合營養與光自養相比 微藻的混合培 養方式具有生長速率快 對光的依賴性減弱或提高光能利用率等特點 而與異養 相比 能夠以混合方式生長的微藻種類很多 2 0 且能合成有光調節而生成的代謝 物 藍藻在細胞肉利用l 5 二磷酸核酮糖羧化酶一氧化酶 r 西i s 固定c 0 2 有些 藻種也可直接利用h c 0 3 作為無機碳源 在淡水藍藻種群的增長過程中 環境中無 機碳濃度有可能下降至岫o l l 水平 由于c 0 2 在水體中擴散較慢 這種低濃度 c i 可維持較長時間 在這種條件下 藍藻細胞中c 0 2 濃縮機制 c 0 2c o n c e n 缸 a t i n g m e 出鑫蕾s m c c m 可被誘導出來1 2 丌 c c m 機制是某些水生植物為保證其光合 搴用 的碳源供應所形成的提高細胞內c 0 2 濃度的生理機制 藍藻是典型的c c m 生物 其c c m 機理得到了詳盡的研究 并取得了顯著進展 r e i n h o l d 等 2 8 提出的羧化體 模型 成功的從原理上闡明了藍藻c c m 的基本過程 此模型由3 個假設組成 1 位于細胞膜上的c i 泵 包括c 0 2 泵和h c 傷 泵 將細胞外的c 0 2 和輟c 0 3 主動轉 運到細胞內 無論c i 泵以何種形式的c i 為底物 釋放到細胞內的是h c 0 3 2 c i 在細胞內的主要存在形式是h c 0 3 細胞質內無碳酐酶 c a r b o n i ca n l l y d r a s e 4 北京化工大學碩士學位論文 簡稱c a h c 0 3 與c 0 2 處于不平衡狀態 因為h c 0 3 是離子 細胞膜對它的通 透性眈c 0 2 低的多 從而降低c i 的泄漏 3 e a 和凡蠡i s 全部位于羧化體內 在c a 的催化律用下 玨c 0 3 和c 0 2 在羧化體 內進行快速轉換 由高濃度的h c 0 3 在r u b i s c 0 的活性位點附近生成高濃度的 c 0 2 而使其固定反應以較快的速度進行 一 一一一一一 一 參 數囂緩 f 曼冀 羔翌 一 r 圈l 耋藻細胞中碳分子傳遞和代謝相關酶 f 逛 1 ln e 拄勰s p 嘲翹da 鸚i m i l a t i o no f 缸鸛紐i cc i l lc y 黼o b a c t 碰嘲c e n s 當環境中無機碳濃度較高時 如自然的堿性淡水中濃度可達到1 5 2 2 m i n o 兒 在這種條件下生長的藍藻對c 0 2 的親和力較低 c c m 機制受到抑制 捌 此外 浮 游植物靜群的增長還會弓 起環境p 玨值舞高 可達到l o 0 以上 和溶解氧濃度的上舞 可達到飽和水平的1 0 0 2 0 0 從而有利于浮游植物進行光合呼吸 2 8 3 固氮藍藻的氮代謝 氮是藻類生長的必需元素 在地球上的存在形式有無機態和有機態兩種 一 般來說 藻類較易吸收利用無機態氮 主要有n h 4 n n 0 3 二n 和n 0 2 n 其中n 0 2 乞n 在自然永體中含量很少 部分藍藻也可利用尿素和四氧化二氮及谷氨酸鹽作為氮 源 3 l 微藻對銨鹽和硝酸鹽的吸收到用速度受各種條件的影響 在能量歪足時 5 二l 藝京優工大學矮 學位論文 硝酸鹽的利用率低于銨鹽 即在低光強下細胞利用銨鹽的速度比硝酸鹽快 但對 大多數藍藻麗言 培養液中較多的銨態氮是有害的f 3 3 藍藻最普遍利用的是硝酸鹽 硝酸鹽在進入細胞后 經過由硝酸還原酶 n r 和亞硝酸還原酶 n i r 催化的兩步還原反應 3 2 轉化為細胞可利用的銨離子形式 銨離子可在谷氨酸合成酶作用下合成谷氯酸參與代謝 但該途徑能耗較高 一般 通過谷氨酰胺一酮戊二酸氨基轉移酶途徑 g o g a t 