西南大學碩士學位論文摘要 m p f 對精母細胞減數分裂調控作用的研究 臨床獸醫專業碩士研究生白汝嵐 指導教師張家驊教授 中文摘要 p f 即成熟促進因子( m a h m t i p 啪t 蚍缸參與了卵母細胞的減數分裂，但對于其在 精子發生過程所起的作用及機制目前還不清楚。本實驗旨在研究m p f 在精母細胞減數分裂中的作 用，為精子體外發生( i i i v i 帥甲燃鯽鼯i s ，s ) ，優化體外培養條件提供依據 為了闡明m p f 在小鼠精于發生不同階段的表達規律，本實驗采用不同發育時段小鼠睪丸，經消 化離心得到細胞懸液，通過流式細胞儀分析細胞倍性，同時利用免疫組化結合m p f 活性檢測，分析 了桔子生成的時相特征以及m f 活性與精子生成之間的相互關系。結果發現8 日齡、1 4 日齡小鼠 睪丸沒有單倍體出現，從1 8 日齡開始小鼠生精細胞單倍體開始出現，但比例很低，而四倍體增加達 峰值。免疫組化和f 活性檢測表明1 8 日齡小鼠睪丸f 兩亞基表達量高，而且m p f 活性也 處于較高水平以上結果表明：1 8 日齡小鼠睪丸生精細胞大多處于即將進入減數分裂的初級精母細 胞階段，m p f 活性最強，生精細胞發育時程與m p f 表達及活性情況一致。 為了進一步研究m p f 在精于生成中的作用，我們以1 8 d 小鼠睪丸為實驗材料，采用生精細胞與 支持細胞共培養體系，通過檢測細胞活性和m p f 活性，發現b li ( 丁酸內醋，b u t y m i t ci ) 抑 制m p f 活性的最佳濃度為o 6 8 “m o i ，l b 卜i 使混合培養體系中四倍體和單倍體比例下降，= 倍體 比例則有所提高，這表明m p f 對精母細胞第二次減數分裂有重要作用。 關鍵詞：m p f 精子發生減數分裂b l i 西南大學碩士學位論文a b s 婦c t r e s e a r c ho nt h er o l eo fm p f d u r i n gm e i o s i s i n m a l eg e r mc e l l s c l i l l i c a l 、，c t 甜n a up o s t 鏟a d u a t eb a ir u l a i l a d v i s e r z h a n g j i a j l u ap r o f c s s o r a b s t r a c t m p f ( 眥t i l i a 虹p r o m o t i i l gf a c t o r ) ，p a n i c i p a i ei nt i i em c i o s i so f0 0 _ c y t e s ，b u tt l l em l ea n dt h cc 0 咖i m e c h 衄i s mw c 豫n o td i s 如c t e d w ei n t d e dt or 部e a r c ht 1 1 er o l eo fm p f d u r i i i gi m i i si l l m l eg e n n c e l l sl l l o u g l lo 呱e 坤c r j 腓咄w l 正c hw o u l dp r o “d ca 他f e 啪t o s ( i n “咖印啪m t o g e m s i s ) 鋤d o p t i 】n i z et l l ec 講刪o no f c l l l t i i 咒i nv i 帥 ho r d e rt om 衄【l i n g t c 血ec x p 塢鯖i o n 心g i i l a r n yi nd i f r e 塒l tm l a 端o fs p 盯m 咖踟i sj i im i ，w b a q u 硼c e ns m p c n s i o n 衄t c s t e si nd j s t i n c td c v e l 叩m e n tp h a sb yd i g e g 曲g 柚dc 鋤硒如g i n g n 帥 鯽腳y 髓dc c up l o i d yb yf 1 0 wc ”o n 嵋t e i na d d i t i o na 皿l y 孺dt h c 陀l a n o 璐m p 腳i l gt h cp h a f b t u mo f g 帆e p o i e s i s ，n v i t yo fm 】p fa n dg o n 印o i e s i sb yi m m u n o h i s 妣h e i i l i c a lm e l l l o dc 鰍岫d i n gw 妯t l l c 山：t c c o no f h v i 啦t h e 鹋s i l l ts h o w e dt 1 1 a ti nr i l i c ea tt i ea 鏟o f 8d a y s d1 4d a y st i i c r ew n 0h 印l o i 4 w l l i c ha p ：砌丘o m1 8 d 。