浙江人學碩士學位論文 徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析巾的應用研究 摘要 蛔前竹葉提取物 e b l 9 7 1 的主要質控指標足以硝酸鋁 業(yè)硝酸鈉比色法 測定的總黃酮糖營含量 以蘆丁為標準 為了建立與國際接軌的高標準質控體 系 必須運用高效液相色譜 h p l c 技術對e b l 9 7 l 中主要的黃酮碳苷進行定 量 首先面臨的是標準品的分離 純化和結構鑒定 本研究采用高速逆流色譜 h s c c c 對e b l 9 7 j 中的黃酮進行組分分離 接著用制備型高效液相色譜 p h p l c 純化黃酮單體 然后用液相色譜 質譜聯用 l c m s 技術對單體進行結構鑒 定 同時采用溶出伏安法對e b l l 中的微量元素進行檢測 f 研究結果分述如下 1 經過對6 組兩相溶劑系統的分析測試 選擇以石油醚 正j 醇 水 1 4 5 作為h s c c c 的溶劑系統 其分層時間為2 5 s 上卜相體積比為o 9 6 兩種 主要竹葉碳苷黃酮在該溶劑系統上 卜相中的分配系數分別為3 8 0 和4 4 4 2 以此溶劑系統的 卜相為固定相 下相為流動相 當h s c c c 儀轉速為 8 0 0 r p m 流動相流速為2 2 5 m l m i n e b l 9 7 l 進樣量為1 0 3m g 時 3 小時內就可 有效地將試樣中的黃酮類化合物分成六個餾分 其中最主要的餾分一5 號峰經 h p l c 檢測 發(fā)現含兩種主要的竹葉碳苷黃酮 3 利用制備型反相高效液相色譜 對5 號峰進一步分離純化 色譜條件 為 b e c k m a nu l t r a s p h e r et mo d s 柱 1 0 m mi d 2 5 0 m m 5 1 m 柱溫 3 0 流速 1 0m l m i n 進樣量 1 0 0u l u v 檢測波長 3 3 0 n t o p d a 掃描 波長范圍 1 9 0 6 0 0 n m 制備得到兩個單體 其紫外光譜圖都具有黃酮類化合 物所特有的吸收帶i 3 0 0 4 0 0 n m 和帶i i 2 4 0 2 8 5 n m 且兩吸收峰的相對 強度也符合黃酮類化合物特征 4 利用l c m s 聯用技術對所得的兩個黃酮申體進行結構鑒定 測得其分 子量均為4 4 8 帶i 的紫外吸收相同 帶i i 有顯著差異 經與美國 l n d o f i n e c h e m i c a l 公司的h p l c 級標準鼎對照 證實分別是葒草苷 8 c 葡萄糖 木犀草素 和異葒草苷 6 c 葡萄糖 木犀草素 5 經多次探索發(fā)現 運用1 5 次微分的溶出伏安法 在o 0 1 m o l l 醋酸鈉 o 0 4 5 m o l l 酒石酸氫鉀介質 p h 5 7 8 中 鎘 鉛 鋅和銅離子都能產生靈敏 的氧化波 四種離子在1 0 一1 0 4m o l l 之間均具有良好的線性關系 將此法戍 塑婆叁蘭堡圭蘭堡堡奎堡絲塑 魚堂墊查塑叢室鯊壟笪墮堡墼塑些坌坌要 塑壁里墮塞 用于e b l 9 7 l 中微量元素的分析測定 得干基含量為 鉛 1 6 9 0 0 5 7 p g g 鋅 6 0 9 0 5 6 7 g g 變異系數分別為3 3 8 和9 3 1 l 旦l 收率分別為 8 4 7 1 0 8 鋅8 5 2 1 0 5 而e b l 9 7 1 中的鎘和銅離子幾乎測不 h 研究表明 將h s c c c 和p h p l c 有機組合 可以從e b l 9 7 l 中快速 高效地 分離純化黃酮單體 且能達到百毫克級的水平 為竹葉黃酮標準品舶制備開拓 了一條有效途徑 并為竹葉提取物高標準質控體系的建立奠定了馨 同時 本研究得出的溶出伏安法測定竹葉提取物中的微量元素 具有樣品處理簡單 靈敏度高 快速簡便 干擾小 設備投資省等優(yōu)點 適宜在生產實蘄中推廣使 用 氣 l 7 關鍵詞 竹口l 提取物j 碳苷黃酮i 微量元素 高速逆流色譜 h s c y 制備型高效液相色譜印h p l c x 液相色譜 質譜聯甩9 c m s 溶出伏安法 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 a p p l i c a t i o ns t u d i e so fc h r o m a t o g r a p h y a n d v o l t r a m m e t r y o n e f f e c t i v ec o m p o n e n t a n a l y s i so f b a m b o o l e a f e x t r a c t a b s t r a c t a tp r e s e n t t h em a j o rq u a l i t yc o n t r o li n d e xo ft h ee x t r a c to fb a m b o ol e a v e s e b l i st h e t o t a lf l a v o n eg l y c o s i d ec o n t e n t t f d e t e r m i n e db ya 1 f n 0 3 3 n a n 0 3s p e c t r o p h o t o m e