每生成一分子的谷氨酸耗去一 分子的n a d p h 和a t p 如下圖所示 圖l 2 藍細菌對不同形式氮源的利用 f 嗨1 2i n o 唱a i l i c 觚do 唱a i l i cnc a nb eu s e db yc y a l l o b a c t 甜a 1 3 1 異形胞的形態和作用 已知的固氮藍藻除少數種類外 都是絲狀體 固氮藍藻在無化合態氮的條件 下進行光合自養生長時 通過絲狀體中的營養細胞分化成異形胞進行固氮 主要 過程由固氮酶完成 藍藻的固氮酶 n i 曲g c n 嬲e 包括多個固氮蛋白復合體i 刈 固氮 酶復合體包括2 個蛋白 固氮酶 d i n i 訂o g e n a s c 和固氮酶還原酶 d i n i 們g e i l a s e 積氈c l a s 0 固氮酶 2 參2 是1 個異源四聚體 分子量約為2 2 0 2 4 0 k d 伐亞基和p 亞基 分別由喲曰和雅拶湛因編碼 3 5 固氮酶還原酶是1 個單酶 分子量約為6 7 7 政d 在調節電子從電子供體到固氮酶的傳遞方面起作用 由雅雅因編碼 除了這三個 喲結構基因 還有很多的基因與固氮過程和調節固氮有關 固氮酶在將分子氮還 原為n 量主3 的過纛是1 個高度吸能反應 需要a 卯作為代謝熊量 這一反應伴隨著將 質子h 還原為h 2 6 北京化工大學碩士學位論文 n 2 8 r 十8 e 1 6 a t p 2 n h 3 十 b 1 6 a d p 1 6 p i 固氮酶對氧氣高度敏感 所以許多固氮生物被限制生活在適合它們的厭氯微 生態環境p 6 而產氧的藍細菌不得不演化 采取方法保護固氮酶的活性不受到自 身代謝產生的氧破壞 有的可進化成一種產氧光合作用和固氮作用在時聞上進行 分離 白天進行光合作用 晚上進行固氮作用 3 7 然而 許多早期的絲狀體藍細 菌可以演化 它們中間小部分細胞分化形成異形胞 營造合適的厭氧微環境 專 一行使圍氮作用 3 引 在形態結構和生理功能上 異形胞有以下明顯特點 異形胞體積通常比藻絲 的營養細胞稍大 也有的無明顯差異或較小 胞壁外有明顯增厚麗形成包被 在 電鏡下觀察可看出增厚的包被分為3 層 內層為糖脂層 中闖層為多糖層 井層為 較為疏松的多糖層 3 9 外層的富集是最早的形態上的變化 然后才是中聞層 最 后是內層 胞外的外包被層 特別是糖脂層 降低了氣體向異形胞中的擴散 有 利于維持細胞內的厭氧環境 異形胞綱胞的兩極特別增厚 并形成一狹細孔道與相鄰細胞相通 從兩獲得 還原力和碳素營養 細胞質中的顆粒狀物質溶解消失 光鏡下觀察呈均質狀態 細胞常呈淡黃綠色或呈透明狀 異形胞內不會藻膽素 但仍含葉綠素a 異形胞內 原有的類囊體破碎 形成新的膜結構 在細胞中呈網狀排列 彼此密貼或纏繞成 螺旋狀 成熟異形胞中的類囊體常集中在細胞的兩端 形成半晶狀的晶格結構 后期破裂 在兩端形成折光性較強的極球1 4 0 異形胞中的核物質不集中在細胞的 中央區域 而是在細胞中呈漫散均一狀態 圈l 34 0 傣光學顯微鏡一f 水華束絲藻藻絲體中異形胞 f 迫 1 3h e t e r o c y s tc d l s 柚dv e g e t a 紅v ec c l l so f 卻辦靠 l 泐m 刪繃兒峪一露g 凇p 由圖1 3 可見 水華束絲藻中異形胞形態較規則 胞內顆粒狀物質基本不可見 7 墓藝寨化工大學矮 學經論文 光折射率較高 細胞壁明顯增厚 邊緣光滑 一般在藻絲體中間出現 異形胞在生理功能主僅具光系統l p s1 麗不具能放氧的光系統 i p s1 1 異形胞離體呼吸速率較高 約為2 3 0 p l 蹦 m g n 婦 而藻絲體內營養細胞的呼吸速 率為15 9 4 止蝴g n h r 4 l l 