b u tv e r yf e w w h e nt e 唧i o i di n c 他鵲e dt op e a i c i i l g ，i i la d d i 6 t i i ee 砩嘴s s i o n o f t h e t w os 血礎a n dm c b v i t yo f m p fw e f ea t t i i eh 訕l e v e l o nm cw h o l e m “a t t i i e8 9 eo f l 8 幽y s ，m 儺to f 叩懾m 砷明胃f l i cc e l l sw e r ep r i m a ys p c 刪t o c y t e s t 1 1 e 踮石v i t yo f m p f w 越碡1 l i g i i t 瞄ta l l d t l l c 蛐no f d w c l 叩l m n tp l 粥c so f s p e 咖a t o g e n i c l l sc o i i d c dw i t t it l l ee x p 嗌s i 伽a n d d v i t y 坤s u l t o f m p f f o r a 托hi l l er o l eo fm p fi i is p e 忸t o g c n 髓i s ，w ed i s c o v e 陽dt 1 1 eb e s tb li ( b u t y m i 孔t o e i ) c 蚰c e n t r a t i o nt oi i l l l i b i t 越6 “t yo fm p fi so 6 8 p m o l ，l ，w 油m es u b j e c to f1 8 出y sm i c e ，媯協b i i i s h 崦 o o c u l n l r es y s 咖a n da m l y z i n gt h e 神b v i t i e so f c e l l s 卸dm p f a tm a tc 徹c e n 訂習血o n ，b lic 卸s c dt l l em l e d c c 佗器訪go ft e 扛謝o i d 鋤dh a p l o i d ，o nm ec o n 仃a r yt h er a t eo fd i p i o i di n c r e 鷂c d ，w h i c hi n d i c a t e d 咿fi s e s 陽n a it om e c o n dm c i o s i so f s p c r m a 協c y t e 1 “yw o r d s ：m p fs p e r m a t o g e n s i sm e i o s i sb l i n 獨創性聲明 本人提交的學位論文是在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果論文中引用他人已經 發表或出版過的研究成果，文中己加了特別標注對本研究及學位論文撰寫曾做出貢獻的老師、 朋友、同仁在文中作了明確說明并表示衷心感謝 學位論文作者：j 討奴磬 簽字日期：叉k 年多月1 日 學位論文版權使用授權書 本學位論文作者完全了解西南大學有關保留、使用學位論文的規定，有權保留并向國家有關部 門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權西南大學研究生院( 籌) 可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索可以采用影印、縮印或掃描等復 制手段保存、匯編學位論文 ( 保密的學位論文在解密后適用本授權書， 本論文：口不保密，口保密期限至年月止) 學位論文作者簽名：t 沿氙 簽字日期：0 越年月1 日 導師鮐辦坼 簽字日期：倆年；月，日 西南大學碩士學位論文 第一章文獻綜述 第一章文獻紼述 動物精子發生( 印m 【t o 鯽$ i s ) 是生命周期中的一個重要環節也是一個既有有絲分裂又有減 數分裂的高度復雜而有序的特殊細胞分化過程。輔子發生過程中減數分裂調節的分子機制已成為生 物學領域中一個重要的研究課題。從分子水平上研究初級精母細胞減數分裂能力的獲得及減數分裂 調節機制不僅可以豐富發育生物學、生殖生理和遺傳學的理論基礎而且對于實現精子體外發生( 加 v 曲v 叩即n a i o g c s i s s ) 、優化體外培養條件具有潛在的指導意義。m p f 作為細胞增殖重要的調 控因子，是探求初級精母細胞減數分裂調節機制釣重要環節，因此本文將闡述精于發生及m p f 的研 究現狀，分析各研究取得的進步及存在的不足，希望對相關領域研究提供一些參考。 l 精子發生的研究 1 1 精子體外培養的進展 1 9 2 0 年首次報道用血漿培養睪丸組織研究體外精子發生以來隨著對睪丸組織結構、各種細胞 的功能和精子體內發生過程的逐步認識以及體外培養技術的發展，睪丸未成熟生精細胞的體外培養 方法和技術也有了很大改進 1 1 1 早期研究成果 2 0 世紀2 0 年代至6 0 年代末取得了四方面成就：所設計的組織培養系能使生殖細胞進入減 數分裂前期：初級精母細胞能從細線前期向粗線期分化。在器官培養方面甩原始未分化的生殖 腺體外培養能產生性分化。 在含5 c 0 2 ( v ，) 的空氣、p h 值7 2 0 2 、溫度3 2 3 5 培養條件下， 改變培養基營養成分應用丙酮酸作為培養基能量底物，加入胎牛血清、氨基酸及維生素等類物質， 雄性生殖細胞體外培養結果較好【啦渤。