t r yt a k i n gr u t i n a sas t a n d a r d i no r d e rt os e t u p a h i g h s t a n d a r dq u a l i t ya s s u r a n c es y s t e m w h i c hc a nb ea c c e p t e db yi n t e r n a t i o n a l s o c i e t y t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o do f t f u s i n gb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h p l c s h o u l d b ei n d u c e da se a r l ya sp o s s i b l e i ti sf i r s t l yf a c e d w i t ht h es e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o n p r e p a r a t i o na n ds t r u c t u r a li d e n t i f i c a t i o no fm a i n f l a v o n o i d si ne b l i nt h i s s t u d i e s u s i n gh i g h s p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c t op r e p u r i f yf l a v o n o i d s i n e b l 9 7 1 p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y p h p l c t op r e p a r em o n o m e r s a n d h p l c m st oi d e n t i f ys t r u c t u r e w eg a i n e dt w op u r ec h e m i c a l so fc g l y c o s y l f l a v o n o i d so fb a m b o o a tt h es a l r l et i m e t h em e a s u r e m e n to ft r a c ee l e m e n t si n e b l 9 7 1w a sa l s oc o n d u c t e du s i n gb y1 5 t hd i f f e r e n t i a ls t r i p p i n gv o l t a m m e t r y r e s u l t sw e r e r e p o r t e d a sf o l l o w s r e s p e c t i v e l y 1 t h r o u g hi n v e s t i g a t i n gt h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n t d e l a m i n a t i o nt i m e a n dv o l u m e r a t i ob e t w e e nt w op h a s e so fs i xs o l v e n ts y s t e m s o n em i x s o l v e n t st h a tc o n s i s t so f p e t r o l e u m n b u t a n o l a n d w a t e r 1 4 5 v v w a s s e l e c t e df o rh s c c c i t s d e l a m i n a t i o nt i m ei s2 5 s v o l u m er a t i ob e t w e e nu p p e ra n dn e t h e rp h a s e sw a s0 9 6 a n dt h ed i s t r i b u t i o nc o e f f i c i e n t so ft w om a i n c g l y c o s y lf l a v o n e so f b a m b o oi nt h e m i x s o l v e n t sw e r e3 8 0a n d 4 4 4 r e s p e c t i v e l y 2 t a k i n g t h eu p p e ro f t h em i x s o l v e n t sa ss t a t i o n a r yp h a s ea n dt h en e t h e ra sm o b i l e i i 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 p h a s e s i xe l u t e df r a c t i o n s w h i c hi n c l u d eap a r ts t a y e di ns t a t i