異形胞不能圃定碳 所需碳化合物需從鄰近的營養細 胞獲得 且一經形成就不再分裂 衰老的異形胞常從藻絲上斷離 不久即瓦解 但某些種類異形胞可以萌發產生新的藻體 有些種類異形胞與厚壁孢子的形成可 能有關 從而影響藻細胞的生長繁殖 異形胞常將藻絲分隔為藻殖段 而且藻絲 極易從異形胞處斷離 每個藻殖段均可發育成一個新藻體 由此表明它在藻絲進 行藻殖段營養繁殖上有重要作用 1 3 2 異形胞中的生物代謝 在培養基中缺乏化合態氮源的條件下 藍細菌絲狀體上大約有5 1 0 的細胞分 化成異形胞f 4 2 1 為營養細胞提供足夠的氮源 以維持整個菌絲體的正常生長 同 時營養細胞也會將生成的碳水化合物h 3 1 提供給異形胞 兩個不同類型的細胞在絲 狀體上相互依存 因此 異形胞對絲狀體可固氮藍細菌的生長非常重要 圖1 4 異形胞中的主要代謝途徑和營養輸送 f i g 1 4c 矧b o n h y d 婦t em e 協1 b o l i s mi nh e t 甜o c y s t s 粕dt h ee x c h a l l g eo f c o m p o u n d sb e 時e e i l k 睡o c y s t s 鑫靛dv e g e 鋤v ec e l l s 異形胞在形成過程中可以誘導產生蛋自酶 矧 這些蛋白酶可以降解藻膽蛋白和 一些固定二氧化碳的酶類 異形胞中還可誘導產生氫化酶和氧化戊糖途徑中的酶 8 北京化工大學碩士學位論文 類 并產生谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺合成酶的運輸系統 對魚腥藻的基因研究證實 營養細胞中的碳源以蔗糖的形式運送到異形胞 其中編碼蔗糖合酶的葶l 蒯基因附 在圈氮生長的條件下逯常以較低的水平表達 其 它類型的運送方式尚不清楚 細胞色素c 氧化酶參與的呼吸作用在異形胞中發揮著 重要的作用 可以為氮氣固定提供a r p 并且可以為異形胞創造一個微氧的環境 伺 在大多數藍細菌中藻青素是氮源的儲存物泌強 但藻青素的代謝對于有氧條件下的 生長不是必須的 藻青素也是異形胞向其它營養細胞輸出氮源的方式之 其輸 出形式尚不清楚 1 3 3 異彩臆發育的調控 異形胞的發育涉及到藍細菌對細胞外界氮源缺乏信號的感應 對胞內生理或 者細胞周期信號的感應 以及菌絲體上細胞之間的交流 在藍細菌中 氮代謝途 徑最關鍵的步驟是谷氨酰胺合成酶 g s 和谷氨酸合成酶 g o q 螺 催化的反應 即 g s g o g a t 循環 而藍細菌中因為缺少2 酮戊二酸脫氫酶 刪 其三羧酸循環不完 全 生成的2 酮戊二酸作為碳架直接參與谷氨酸的合成 所以 2 酮戊二酸作為一 個重要的中間代謝產物將生物體中碳氮代謝有視的結合在一起 玨戎r 可能是最早調控異形胞發育的調控因子 也是異形胞發育的關鍵調控因 子 缺乏五既r 基因的突變體不能發育形成異形胞 4 引 e 坎基因的超表達則能提高菌 絲體在缺氮條件下異形胞形成的效率 并出現多個異形胞串連的表型 甚至在有 化合態氮源的條辭下 也可以形成異形胞 研究證實 h 根是一種不太常規的絲 氨酸蛋白酶 嗍 可以自我降解 也可能降解其它的蛋白質 h e t r 是 種d n a 結合蛋 白 h e t r 的二聚體是d n a 結合所需要的i 硎 h e t r 可以與j i l p 吠 j j l 卅和p 口艘基因的 啟動子結合 這意昧著這些基因的表達可能受到h 積的直接調控 在藍細葛私巍療施勰曩p c e 7 1 2 0 中 培養基申氮源的缺失可以誘導j i g 緩基因的表 達 缺氮后1 至2 小時內 j i l e 齷基因開始大量表達 3 5 小時內即可發現矗e 緩基因在一 些間隔的細胞內大量表達 