用h 3 ( 氚) 胸腺嘧啶脫氧核苷m 3 皿r ) 作為放射性標記物， 跟蹤生殖細胞的分化過程為檢測生殖細胞的體外分化階段提供客觀依據。這些早期研究成果為后 來的研究者提供了可靠的方法即使在現階段仍具有重要意義 1 1 27 0 年代以后共培養( 。u l t u 舊的發展 2 0 世紀7 0 年代以后創立了模擬體內微環境的體外培養方法，即雄性生殖細胞和支持細胞的體 外共培養。共培養按其對支持細胞的營養供給方法分為非滲透性和滲透性支持物共培養兩種；按其 共培養的細胞種類分為同種支持細胞和異種非洲綠猴腎上皮細胞( v e 細胞) 共培養兩種。另外，對 生殖細胞分化的檢測方法也有很大改進。非滲透性支持物培養是將支持細胞置于非滲透性支持物上， 西南大學碩士學位論文 第一章文獻綜述 如塑料、玻璃培養皿等，培養成細胞單層后，再將生殖細胞直接種植在這一單層上共同培養。1 9 8 1 年，聒盯m n b a u m 等”】用此托培養方法研究支持細胞和生殖細胞間的相互作用，觀察到細線前期初 級精母細胞分化至粗線后期初級精母細胞。m a g l l c r 鎬b a 出s t o l l j 等1 5 l 用成年大鼠睪丸粗線期初級精 母細胞與2 0 d 齡大鼠的支持細胞共培養7 d ，約有l o 的粗線期初級精母細胞能發育成精子細胞。滲 透性支持物培養也稱雙室培養在普通培養皿內放置一個套皿套皿底部裝有微孔濾膜或生物材料 構成的滲透性薄膜使培養皿分隔為上下兩小室，培養液置于下室，當上室培養的支持細胞形成細 胞單層后，再將生殖細胞置于支持細胞單層上共培養。1 9 9 2 年，1 h s 等【6 1 改進了雙室培養的滲透膜， 用透明的細胞外基質( 膠原酶及粘多搪) 構成的聚合體作為滲透膜，可以在體外培養過程中觀察細胞的 形態變化。他們用此方法觀察到精原細胞擴增并分化至減數分裂前期；初級精母細胞發生減數分裂 分化；圓形精子細胞形成長形精子細胞，有結構正常的頂體、可活動的鞭毛。現代取室培養系的滲 透性薄膜采用聚乙烯對苯二酸o o l y 甜l y l e t c r 印h 1 a l a i c ，p e l r ) 膜，操作簡便培養的效果更為穩定、 可靠。：f o 細胞是異種的非整倍體細胞可分泌甘氨酸、丙氨酸、乳酸鹽、生長因子、可溶性因子 ( 如促有絲分裂因子) 等促進生殖細胞的發育、分化；同時去除培養環境中對生殖細胞發育不利的物質， 如重金屬二價暇i 離子、次黃嘌呤、代謝抑制因子等1 7 。l ，還能分泌體內精子發生所需的部分生長因子 與白介素。 1 1 3 細胞在體外存活及分化 c m d e s 等h 1 將人圓形精子細胞置于v c r o 細胞條件培養基中共培養5 d ，能使這些細胞進一步 發育成熟為長形精于細胞。s n 等【9 1 用非梗阻性無精子癥患者睪丸活檢的組織分離、純化。獲得初、 次級精母細胞與支持細胞，置于細胞條件培養基上共培養2 3 周，結果初、次級精母細胞經減 數分裂分化成圓形精子細胞這些圓形精子細胞進一步發育成熟為具有正常形態的躍形精于細胞 他們將這些接近成熟的長形精于細胞通過卵胞漿內單精子注射術( i c s i ) 注入人卵內，結果有囊胚形 成。這些精子細胞的受精率約3 1 3 8 ，但大多數已受精的胚胎未能發育到桑椹胚階段且伴有性 染色體異常。w e i s s 等m 川雙室培養取得比較好結果的同時，改進了生殖細胞發育的檢測方法：用 5 一溴_ 2 - 脫氧尿茁( b r d u ) 替代h 3 - t d r 作為胸苷類似物標記，跟蹤觀察生殖細胞的分化；應用p c r 技術檢測培養細胞特異性基岡表達的變化：編碼磷蛋白1 9 ( p 1 9 ) 和睪丸特異性組蛋白2 b ( t h 2 b ) 的 i i l r n a 特異性表達丁粗線期初級精母細胞編碼過渡蛋白1 f r p l ) 和過渡蛋白2 ( t p 2 ) 的m r n a 特異 性表達于圓形精子細胞在培養過程中定期檢測培養細胞中p 1 9 、t h 2 b 、t p l 、t p 2 的水平，觀察 p 1 9 ，r p l 、t h 2 b ，r p 2 的變化從而確定培養細胞分化、發育情況。這樣既可避免放射線對細胞發育 的影響，義能更準確地確定細胞分化的各個階段。 2 西南大學碩士學位論文第一章文獻綜述 1 1 4 器官培養和組織培養的發展 用器官和組織培養的方法研究雄性生殖細胞體外成熟過程的優點是保持睪丸原有的正常腔室結 構和生殖細胞與體細胞的相互聯系。器官培養是研究精原細胞分裂及其進入減數分裂前期調控機制 的很好的培養模型用。1 9 8 3 年，p a r v i n 等用透視微分離技術他d l l l i q u f 缸硼s i l l u m i m a 豁i s t 酣 l i l i 廿0 d i s s e c t i 徹汾離出某特定階段的生精小管片段，培養2 d 后大多數初級精母細胞完成了2 次減 數分裂，分化成精子細胞。2 0 0 0 年s k i u b 等【l w 進一步改進了組織培養的方法，將生精小管用酶消 化后得到的小管碎片置于雙室培養系中經3 周培養，細線期初級精母細胞分化為圓形精子細胞。 