o n a r yp h a s e w e r e o b t a i n e db yh s c c ci n 3h o u r s t h es e p a r a t i n gc o n d i t i o n sw e r e8 0 0 r p mr o t a t e s p e e d 2 2 5 m l m i nf l o wr a t e a n d1 0 3m gi n j e c t i o na m o u n to fe b l 9 7 1s a m p l e t w o m a i nc g l y c o s y lf l a v o n e sw e r ed e t e c t e db yh p l ci nt h ef i f t hf r a c i t i o n fe t h e b i g g e s tp e a k 3 t h e f i f t hf r a c t i o nw a sp u r i f i e db yp h p l cu n d e r f o l l o w i n gc o n d i t i o n c o l u m n t e m p e r a t u r e3 0 f l o wr a t e 1 0m l m i n i n j e c t i o nv o l u m e1 0 0 此 u vd e t e c t i o n w a v e l e n g t h3 3 0 n m a n dp d a d e t e c t i o nw a v e l e n g t h1 9 0 6 0 0 n m t w of l a v o n o i d m o n o m e r sw e r ep r e p a r e da n db o t hh a v et h ec h a r a c t e ru va b s o r b a n c e t h e i rb a n d ia n db a n d1 1w e r el o c a t e di nt h er a n g e so f3 0 0 4 0 0 n r na n d2 4 0 2 8 5 n m a n d a b s o r b a n t ei n t e n s i o na l s oa c c o r d sw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co ff i a v o n o i d s 4 t h ec h e m i c a lc o n f i g u r a t i o no f t w om o n o m e r sw a si d e n t i f i e d b yh p l c m s t e c h n o l o g y r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e ya l lh a v et h es a m em o l e c u l a rw e i g h to f4 4 8 w i t hs a m eb a n dia n dd i f f e r e n tb a n di ia b s o r b a n c e c o m p a r i n gw i t ht h es t a n d a r d s a m p l e sb o u g h t f r o mo fa m e r i c ai n d o f i n e c h e m i c a lc o m p a n y a n dt e s t i n gb y s t a n d a r da d d i t i o nm e t h o do fh p l c t w om o n o m e r sw e r ea p p r o v e da so r i e n t i n 8 c g l u c o s y l l u t e o t i n a n di s o o r i e n t i n 6 c g l u c o s y l l u t e o l i n i n d i v i d u a l l y 5 1d e t e r m i n a t i o no ft r a c ee l e m e n t so fc d p b z n c ub yt h e1 5 t hd i f f e r e n t i a l a n o d e s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y w e r ec o n d u c t e dt o o i nt h es o l v e n tm e d i u mo f 0 0 1 m o i lp o t a s s i u m h y d r o g e nt a r t r a t ea n d0 0 4 5 m o i ln a a cw i t h 岬5 7 8 a l lo f f o u ri r o n sc a n p r o d u c ev e r ys e n s i t i v eo x i d a t i o nw a v e s t h ep e a kh e i g h ti sr