這些細胞即是正在分化的異形胞 研究表明j 矗p f r 具有 正向的自我調控功能 而且j i l g 綻的表達受囂地墨的正調控 翻 受到磊g 掰豹超量表達抑 制 在氮源缺失的條件下 五锨和囂別的表達是一種相互依賴的關系 固氮酶結構基因柵懈的表達是在異形胞的發育過程中受到調控 5 除了缺 氮和無氧的環境能引起它的表達外 還需要有異形胞發育的完成或部分完成 在 有氧條鋒下 通常只有在異形胞完成形態發育后才能表達 由此可見 細菌纓胞 中有高度的組織性 不同的過程發生在一定的時候 碳元素和氮元素作為生物體 中兩大重要元素 不同的代謝過程必然有一定的相關性 9 北京化正大學碩士學位論文 1 4 碳代謝與氮代謝的相互作用 碳元素和氮元素是植物體內兩大重要元素 其代謝是植物體內最主要的代謝 過程 藍藻的特點是既能利用無機碳 有機碳 又熊利用空氣中的氮和結合態氮 情況更為復雜 碳氮代謝都需要消耗來自于c 0 2 同化和電子傳遞鏈的有機碳和能 量 因此關系非常密切 從總體上番 光合碳代謝為氮代謝提供能量和碳架 氮 素代謝同碳素代謝競爭光反應生成的同化力及其代謝的中間產物 溉 筍 m 警l e 弱 鐮 鑣 圈l 5 藍細菌碳氮兀素代謝相互作用 f 醵l 5i l l t e 媳c t i sb e 魄e 瓤n i 的g 黜a n dc 煳m e t a b o l i s m 虹c y a n o b a c 矧a 光合碳代謝一方面通過光合鏈提供還原劑 一方面通過光合代謝產物提供還 原劑 從氮代謝的整個過程看 從n 0 3 還原成n 0 2 一需要由n a d h 提供兩個電子 n 加h 主要來自于光合碳代謝 而n 0 2 還原成n h 4 所需的6 個電子直接來源于光 反應形成的還原f d 與二氧化碳同化競爭光和電子 從氨離子到谷氨酰胺再到谷 氨酸的轉化 不僅需要期限和還原f d 而且需要僅酮戊二酸作碳架 生物體中無機氮代謝消耗同化力 同時利用c 0 2 同化產物作為氨基受體形成 l 匕哀化工大學碩士學位論文 有機的碳一氮化合物 因此氮代謝可在兩個水平上影響c 0 2 的同化 方面通過 參與還原力和筒m 的競爭 降低c 0 2 同化的速率 另 方面 氨同化中消耗a 酮 戊二酸會減少c 0 2 同化產物 1 5 本論文的主要內容 由水體富營養化引起的水體水華是目前世界各國箍臨的重要環境闖題 大規 模的藍藻水華降低了水資源利用效能 引起嚴重的生態破壞及巨大的經濟損失 焉藍藻毒素的產生給公眾健康帶來極大隱患 水華束絲藻因具有異形胞可進行固 氮 p h 適應范圍廣 生長溫度偏低麗常為春秋季淡水水域水華的主要藻種 研究 無楓碳代謝對氮代謝的影響并由此得出不同條件下異型胞的形成 不僅對藍藻的 生命機理有重要的理論意義 更在控制水體水華秘藍藻固氮利用等方面有廣泛的 應用價值 本文選擇水華束絲藻9 4 3 為主要研究對象 利用生理學 生物化學和生化工程 的方法和手段 從細胞水平和分子水平研究藍藻光合碳代謝對細胞氮代謝的影響 和相互作用關系 以及環境因子對藍藻細胞的生長分化作用 最后采用小球藻和 三角褐指藻這兩種經濟藻種來探討結論在工業生產中的理論指導作用 其中具體 的研究內容如下 1 以水華束絲藻9 4 3 為研究對象 研究不同生長條件對該藻種生長繁殖的影 響 以獲得最佳生長條件 為下一步的反應器中培養確定依據 2 在反應器中對水華束絲藻進行培養 改變無機碳的供給量 探討光合碳代 謝對氮代謝途徑和細胞分化的影響 3 以小球藻和三角褐指藻為研究對象 探討在不同無機碳源條件下對氮源的 利用和對最終收率的影響 j 藝京化工大學碩士學位論文 2 1 藻種 第二章材料與方法 所用藻神水華束絲藻9 4 3 由中國科學院水生生物所提供 