從而完成了完整的減數分裂階段的分化。同時，他們除用b r d u 標記和檢測培養細胞的特異性基因 t p l 、t p 2 外，還用光、電鏡觀察培養細胞的超微結構變化，用流式細胞儀分析培養細胞的倍體變化 發現培養得到的耩子細胞發生時程和形態與體內相應生理情況下一致。 1 1 5 未成熟生精細胞體外培養的研究在輔助生殖上的應用 男性不育癥患者中約l 由無精子癥引起。非梗阻性無精子癥的病因主要是發生在減數分裂階 段的初級精母細胞發育阻滯，以往臨床對這類患者缺乏有效治療方法。近年來。i c s i 、圓形精子細 胞注射術u i l ds p e m 撕d 蜘e c t i o n ，r o s i ) 、長形精子細胞注射術( c l g a t c ds p e m t i d 嘶t i o n ，e l s d 已獲得成功( 1 4 f 6 】。1 e 謾等用阻滯于初級精母細胞階段的生精細胞在體外培養為精子細胞，顯微 注射人卵子內，獲妊娠成功產卜，發育正常的雙胞胎嬰兒。為無精子癥和弱精于癥患者的治療提供 了新的方法。 1 1 6 存在的問題與展望 雖然近年來已有精母細胞實現體外完成兩次減數分裂的報道”。但目前整個成功率還很低 i i ，”，如體外培養初情期前w i s i a r 人鼠睪丸精曲小管片段3 d ，只有6 2 的減數分裂前期的初級精 母細胞在體外完成兩次減數分裂到達精細胞階段1 2 ”。也有研究表明，體外精于發生的速度比體內快 得多，產生的配子在形態上也有異常2 ”。而要提高體外精子培養的成功率，還有賴丁從分子水平上 深入了解精子發生尤其是減數分裂完成的調控機制。 1 2 精子發生的調控元件 哺乳動物配子發生是研究細胞周期調牡的重要平臺。哺乳動物生殖細胞周期包括有絲分裂及減 數分裂，關于其調控基因現已被證明，包括激酶復合物、磷酸酶、調解蛋白及相應的底物。作為生 命周期的重要環節，雄性精子發生過程的分子調控機制近年來已成為生物學領域中一個重要的研究 課題。因此以卜就雄性哺乳動物細胞周期幾種關鍵調控因子進行綜述。 西南大學碩+ 學位論文第一章文獻綜述 哺乳動物配子發生是個十分復雜的過程，既包括有絲分裂義含有減數分裂，因而是研究細胞周 期調節的重要對象。已有的研究表明， m 期促進因子( m p h a p 塒n o t i n gf k t o f ，m p 即是有絲分裂和 減數分裂的關鍵控制因子1 9 7 1 年m 酗u i ，m a r k c n 首次在青蛙中發現，m p f 作為激活劑引起卵母 細胞g v b d ( g e n 曲lv e s i c l eb r e a l 【d o w n ) 并恢復減數分裂【“，是由催化業基絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶 c d k l ( 周期蛋白依賴性激酶l c ”l i n _ d e p e n d e n tk i n e b 1 ) 以及調節亞基c ”l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 構成的異源二聚體【2 4 l ，物種問具有高度保守性。高等真核生物細胞周期的控制位點在簡單有機體中 不存在且細胞的發育及組織起源也有差異。例如，哺乳動物卵母細胞存在唯一的細胞周期控制點： 進入減數分裂的信號與酵母不同，且在減數分裂雙線期及mi i 期有停滯。精母細胞也有些相似的控 制位點，只是沒有明顯的停滯，因此這些控制位點很可能存在與迄今研究的酵母不同的特殊基因調 控因子。 1 2 1 有絲分裂調控位點及調控元件 哺乳動物有絲分裂細胞周期根據轉換順序可以分為四個階段，包括d n a 合成的s 期、完成有 絲分裂的m 期及兩個間期g l 和g 2 期。這些階段的進行是一系列酶的作用結果，而這些酶的激活 也是被高度控制的。g 1 ，s 及g 2 ，m 轉換期的調控位點確保了這些階段的適時發生。促進有絲分裂進 程的主要酶包括調節弧基周期蛋白c ”l i n 及催化亞基周期依賴蛋白激酶c d l ( ( c y c l i n d 印e n d e m k i l l 髂e ) 。從酵母到人類的多種有機體中c ”l i m 的氨基酸具有同源性，與酵母細胞周期蛋白突變體的 功能互補。高等脊椎動物的c y c l i n s 至少可以分為八個等級，即c ”l i r a c y c l i n h 【”l 。哺乳動物系統 的復雜性不僅是由于c y c l i n s 的等級多，而且a 一、b 及d 型c y c l i i i 家族成員也很復雜。盡管它們在 哺乳動物生殖細胞發育中功能的研究還剛剛開始但是一些實驗結果發現在雄性、雌性動物生殖細 胞及去勢動物體細胞層中各種c ”1 i n s 表現了不同的表達模式，如1 9 9 6 年c h a p m a n 和w o l g e m u 廿1 實驗證明，處于減數分裂期的生殖細胞與未分化的體細胞區別來源丁兩種b 刪c y c l i m ( c ”l i n b l ，c y c i i n b 2 兩r n a 表達時間的籌異怛“。 c d k 是絲氨酸，蘇氨酸激酶家旅的成員這些成員具有相同的保守催化區及磷酸化位點。