e l a t e d l i n e a r l yw i t hi r o nc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f1 0 81 0 一m o i l t h i sm e t h o dh a s b e e ns u c c e s s f u l l yu s e dt oi n s p e c tt h ec o n t e n to f c d p b z na n dc uo f e b l 9 7 1 a n d r e s u l t ss h o w e dp b a t 1 6 9 0 0 6 t g ga n d z na t 6 0 9 4 0 5 7 p g i nd r yb a s e m e t h o d sv a r i a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r e3 3 8 a n d9 3l a n dt h er f i c o v e r yr a t e s w e r e8 4 7 1 0 8 a n d8 5 2 1 0 5 r e s p e c t i v e l y h o w e v e r c da n dc ui ne b l 9 7 1c o u l d n o tb ed e t e r m i n e dh e r e d u et ot h e i rc o n t e n t so v e rt h ei n s p e c t i n gl i m i to ft h i s i v 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 m e t h o d t h e s es t u d i e sr e v e a l e dt h a tt h ef l a v o n eg l y c o s i d e si ne b lc o u l db es e p a r a t e da n d p u r i f i e da b o v e0 1 9s c a l e sb yh s c c cp l u sh p l c f a s ta n de f f e c t i v e 虹i te x p l o r e d a ne f f e c t i v er o u t et op r e p a r eb a m b o o l e a f f l a v o n o i ds t a n d a r d sa n ds c r l e dd o w na f o u n d a t i o nf o r s e t t i n gu pah i g h s t a n d a r dq u a l i t ya s s u r a n c es y s l l e mo fe b l m e a n w h i l e t h em e t h o da p p l i c a t i o no ft h ea n o d e s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y i n c o n t i n u o u sd e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t si ne b l 9 7 1w a ss i m p l e s e n s r i v e f a s t a n dd i s t u r b l e s sa n d c o s t l e s s s ov e r ys u i t a b l ef o rm a n u f a c t u r e r sa p p l i c a t i o n k e y w o r d s e x t r a c to fb a m b o ol e a v e s e b l c g l y c o s y lf l a v o n e t r a c ee l e m e n t h i g hs p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h p h p l c h p l c m s a n o d e s t r i p p i n g v o l t a m m e t r y v 致謝 本論文是在二位導師一一張英教授和吳曉琴劓赦授的悉心拍導下 莧成的 導師嚴謹的科學態(tài)度 對事 皇的執(zhí)石追求 高尚的人格魅力 和藹可親的工作作風 時制威染和鼓舞著學t 使我受蓋睡淺 這一切 對我的一生都埒產生t 要的影響 在即將牛業(yè)之際 謹向導師致以崇高 的鞋意和衷心的感豫 在本論文的設計 試驗和論文撰寫過程中 高速逆流色譜部分得到 了機州育學院的杜珙珍高極研究炙 夏明碩士的史力協助 高故液相色 譜實玲部分還得到了浙江省疾病控瑚和防疫站的任一平高級工程師 鐵 曉威工程師的竭誠帶助 溶出伏安法的條件摸索得到了鈍請筑教投 李 秀玲射教棱的悉心拍點 謹在此向他們表示衷心的感謝 格簧值博士和碩士同學沈海濤 王啟軍 潘向榮 王樂芬 俞卓裕 姚曉寶等為本論文曲研究工作提供了煎情的幫助 特別值得一提的是 我的師妹 師弟們 