2 2 培養方法 2 2 培養基 水華束絲藻及小球藻培養基 b g l l 培養基 將各種營養成分分別配制成儲液 4 保存 使用時將各儲液按比例混合 表2 1b g ll 儲餐液組成成分和每井工作液的配比 s t o c k ls t o c l 2s t o c l 3s t o c k 4 s t o c k 5 2 m l5 0 m l 2 m ll 棚l m l 按比例配制好后 補加去離子水到l l 調p h 值為7 5 其中無氮的8 g ll 培養基 組成為取同質量的n 妃l 取代儲冬液中n a n 0 3 三角褐指藻培養基 加富的人工海水培養基 表2 崆人工海水培養基的配制方法 m o l w t m o l 囂 簸e 鼴燃i 細0 1 ls o l 戚 鼓 n a c l5 8 甜 o 3 2 6 7 n a 2 s 0 4 k c l 1 4 2 湃 7 4 5 6 o 0 2 5 0 o 0 0 8 0 2 1 1 9 3 9 3 5 5 0 0 o 5 9 9 3 n a h c 0 3 8 4 o o o 0 0 2 l o 1 7 3 5 1 3 北京純正大學碩士學位論文 表2 3 舵加富溶液營養元素 微鬣元素和維生素儲備液的配制方法 2 2 2 藻種的純化 在b g l l 液體培養基中加入1 5 之 o 的瓊脂粉 高溫滅菌 冷卻詹倒入消毒 的培養盟中 制成平板 在超凈臺將待分離的藻液通過涂布或者劃線的方法接種 于平板上 然后靜止于光照培養箱內在適宜溫度下培養到出現單藻落 北京化工犬學碩 上學位論文 2 2 3 藻細胞的搖床培養 在無菌條件下 將適量藻液接入盛有lo o m l 培養液的2 5 0 m l 搖瓶中 初始接 種濃度一般為1 0 6 個枷 接種后 將藻液置予h z q q 光照搖床中培養 搖床轉 數為l o 鉚腑 光源由4 0 w 目光燈提供連續光照 溫度根據需要由搖床控制 瓶囂 處光照強度為6 2 岬o lp h o t o nm 乏妒1 2 2 4 藻細胞的氣升式反應器培養 該反應器為內環流式氣升光生物反應器 總體積力2 5 l 有效體積為2 o l 反應器由罐體 取樣管 氣體分鴦器等部分組成 反應器溫度由水浴通過循環水 控制 光照由安裝在罐體前后的光源板提供 每塊光源板上橫向平行排列六支日 光燈管 通過控制面板的開關 可改變罐體表面接收光強 空氣由微型氣泵提供 通氣量和二氧化碳濃度通過氣體流量計控制 二氧化碳與空氣定量混合后 通過 孔徑為o 2 岬的空氣過濾器除菌后進入進氣管 通過氣體分布器分散為均勻細小 的氣泡 進入罐內 2 3 試劑及分析測試儀器 實驗中所用的分析測試儀器如下表 表2 0 實驗中常用儀器列表 儀器名稱規格廠家 光照搖床 氣升式光生物反應器 電子天平 p h 計 冷凍離心機 氧電極 光學顯微鏡 分光光度計 超聲破碎儀 光合有效輻射計 h z q q 2 5 l r 2 0 0 4 d e l t a 3 2 q n e o 兔g e1 5 r d w 2 趁 b k 3 7 2 3 n l n 9 2 2 d f g h 1 l s 東聯電子技術開發有限公司 上海精密科學儀器有限公司 m 甜l e f t d e d o h e a l f o 愆e 英國h a 輜基e 如儀器公司 奧特光學 上海精密科學儀器有限公司 寧波新芝科器研究所 北京師范大學光電儀器廠 能京純王大學嬡 學位論文 實驗中使用無機鹽和常用化學試劑為國產分析純試劑 2 4 生理指標的測定及常規分析 2 4 1 細胞干重 取相同培養條件下不同生長時期的藻細胞l o m l 置于已知重量的離心管中 1 2 0 0 0 印m 離心 棄上清 沉淀用去離子水洗滌重懸浮后再離心