在哺乳 動物細胞中的c d k 最少有9 種，并與不同的c ”l i n 配對。對c y c l i n 的選擇可能影響復合物的酶活 性及作f i 底物口”。 有絲分裂細胞周期中，激活信號傳導途徑的d n a 一旦籀生結構損壞、復制錯誤或折營錯誤均可 引起細胞g l s 、g 2 m 及中后期阻滯。日 i 研究發現延長o l s 轉變期有兩個細胞周期調控點這 兩個調控點也作用于c d l ( 2 的活化。晟初是由于c d c 2 5 a 的降解引起c d l c 2 的抑制2 ”。而p 2 1 的p ”依 賴產物則使該轉變j l l 繼續拖延該產物可結臺并阻i pc d l 【2 ，c y c “n e 復合物的活化【。g 2 ，m 期阻滯 是由于阻礙了m p f ( c d k l ，c y c l i n b l ) 的去磷酸化阻i r 蛋白激酶c 1 1 l 【l 的活化可引起c d c 2 5 c 的抑制， 在酵母及人體中都證明c l l i c l 是m p f 抑制的土要機制”m ”j 。紡錘體控制位點的活化發生在中后轉變 期，在該點微管接觸著絲點并拉伸使染色體適當排列t | 亓才允許細胞進入后期。在缺乏控制位點活化 4 兩南人學碩十學位論文第一章文獻綜述 和蛋白降解的情況f ，紡錘體控制位點的組成部分抑制a p c 活化可使姐妹染色單體分離結求有絲分 裂o ”。 1 2 2 減數分裂的調控 一些實驗結果證明減數分裂細胞周期也存在著控制點但這些研究主要是在酵母中進行的。酵 母由于染色體聯會不完全及重組而在減數分裂前期的粗線期發生停滯p ”。實驗發現減數分裂前期一 旦發生缺陷后細胞將不能進入mi 期，據此可推測哺乳動物可能存在相似的控制點。缺乏重組基因、 d 1 q a 修復基因或細胞周期調控因子基因的雄性小鼠出現前期染色體聯會或重組缺陷，最后與酵母結 果不同的是這直接導致了細胞凋亡。而細胞停滯在前期的不同階段也說明控制點不止一個。1 9 9 9 年 s c h w a r t zd ，g o l d f m g 日n 等通過低水平輻射使初級精母細胞表現為g 2 期延遲而缺乏p ”的初級精 母細胞卻沒有發生，證明了p ”延遲g 2 期的作用1 3 ”。果蠅實驗證明紡錘體控制點可能也在初級精母 細胞減數分裂中活化。用秋水仙素處理或含有不對稱同源染色體的初級精母細胞會延遲進入后期p ”。 由于兩性配子發生過程存在差異，所以人們推斷雄性哺乳動物細胞周期存在特殊的調控物質。 哺乳動物存在兩種a 型c y c “m c y c l i n a l 兒乎只存在于雄性動物生殖細胞中而c y c i i i i a 2 卻廣泛 表達p q 。實驗證明c y c l i i l a 2 可以促進g l s 、g 2 ，l 期轉變，c y c l i n a 2 缺乏小鼠導致甲期胚胎死亡。 通過c y c l i n a l 基因突變實驗證明其對精母細胞進入m l 期有重要作h j 。 通過原位雜交分析及免疫組織化學分析法人們發現，c y c h na l 的m r n a 及蛋白質表達在粗線 期后期急劇升高，而當第一次減數分裂結束時義降低到兒乎消失。所以可推測c y c l i n a l 的表達可能 調控細胞周期p 1 。而c y c l i na 2 的m r n a 與蛋白質表達水平的高峰則出現在處于有絲分裂階段的生 殖千細胞、精原細胞、前細線期精母細胞及減數分裂前d n a 合成期的細胞p 6 l ，此外c y c l i na 2 還在 s e r l o l i 細胞中表達。在卵巢和卵母細胞中均朱發現c y c l j n a l 的i i l r n a ，不過在成年9 日巢、體細胞及 生殖細胞中發現了c y c l i n a 2 的表達。似乎可以證明c y c l i n a l 在雄性生殖細胞中的特異性表達。 1 9 9 8 年“u n 等將c y c l m a l 基岡定向突變得到c y c i i n a l 缺失小鼠，該鼠精子發生過程停滯住 第一次減數分裂前期而導致不育，且生殖細胞凋亡數趨增多細胞聯會消失或畸形c d l 【l 及c ”i i nb l 水平正常，但m p f 明顯減少p ”。從而證明了c ”l i n a l 對精母細胞進入第一次減數分裂的重要性。 l i u n 等對c y c i i n a l 缺失小鼠使川o a 結果m p f 恢復活性細胞染色體濃縮并進入減數分裂期， c d c 2 5 蛋白高度磷酸化證明c ”l ma l 是m p f 活化的前提。相反通過釩酸鹽抑制0 a ，從而進一步 抑制減數分裂恢復。c d c 2 5 a 及c d c 2 5 c 的表達高峰出現在減數分裂前期蛋白激酶復合物包括c v c l i n a l 及c d k l 或c d k 2 可以使c e c 2 5 a 和c d c 2 5 c 發生磷酸化。上述實驗證明在正常的雄性生殖細胞中 c y c l i na 1 參與調控其它蛋白激酶或磷酸酯酶使細胞完成g 2 m 期轉變，此外還可能通過激活c d c 2 5 磷酸酶而直接與m p f 擴增相芙聯。 5 西南人學碩十學位論文第一章文獻綜述 2m p f 的研究 2 1m p f 的研究進展 m p f 。