鄭t 鶯 胡曉結 陸帕重等 在本文的試玲部分 做了太量的工作 在此一弄表示誠摯的謝意 我還要感鏘農業(yè)工程與食品科學學院和食品系的領導和其他老師 在我求學期間說恰予的關心和幫助 羹后 要特別或鴿 在我 年求學生髓中 一直關心我 支持我的家 人 是他f 她 們給了我一往直前的勇氣和充鞭國難的決心 謹將此文獻恰我所蠡愛均人們 徐維婭 0 0 0 2 年羅恿于晰大畢家池 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 前言 黃酮類化合物 f l a v o n o i d s 簡稱類黃酮 廣泛分布于植物界 是許多中 草藥和食物的有效成分 為當今國內外的醫(yī)藥保健品行業(yè)和功能性食品領域 所矚目 類黃酮類具有c 6 c 3 c 6 的基本結構 主要包括黃酮 黃酮醇 雙氫 黃酮 醇 異黃酮 黃烷酮 查爾酮等十幾個大類 l 近2 0 年來 類黃酮日 益引起人們的重視 迄今自然界中發(fā)現的已達數千種 大多具有顯著的生理 和藥理活性 對一些常見病 多發(fā)病 慢性病有良好的防治作用 隨著對類 黃酮研究的不斷深入 分析 測試和制備手段也得到了迅速發(fā)展 2 1 0 1 高速逆流色法 h s c c c 在天然產物研究中的應用 逆流色譜 c o u n t e r e u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y c c c 是近4 0 年發(fā)展起 來的一種新型的色譜技術 但在發(fā)展過程中遇到了許多挫折 3 直至上世紀 8 0 s 初期 高速逆流色譜 h i g hs p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h s c c c l 的出現 才使得c c c 技術取得了突破性的進展 h s c c c 利用流體在聚四氟 乙烯螺旋管內的方向性與高速行星式運動結合 產生 種獨特的流體動力學 現象 使互不相溶的兩相溶液在螺旋管中充分混合 順序傳遞 導致樣品中 各個組分由于分配系數的差別而有效地分離 目前 h s c c c 在天然產物的研究 中已有廣泛的應用 0 1 1h s c c c 在類黃酮中的應用 有文獻報道 用氯仿 甲醇 水 4 3 2 體系 從芫花總黃酮中一次進樣 l o o m g 分離得到了3 羥基蕪花素 洋芹素和木犀草素 4 用氯仿 甲醇 水 6 3 2 體系 以1 8 0 0 r p m 的轉速在1 5 r a i n 內從大黃根莖提取物中分離出大黃素 甲醚 蘆薈大黃素 大黃酸 大黃酚和大黃素 5 以氯仿 甲醇 水 3 3 4 0 2 7 體系和7 0 0 r p m 的轉速 在7 0 m i n 內從黃酮混合物中分離出橙皮素 4 羥基 黃 酮和槲皮素 并有效地利用了梯度洗脫技術 6 v a n h a e l e n 等將h s c c c 與h p l c 相結合 從5 0 0 m g 的銀杏葉萃取物中一次分離出了7 個黃酮糖苷 其方法是 以水為固定相 開始以乙酸乙醣為流動相 然后在流動相中逐漸添加異丁醇 到分離結束時乙酸乙酯與異丁醇之比為6 4 1 7 j o k a 等以氯仿 甲醇 水 4 3 2 體系 在3 5 0 0 r p m 下 8 m i n 內從s e eb u c k t h o m 的果實萃取物中分離得到了5 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 個主成分 其分離速度完全可與h p l c 相比較睥 還有報道從大黃羥基蒽醌總 苷元中分離了大黃酸 蘆薈大黃素 大黃素 大黃素甲醚 大黃酚等f 9 用正 己烷 乙酸乙酯 甲醇 水 9 1 5 5 在1 8 0 0 r p m 的轉速下 7 0 m i 1 1 內從掌葉大 黃的根莖提取物中分離出大黃素甲醚 蘆薈大黃酸 大黃酸 大黃酚和大黃索 d o 將e p i l o b i u mp a r v i f l o r u m 柳葉菜屬 的甲醇萃取物進樣2 毒分離得到了 槲皮苷 楊梅苷 異楊梅苷和沒食子酸 兩相溶劑系統為氯仿 甲醇 水 7 1 3 8 w 1 9 9 2 年c h e n 利用氯仿 甲醇 水 4 3 2 的兩相系統對5 個類黃酮進行 了分離 并作了定量分析 1 2 1 1 9 9 4 年k a p a d i a 利用正己烷 乙酸乙醣甲醇 水 1 4 2 5 2 5 從g a r c i n i a k o l a 藤黃屬 種子中分離出了多個雙黃酮 1 3 0 1 2h s c c c 在生物堿中的應用 生物堿是植物中一類重要的化學組分 分布非常廣泛 至少有5 0 多科1 2 0 屬以上的植物中證明有生物堿存在 已知的種類在2 0 0 0 種以上 到目前為止 用h s c c c 研究天然產物化學成分的也以生物堿的報道為多 正丁醇 丙酮 水 8 1 1 0 體系曾用于從委內瑞拉的箭毒中分離馬枯素和 p a n a r i n e 樣品進樣達7 0 0 m g t 正丁醇一氯化鈉 0 1 m 0 1 l 1 1 體系用于從 s t r y c h n o su s a m b a r e n s i sf 馬錢科 的樹干和樹皮中分離1 0 羥基 n k 甲基一柯楠醇 1 5 用四氯化碳 甲醇 水 2 0 2 0 2 從a n i s o c y c l ac y m o s a 的根中分離得到了 一個季銨鹽生物堿和5 個叔芐基異奎寧生物堿 l 用正己院一乙酸乙酯一甲醇 水 3 7 5 5 在7 0 r a i n 內以1 8 0 0 r p m 的轉速從粉防已干根的提取物中分離了 粉防己堿 去甲粉防己堿和輪環(huán)藤酚堿 17 1 從唐古特山莨菪粗提物中 用氯仿 磷酸鹽 o 0 7 m o f l p h6 4 1 1 系統分離出了4 個生物堿 l s l 從小蔓長春花 植物的葉子中用正己烷 乙醇 水 6 5 5 體系分離了長春胺和長春辛 l 將 h s c c c 與m s 聯用分析長春胺和長春辛堿1 2 0 分別用正己烷 乙酸乙酯一乙醇一 水 6 3 2 5 和正已烷 乙酸乙酯 甲醇 水 1 1 l 1 從紅豆杉的粗提物中 分離純化了紫杉醇 c e p h a l o m a r m i n e 巴卡掣2 l 以石油醚 乙酸己酯 甲醇一水 5 0 7 0 8 0 6 5 從紫杉醇的混合物中分離得到了純的紫杉醇和 c e p h a l o m a n n i n e 2 2 1 0 1 3h s c c c 在木脂素中的應用 木脂素一般存在于植物的木質部和樹脂中 所以稱為木脂素類 l e e 等以 正己烷 甲醇 水 6 5 5 以1 5 0 0 r p m 的轉速在8 0 m i n 內從江花五味子果實核 浙江大學碩士學位論文徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 的乙醇萃取物中分離了2 個結構十分相似的木脂素的成分一s c h i s a i i l l e n d 和它的 乙酸化物 2 引 以氯仿 甲醇 水的溶劑系統從西伯利亞人參的根中分離得到了純 的e l e u t h e r o s i d e 2 4 1 n i t a o 等t 2 5 1 于1 9 9 1 年主張用正己烷 乙腈 乙酸乙酯 水 8 7 5 1 的兩相系統從m a g n o l i av i r g i n i a n 中進行n e e l i g n a n s 的最初純化 它比 傳統的柱色譜更快 更有效 更經濟 0 1 4 h s c c c 在香豆素類中的應用 香豆素及其衍生物廣泛分布于植物界 曾用氯仿 甲醇 水 1 3 2 3 1 6 的兩相系統 一次進樣4 4 0 m g 來自于l o m a t i m md i s s e c t u m 的樣品 得到了3 個香豆素的糖苷和1 個黃酮糖苷 2 6 用氯仿 甲醇 水 1 3 7 8 的兩相體系分離 并分析了香豆素混合物中的甲醚散形酮 7 甲氧基 香豆素 7 羥基 6 甲氧基 香豆素和7 羥基 香豆素 2 7 俞維樂等1 2 8 1 1 9 9 5 年從a r t e m i s i ad a l a i l a n a a ek a r a s c h e n 中以氯仿 甲醇 水 2 l 1 分離出了純的7 羥基 6 甲氧基 香豆素以及 i s o f r a x d i n 和t a x a x e r y l a c e t a t e 達到了很好的分離效果 綜上所述 h s c c c 在天然產物中的分離制備是很成功的 進樣量可從毫克 級到克級 進樣體積可從幾毫升到幾十毫升 不但適用于非極性化合物 而且 適用于極性化合物的分離 它可用于天然產物粗提物的去雜 也可用于精制 甚至直接從粗提物一步純化到達純品 o 2 高效液相色譜法 h p l c 高效液相色譜 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c 是2 0 世紀6 0 s 末 7 0 s 初發(fā)展起來的一種分離分析技術 它是在經典液相色譜基礎 上 引入氣相色譜的理論 在硬件上采用了高壓泵 高效固定相和高靈敏度檢 測器等 因而具備速度快 效率高 靈敏度高 操作自動化的特點 尤其適合 于揮發(fā)性低 熱穩(wěn)定性差 分子量大及離子型化合物的分析 2 9 1 根據h p l c 在 植物化學研究中的樣品處理量和工作目的 可分為分析型和制備型兩類 0 2 1 分析型高效液相色譜 分析型h p l c 以分離和定性為目的 所使用的色譜柱內徑一般為2 i 5 r a m 柱長l o 3 0 c m 最大進樣量小于l m g 進樣體積為5 p l 左右 流動相流 速為0 8 1 2m l m i n 分析型h p l c 已廣泛用于天然產物的分析 成為中草藥 有效成分 食品化學成分和保健功能因子含量測定 純度鑒定以及質量監(jiān)控的 浙江大學碩士學位論文 徐維婭 色譜技術和伏安法在竹葉提取物成分分析中的應用研究 常用手段 2 j 0 2 1 1 分析型h p l c 在類黃酮中的應用 類黃酮的h p l c 分析通常用反相c 1 8 色譜柱 由于黃酮分子中存在酚羥基 流動相中加入少量的酸可改善峰形 陳曉嵐等 3 0 使用o d sc 1 8 柱 4 6 2 5 0 r a m 5 岬 流動相為甲醇 0 1 的磷酸二氫鈉水溶液 6 5 3 5 檢測波長3 6 0 n m 測定銀杏黃酮浸膏中槲皮素和總黃酮的含量 周欣等 3 1 悃甲醇溶解 加鹽酸水 浴回流水解銀杏葉提取物 用t w gc 1 8 4 6 1 5 0 m m 