即成熟促進因子( n 壕t u 隨t i o np m m 嘶n gf a c i o r ) 或m 期促進因子( m p h a 辯p m m o t i l l g 丘i c t 盯) ， 或細胞促分裂因子( 嘶t o s i s _ p m m n n g f h c i o r ) 。m p f 晟早發現并被命名于2 0 世紀7 0 年代初期。近期的 工作不僅逐步鑒定了m p f 的構成，同時也證明了其在細胞周期調控中的重要作用。 1 9 7 0 年，j o h n s o n 和r 將h e l a 細胞同步化，然后將m 期細胞與其他間期細胞在仙臺病毒介導下 融合，并繼續培養。他們發現，與m 期細胞融合的間期細胞發生了形態各異的染色體凝集。并稱之 為染色體超前凝集0 m t i l r ec t i m m o m ec o n d e m a t i o n ，p c c ) 。此種染色體則稱為超前凝集染色體。 不同時期的間期細胞與m 期細胞融合，產生的p c c 的形態各不相同。g l 期p c c 為單線狀s 期p c c 為 粉末狀，g 2 期p c c 為雙線染色體狀。p c c 的這種形態變化可能與d n a 復制狀態有關。染色體超前凝 集在其它細胞中也被證明。m 期細胞可以誘導p c c ，提示在m 期細胞中可能存在一種誘導染色體凝集 的因子，稱為細胞促分裂因子p ”。 1 9 7 1 年，m a i 和m a r k e r t 用非洲爪蟾卵做試驗，明確提出了m p f 這一概念。非洲爪蟾卵細胞發 育過程可以分為6 個階段，即第1 、i l 、i i l 、v 和期。第1 至第期為卵母細胞生成和生長階 段。第期卵母細胞達到一定體積，停j 卜生長，等待成熟。此時的卵母細胞處于第一次減數分裂期 前期階段，含有一個體積較大的細胞核，稱為( g e m i m lv e s i d e ，g v ) 。卵母細胞成熟需要雌性激素孕 酮的刺激。在孕酮作用卜- ，卵母細胞向v 和期轉化。生發泡破裂( g vb m k d o w n ，g v b d ) ，染色 體凝集，進行第一次減數分裂；然后立即進行第二次減數分裂并停留在分裂中期，即成熟的卵細 胞( 第期卵細胞) 。卵母細胞受精厲形成受精卵。很快便開始卵裂。m a s u 諦i m a r i 【e nj ；i 解剖方法 分離第期卵母細胞，并_ i j 孕酮進行體外刺激誘導卵母細胞成熟形成卵細胞，再將目日細胞的細 胞質注射到其它卵母細胞中，可以誘導后者成熟：再將日q 被誘導成熟的卵母細胞的少量細胞質注射 到另一些新的卵母細胞中，仍然可以誘導卵母細胞成熟。因而他們認為在成熟卵母細胞的細胞質 中，必然有一種物質可以誘導卵母細胞成熟。他們將這種物質稱作促成熟因子即m pf l 。 進一步研究發現仆j 孕酮誘導卵母細胞成熟卵母細胞需要進行一定群度的蛋白質合成。在有 蛋白質合成抑制荊存在的情況f ，孕酮不能誘導目目母細胞成熟。成熟卵母細胞的細胞質誘導卵母細 胞成熟，則不需要蛋向質合成：在蚩n 質合成抑制中m p f 已經存住，只是處】：1 f 活性狀態，被稱 為前體m p f ( p m p f ) 。1 f 活性態的前體m p f 通過翻譯后修飾，可以轉化為活性態的m p f 【”】。 m p f 被發現以后不少學者便著手m p f 的純化j = 作，但一直進展緩慢，直到1 9 8 8 年，才取得突 破性進展。1 9 8 8 年，m a i l e r 實驗室的l o h k a 等人以非洲爪蟾為材料，分離獲得了微克級的純化m p 一”1 井證明其主要含有c d l c l ( 周期蛋白依賴性激酶1 ) 手c y c l i nb l ( 周期蛋白b 1 ) 兩種蛋白。這兩種蛋 白結合后可以使多種蚩向質底物磷酸化畢現蛋白激酶活性。 6 兩南大學碩十學位論文第一章文獻綜述 土1 1 細胞周期蛋白c y c s 的特點及作用 細胞周期蛋白( c y d l i n s ) 的特點包括：周期蛋白具有一段相當保守的氨基酸序列介導周期蛋 白與c d k 結合，稱為周期蛋白框；m 期周期蛋向近n 端含有一個由9 個氨基酸構成的特殊序列，參 與泛素介導的周期蛋白a 和b 的降解，稱為破壞框 l g l 期周期蛋白不含破壞框，但其c 端有一段特 殊序列與g l 期周期蛋白更新有關；不同的周期蛋白框識別不同的c d k ，形成不同的c y c l j l l s d k 復合物，表現出不同的c d k 活性；周期蛋白濃度隨細胞周期進程變化而變化。周期蛋白的作用包 括：激活c d k ，引導c d k 作用丁不同底物：不同的周期蛋白在細胞周期的不同時期表達，并與 不同的c d k 結合，調節不同的c d k 的活性。 2 1 2 細胞周期蛋白依贛性激酶c d k 的結構特點及作用 細胞周期蛋白依賴性激酶( c y c l i n _ d e p d tp r o l e i nk i n m ，c d k ) 的結構特點有；靠近蛋白質n 端 的氨基酸序列為a r p 結合所需，其后是一小段p s l ai r e 結構域( 根據氨基酸單字母代碼命名) ，該結構 域參與結合細胞周期蛋白稱為周期蛋白結合結構域：具有柔性結構域也稱t 環。