柱 流動相為甲醇 水 磷 酸 5 0 4 9 8 0 2 檢測波長3 6 0 n m 分離銀杏葉提取物中類黃酮 并測定其中 槲皮素的含量 鄔建敏等 3 2 用甲醇浸提 用w y gc 1 8 色譜柱 以甲醇 水 磷酸 6 0 4 0 o 5 為流動相 以2 5 4 n m 為檢測波長 測定了1 0 種竹子的葉 枝中 的黃酮化合物總量蘆丁含量 測得竹葉中黃酮總量在5 9 1 3 1 m 毫 g 竹枝在 1 3 4 3 m g 幢 張廷之等 3 副用z o r b a xc 1 8 柱 4 6 2 5 0 r a m 流動相為甲醇 水 冰乙酸 4 0 6 0 2 檢測波長2 8 0 n m 以蘆丁為參照物 輔以二極管陣列檢 測技術 測定了毛竹葉中總黃酮的含量 王萍等p 4 j 用y w g c l 8 柱 4 6 1 0 0 m m 1 0 岫 流動相為甲醇 水 o 2 m o l 幾 h 3 p 0 4 o 5m o l lkh 2 p 0 4 8 0 1 2 0 l 8 的溶劑系統 檢測波長2 8 0 n m 采用梯度淋洗法 使水飛薊素中的7 種主要成分得到完全分離 胡敏掣 1 用 r p h p l c 等梯度洗脫的方式成功地分辨出銀杏葉1 7 個黃酮糖苷 并定量分析 了7 個主要糖苷 含4 個獨特結構和活性的桂皮酰黃酮糖苷 的相對含量 陳發(fā)奎掣 傭三維h p l c 法測定了牛黃解毒片中黃芩苷的含量 在i n t e r t s i l o d s 柱上 以含醋酸的乙睛 水系統線性梯度洗脫 繪制三維譜圖 由峰形 峰位確定圖譜中指標成分的吸收峰 按標準曲線 由峰面積計算含量 p i e t t a 等口7 在n u c l e o s i l1 0 0c 1 8 柱上 以o 5 h 3 p 0 4 m e o h t h f 梯度洗脫 5 0 m i n 分 離了1 5 個銀杏黃酮化合物 6 個化合物由標準品對照確認 其他由u v 或可見 分光光度計及二級管陣列檢測器 p d a 確定 0 2 1 2 分析型h p l c 在其它天然產物的應用 有關h p l c 分析其它天然產物的文獻報道非常多 如劉巍等 3 3 塒苔素內酯 及其有關甾族化合物進行衍生后 分別用紫外 熒光 電化學檢測器進行檢測 的h p l c 分析法 呂光華 等用i i p l c 法測定了十大功勞屬植物中豹7 種生物 堿成分 原源掣4 0 用h p l c 法測定酸模屬植物根中活性成分一酸橫素的含量 塑鋈奎蘭嬰主堂些堡蘭堡絲絲 魚堂墊查塑垡窒鱉壟笪生塑墼塑壁坌坌塑 竺壁旦里窒 李蔚等 4 用h p l c 對以白芍為主要原料的保健食品中芍藥苷的含量測定 楊楓 等f 4 2 用h p l c 法測定西洋參蜂王漿口服液中的人參皂苷與癸烯酸等 o 2 2 制備型高效液相色譜 制備型高效液相色譜 p r e p a r a t i v eh i g h p e r f o r l l a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y p h p l c 是在傳統分析型h p l c 的基礎上發(fā)展起來 以分離 獲取大量的單組分為目的的一種高效分離純化技術 根據制備量的大小又可以 分為兩種類型 一種是將分析型h p l c 按比例放大 操作參數與分析型大致相 同的半制備型h p l c 其所用色譜柱內徑為8 1 0 m m 柱長2 0 5 0 c m 進樣 體積o 2 2 m l 流動相流速為3 5m l m i n 一次制備量在毫克數量級 另一 種是專用制備型h p l c 其色譜系統及操作參數與分析型h p l c 有較大的差別 所用色譜柱內徑在l o m m 以上 流動相流速在5 5 0 m l m i n 左右 一次制備量可 高達1 0 0 0 m g 4 3 1 由于技術上的原因 長期以來p h p l c 的進展比較緩慢 隨著 理論研究的深入 新穎的填料 新的填充方法以及在儀器和流程上的進展 近 年來p h p l c 獲得迅速發(fā)展 從直徑1 0 m m 的實驗室半制備到直徑5 0 0 m m 的工 業(yè)制備柱及其相應的設備相繼商品化 解決了多方面的分離純化問題 4 4 1 作為 一種制備手段 它具有分離條件溫和 分離檢測過程中一般沒有樣品損壞 易 于原物回收 且裝置簡單有效等優(yōu)點 天然產物研究中面臨的一個主要方面就是從天然植物中分離純化鑒定化合 物 p h p l c 在天然產物研究領域廣泛應用的原因 4 4 1 化合物結構鑒定儀器 的發(fā)展 使結構鑒定所需的樣品量越來越少 一般只需幾到幾十毫克就可解決 由p h p l c 得到毫克級的樣品是非常容易的 2 天然產物化學經過多年的研究 各種藥用動植物中含量較高的成分大多已被分離和研究 而含量較少的成分由 于分離方法的限制不易獲得 而p h p l c 方法則非常適合于分離純化含量較低 的成分 3 p h p l c 在分離純化水溶性成分時有較大優(yōu)勢 0 2 2 ip h p l c 在類黃酮中的應用 h p l c 在不同植物黃酮分析中的應用已相當成熟 而用其來制備類黃酮雖 有一定的研究 但仍不成熟 戴軍 王洪新等 4 5 應用s p h e r i s o r b c 6 h 5 色譜柱 8 3 0 0 m m i o m 流動相為甲醇 水 1 4 8 6 v v 檢測波長5 4 0 n m 成功地 分離和制備了蘆葦葉中的類黃酮 并進行了定性和定量分析 h u c hc h r i s t i a w 等 4 6 用p h p l c 從櫻草花中分離了單 雙 三 五 4 種甲氧基黃酮 制備量 塑堅奎蘭墮主蘭垡笙苧堡堡絲 魚塑墊查塑垡壅鯊壟笪 堡里塑壁坌坌蛭 塑窒里墮壅 分別達到了8 9 8 1 2 m g 鄒耀洪等1 47 j 用l i c h r o s o r br p 1 8 色譜柱f 8 0 3 0 0 m m 1 0 m 流動相為c h 3 0 h h 2 0 h c o o h 7 5 2 5 0 8 v v 檢測波長 3 3 0 n m 從楊梅葉中分離和制備了4 種黃酮醇苷和1 種黃酮醇 用 s p h e r i s o r b c 6 h 5 色譜柱 8 3 0 0 m m 1 0 p r o 流動相為甲醇 水 1 4 8 6 進行制備 定時收集檢測器出口組分 并用p d a 檢驗收集液純度 從甘薯葉黃酮中分離 純化制備了4 種黃酮單體 4 8 同時用流動相為甲醇 水 1 5 8 5 v 檢測波長 3 4 0 n m 光譜采集 1 9 0 6 0 0 n m 從箬竹葉中分離制備了8 種黃酮類化合物 4 9 1 0 2 2 2p h p l c 在其它天然產物制備研究中的應用 徐光國1 5 0 運用國產y z s 3 型液相制備色譜儀分離制備了抗癌藥葫蘆素b 標準品 茯苓三萜酸成分和金銀花中的主要成分綠原酸 陳若蕓等1 5 1 用 p h p l c 制備了靈芝中的三萜類化合物 張仁斌等吲用p h p l c 對青藩素異構體 進行了分離制備 賀賢國等 5 3 用p h p l c 制備了芫花甲酯 陳波等 蚓用p h p l c 制備分離純化菊苣酸標準對照品 于志強等1 5 5 利用正相高效液相半制備色譜制 備了新地質卟啉化合物 雷歷等 5 6 利用反相制備高效液相色譜結合溶劑萃取 大孔吸附樹脂柱色譜和葡聚糖凝膠l h 2 0 柱色譜方法 從管花肉蓯蓉的乙醇提 取物中純化制備了苯乙醇苷類化合物 松果菊苷的標準品 純度可達9 8 以 上 近幾年來 p h p l c 技術在制備高純度生物活性物質的方面有了長足的發(fā) 展 有關報道不斷出現 如h a t c h 等 5 7 1 對牛血清蛋白 鐵蛋白等進行了制備分 離 制備量達數百毫克 c i l d e n a s tt h o m a s 掣5 8 悃p h p l c 和半制備h p l c 從 人角質層脂肪中分離出神經酰胺單體 王學彤等 5 9 用反相高效液相色譜法分離 制備了魚油中的e p a 和d h a 周海歐等 6 0 用美國b e c k m a n3 4 4 m h p l c 進行 了鹿茸中多肽的分離制備 0 3 極譜和伏安法 極譜法是上世紀二十年代j 海洛夫斯基 h e y r o v s k y 6 l j 所創(chuàng)立的一種電 化學分析方法 基于可還原或可氧化物質在滴汞電極上進行電解的過程中 由于濃差極化而形成電流一電壓極化曲線 根據此曲線進行定性 定量 后 來 柯爾蜀夫 1 o 慫o 等1 6 2 把凡是使用微電極以電流一電壓曲線為基礎來研 究溶液組成的電化學分析方法統稱為 伏安法 6 塑堊奎蘭堡主蘭堡堡苧 笙絲絲 魚塑墊查塑堡塞鎏堡笪生堡壁塑盛坌坌塹 塑查旦翌壅 隨著當今世界科學技術的迅猛發(fā)展 對分析化學的靈敏度和分辨率提出 了更高的要求 各種儀器分析技術都得到了長足的發(fā)展 電化學方法也是如 此 近年來迅速發(fā)展 著廣為應用的極譜和伏安法新技術有 溶出伏安法 催化極譜法 交流極譜法 脈沖極譜法 半微分半積分極譜法 放射極譜法 等等 6 3 0 3 1 極譜和伏安法在微量元素分析測定中的應用 極譜和伏安法在微量元素分析測定中應用較多 1 9 8 9 年 李啟隆等 6 4 蝽0 用鉛 二甲酚橙絡合物的極譜行為對食糖中的鉛進行測定 發(fā)現在鉛濃度2 0 x 1 0 4 6 0 1 0 擊m o f l 范圍內 電流與濃度成線性關系 萬渝平 6 5 用示波極 譜法測定6 個不同茶葉樣品中的鉛含量 并與國標方法一雙硫腙比色法進行 對比實驗 結果表明該法準確可靠 與國標法相比無顯著差異 謝媚等 6 6 在 h c i 酒石酸 抗壞血酸體系中 用催化示波極譜法測定了皮蛋中微量鉛 在 此體系中 p b i i 于 0 5 4v 處產生一個非常靈敏的吸附催化波 鉛含量在 o 0 2 5 3 1 t g m l 范圍內波高與濃度呈良好的線性關系 相關系數 幻為0 9 9 7 6 檢測限為o 0 2 5 1 1 9 m l 費俊杰等 6 7 建立了用槲皮索修飾碳糊電極測定痕量鉛 的新方法 在0 1 0 m o l l 的甲酸鹽緩沖液 p h4 3 中 于 0 1 0 v v s s c e 攪拌 富集 再在 0 7 0v 靜止還原4 0 s 后 陽極化掃描 于 0 4 2 v 左右獲得一靈敏 的鉛陽極溶出峰 最佳條件下 富集不同時間 其二次導數峰電流與p b 2 在 1 0 x 1 0 8 8 0 1 0 7 m o l l 和2 0 l f f 9 6 o 1 0 8 m o l l 兩個濃度范圍內呈線 性關系 檢出限為8 0 1 0 o m o l l 徐澤民等 郁 采用示差脈沖陽極溶