它可阻擋蚩白質 底物結合位點，抑制蛋白激酶活性也可移到一邊暴露底物結合位點使底物磷酸化。只有t 環中某一 特定的蘇氨酸殘基磷酸化以后周期蛋白激酶才能保持活性狀態。有活性的c d k 唯一的功能是使其 他蛋白磷酸化即起到蛋白激酶的作_ j 。 2 1 3 細胞周期蛋白依賴性激酶c d k 活性的調節 c d k 的活性狀態直接影響刨細胞刷期的進程，因此影響其活性的岡素對細胞周期運轉有1 f 常重 要的影響。 2 1 3 1 細胞周期蛋白的濃度 細胞周期的不同時相中，彳不同的細胞周期蛋白基因被轉錄。當細胞周期蛋白存在丁胞內時， 它與c d k 結合，導致催化弧基構象發生重人變化。各種c y c l i n s - c d k 復合體的x 射線晶體衍射結構顯 示當細胞周期蛋白結合劍c d k 上時，c d k 多肽鏈易彎曲的環( t i o o p ) 遠離酶活性位點的入口，使 c d k 可以活化其它蛋白底物。 2 1 3 2 細胞周期蛋白依賴性激酶的磷酸化狀態 細胞周期蛋白與c d k 的結臺對c d k 的激活是必需的。但c d k 砸基上關鍵的蘇氨酸殘基也必須被 磷酸化，才能雖終激活c d k 。該磷酸化過樣需要另一蛋向激酶參與，c d k 激活激酶( c a k ) 。在裂殖酵 兩南大學碩 一學位論文第一章文獻綜述 母細胞中c d k 即c d c 2 分子中1 1 i r l 6 l 的磷酸化使c d c 2 被激活，而1 1 5 殘基的磷酸化卻抑制該酶的活 性。同時，w e e l 激酶和c d c 2 5 磷酸酶參與此調節過程。w e e l 激酶通過加強抑制磷酸基團使c d c 2 失活。 c d c 2 酶一直保持失活，直到g 2 期末，由c d c 2 5 磷酸酶切除1 1 l r l 5 殘基上的磷酸基，使c d c 2 恢復活性。驅動 酵母細胞進入有絲分裂。w 曲l 和c d c 2 5 活性之間的平衡由其他激酶和磷酸酶調控。一系列酶參與調節 c d k 的激活和抑制，可以提供許多靶點，以便來自細胞內外的信息能改變細胞周期的進程。 2 1 3 3 細胞周期蛋白依贛性激酶抑制因子 c d k 的活性可以由各種抑制因子阻斷例如在芽殖酵母中，一種稱為s i c l 的蛋白作為g l 期c d k 抑制因子。s i c l 的降解使細胞中的c y c y i n s c d k 起動d n a 復制。 2 1 3 4 受調控的蛋白水解 細胞周期蛋白的濃度在每一細胞周期中起伏變化并因此導致c d k 的活性變化。而在細胞周期的 不同時刻，細胞周期蛋白和其它重要蛋白的濃度的變化，是細胞通過調節各種蛋白的合成或分解速 率來完成的。細胞周期中有兩類多基復臺體參與蛋白質的降解一類為s 1 ( p l - c u l li n f 盒蛋白 ( s c f ) 復合體，另一類是后期促進復合體( a p c ) 。s c f 復臺體可能作_ i 于整個細胞周期，介導0 l 期 細胞周期蛋白、c d k 抑制因子和其它周期蛋自的降解。這些需要降解的蛋白首先被調節細胞周期的 激酶磷酸化，為s c f 的結合提供靶點，使s c f 結合而降解蛋白質。s c f 的突變可抑制s c f 介導重要蛋 白降解使細胞周期不能正常進行。如g l 細胞周期蛋白和上述的s i c l 抑制因子若不能水解，則阻l t 細胞復制d n a 。a p c 復合體即后期促進復合體，在有絲分裂期即m 期中起作用，降解許多重要的有 絲分裂蛋白如有絲分裂細胞周期蛋白，使細胞脫離有絲分裂，進入新的細胞周期。此外，泛素蚩白 一蛋白酶體途徑( u p p ) 也是調節細胞周期蛋白的土要環竹。首先，泛素是u p p 中介導蛋白質水解的物質， 是一個由7 6 個氨基酸構成的保守蛋向。參與蛋白質多泛素化的酶土要有三種：e l 稱作泛素蛋白活化 酶，作川是將泛素蛋白的羧基端與e l 的t 胱氪酸殘基通過硫脂鍵相連激活泛素蛋白。e 2 稱為泛素蛋 向綴合酶，作用是將泛素蛋白從e l 轉至e 2 。e 3 稱作泛素蛋白連接酶也稱促后期復合物( a p c ) 作 _ f 是與e 2 一起將泛素蚩白連接劍需要降解的周期蛋白上。使周期蛋白多泛素化，進而被蛋白酶快速 降解。其次a p c 激發e 2 泛素蛋向復合物與有絲分裂細胞周期蛋白n 端的破壞框結合。然后激發泛素 蛋向質同破壞框c 端的賴氨酸殘基結合，此過程不斷循環使細胞周期蛋白多泛素化。通過基因操作構 建了不含破壞框的細胞周期蛋白結聚這些蛋白質不能降解，說明蛋閂質的泛素化對蛋白質的降解 是必要的。由于a p c 的作用，m 剮周l l j 】蛋白被降解，使細胞退出有絲分裂，進入卜一個周期。與細 胞周期相關的許多蛋白質都是通過泛素調節的過程降解使其濃度出現周期性變化，保證在正確的 時間和空間上執行功能，使細胞周期止常地運轉。 西南人學碩十學位論文第一章文獻綜述 2 2m p f 對卵母細胞減數分裂調控作用的研究 卵母細胞成熟的調控機制是近年來國內外科學工作者研究較多的問題，隨著現代分子生物學基 礎理論和技術的發展，對于卵母細胞成熟調控機制的研究逐步深入，取得了許多重大成果和突破性 進展。 m p f 對卵母細胞周期的調節機制在無脊椎動物如海星和低等脊椎動物如爪蟾中報道較多，而 在哺乳動物中研究較少。將豬和牛的c o c s ( c u m u l u s 0 0 c y t ec 叩1 e x e s ) 細胞培養于t c m l 9 9 培養基 中，牛卵母細胞共培養2 4 h ，豬卵母細胞共培養4 8 h ，每隔l h 從培養基中取出部分卵母細胞做m p f 和 m a p k 活性檢測。m p f 的活性水平通過測定組蛋白h l 激酶的活性來確定，m a p k 的活性水平通過髓 鞘堿性蛋白( m y c l i n b a s i c p r o t e i n ) 來確定。結果是兩種卵母細胞在培養過程中m p f 均出現兩次高峰， 這兩次活性高峰是與兩次分裂中期( m e t a p h e s ) 相對應的。豬卵母細胞m p f 活性高峰出現在培養后 2 7 3 2 h 之間和4 6 h 之后牛卵母細胞m p f 活性高峰出現在b 9 h 之間和2 2 h 之后。豬卵母細胞在3 3 - 3 s h 之間、牛卵母細胞在1 9 h 之后出現了短暫的m p f 活性降低，這與后期i ( a p h a i ) 和末期i ( t e l 印l l a i ) 相對應。m a p k 的活性在整個培養過程中逐漸升高，豬卵母細胞在培養4 7 h 后m a p k 活 性達到晟高水平，牛卵母細胞中m a p k 活性晟高值出現在培養2 2 h 后i 蚰l 。郭澤坤等人通過w b s c 鋤雜 交檢測了小鼠卵母細胞體外成熟過程中c d l c l 磷酸化的變化。h j 抗c d l c l 的c 末端抗體雜交結果顯示小 鼠卵母細胞體外成熟過程中c d l 【1 表現為上、中、- 卜二條帶，其中中帶在4 h 出現井持續增加直到培 養1 6 h ，在2 0 h 有一個下降趨勢并在培養2 4 h 義i 亓i 升。用特異性識別c d l c l 去磷酸化的t y r - 1 5 和n * 1 4 的抗c d l c l n 末端抗體雜交，結果證明其中帶為c 血l 在b - 1 5 和1 1 * 1 4 上去磷酸化的形式1 4 “。牛卵母細胞 m p f 澈活和m a p k 的激活幾乎與g v b d 的同時發生。而在豬的卵母細胞中m a p k 的激活出現在m p f 激活和g v b d 之前l 帥) 。培養朱成年和成年羊卵母細胞，發育至mi j 的卵母細胞比例相似，但未成年 羊發育至m i i 期的卵母細胞由于m p f 水平低不能誘發其它f 日母細胞發生g v b d ，而成年羊則可以1 4 “。 通常認為c y c l i nb l 降解是m p f 失活的直接原閃，但近年來的研究結果對此義提出了一些異議。小鼠 卵母細胞中m p f 的失活以致丁i 發生第一次胚胎有縫分裂不僅儀是w 為細胞周期蛋白b 1 的降解，同 時也受c d k l 去磷酸化的調控【4 ”。卵母細胞離開m 期進入間期的影響岡素很多，近期發現c a m p - p i ( a 通路在周蚶j 蛋白? 降解和向間期轉變中發揮著重要作圳一l 。 2 3m p f 對精母細胞減數分裂調控作用的研究 在精子發生過程過程中m p f 的兩個程基是細胞生k 的重要調控閃子。2 0 0 0 年g 0 d c t 等通過實 驗發現，小鼠睪丸細胞減數分裂g 2 ，m 期的轉換與高水平的c y c l i nb l 和c d k l 出現，并進步導致 i | i 的m p f 活性直接相關”。2 0 0 3 年m u r i e l l eg o d e t ，a m ed a m e s f o y 通過使用一種m p f 有效抑制劑 m s c o v i t i n e 第一次實驗證明了c d k 與雄性生殖細胞第二次減數分裂的相天性l 拍l 。上述實驗說明生 精細胞減數分裂的全過程都離不開m p f 的活化。不過劍現在為l r 還沒有證據證明直接抑制m p f 9 西南人學碩士學位論文第一章文獻綜述 活化會阻斷精原細胞g 2 ，m 的轉變，囚此不能排除有其他信號通路存在的可能性。 2 4 卵母細胞及精母細胞成熟過程中m p f 與m a p k 的相互關系 除c y c l i 和c d k 之外，還有其它途徑同樣對細胞周期調控起重要作用，如m a p k ( m 砧g e n a c t i v a t e dp m t e i i ik i n a ，促分裂原活化蛋白激酶) 。自從1 9 9 3 年關于其參與哺乳動物卵母細 胞功能性調節的第一篇報道問世以來，越來越多的人把實驗重點放到了m a p k 對動物生殖細胞的調 控作用上。研究證實，m a p k 在卵母細胞成熟、m i i 期停滯、受精后精核轉化及原核形成等方面均發 揮重要的作用。在調節微管組裝p 去組裝和核膜破裂p 重建方面的作用尤為重要即】。一般認為卵母細胞 成熟過程中微管和染色體的行為是由m a p k 而不是m p f 調節的。在小鼠、大鼠和山羊卵母細胞中 m a p k 的激活要比m p f 的激活晚2 個小時，它不參與減數分裂啟動，只與微管和染色體的組織變化 有關。而對于一些人動物如豬、牛、馬等，m a p k 在g v b d 時被磷酸化而被激活，證明m a p k 在卵母 細胞成熟啟動時起著極重要的作用。以前