中山大學碩士學位論文 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制備方法研究 專業：有機化學 碩士生：莫凌霄 指導老師：蔡繼文教授 摘要 本實驗以一種提取自植物果實的甜味蛋白質t h a u m a t i n 作為研究對象，對其 進行基礎的晶體學研究。同時在前人對甜味蛋白機理的研究成果上，希望通過共 結晶法制備對t h a u m a t i n 甜味有影響的幾種鹽和蛋白質的共結晶物，以研究甜味 蛋白的致甜機理。 研究重點集中在蛋白質晶體生長影響因素和晶體重原子衍生物的制備上。尋 找蛋白質晶體生長的優化條件一直是晶體生長工作者的目標，雖然不同的蛋白質 有著不同的生長條件，很難提出一個適合所有蛋白質晶體生長的條件，但是我們 可以通過研究一些常見因素對某種蛋白質晶體生長的影響來為其他蛋白質晶體 生長的研究提供一些經驗指導。對于t h a u m a t i n 晶體重原子衍生物的研究并不多， 在已有研究中沒有發現有關金屬離子在t h a u m a t i n 蛋白晶體中結合位點的報道。 制備重原子衍生物一方面可以研究重原子與蛋白質的結合位點，另一方面常被用 來解析未知蛋白質的結構。 在對晶體生長影響因素的研究中，我們用懸滴法通過觀察、對比不同條件下 晶體的生長情況，得到主要的影響因素以及每種因素對晶體生長的影響規律。主 要考察因素為溫度( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白質溶液濃度( 4 0 m g m l 和2 0 m g m l ) ， 沉淀劑濃度( 包括酒石酸鈉鉀鹽和乙二醇) 、懸滴中蛋白質溶液和池液比例 ( 3 p l ：2 t t l 和2 l ：2 此) 。研究手段為顯微鏡法觀察懸滴中溶液狀態及晶體生長 情況，用x 射線衍射實驗的方法來對晶體進行表征。 在重原子衍生物制備研究中，我們采用浸泡法來制備衍生物。同時由于s a d 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制備方法研究 結構解析法的種種優點，我們也嘗試用新報道過的碘擴散法來制備可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并嘗試了用于s a d 法數據收集方法。 最終我們在所研究的4 種影響因素中找到了主要影響因素及其影響規律。得 到了高質量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 單晶，并且在可重復制備蛋白質晶體的 基礎上用碘擴散法得到了晶體的碘原子衍生物。 關鍵詞：甜味蛋白，晶體結構，s a d 法，碘原子衍生物 中山大學碩士學位論文 s t u d i e so nt h ec r y s t a l g r o w t ho ft h es w e e tp r o t e i n t h a u m a t i na n dt h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so ft h eh e a v y a t o md e r i v a t i v e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l i n g x i a om o s u p e r v i s o r ：p r o f j i w e nc a i a b s t r a c t w et a r g e to nt h es w e e tp r o t e i nt h a u m a t i nw h i c hi se x t r a c t e df r o mt h ef r u i to fo n e a f r i c a np l a n t7 ，婦“肋c c l 齬d a n i e l l i it os t u d yo nt h ef u n d a m e n t a lc r y s t a l l o g r a p h y m e t h o d s t og e tab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h es w e e tm e c h a n i s m , w ea l s o 廿i e dt o o b t a i nt h e 眥r y s t a l so f s w e e tp r o t e i na n dt h ec o m p o u n d sw h i c h 撒r e p o r t e dt oa f f e c t t h es w e e td e n s i t yo f t h a u m a t i n o u rs t u d yf o c u s e do nt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h eg r o w t ho fp r o t e i nc r y s t a l s ，a sw e l la s t h e p r e p a r a t i o nm e t h o d so fh e a v ya t o md e r i v a t i v e s a sw e a i l k n o w , t h e c r y s t a l l o g r o p h i e ra l w a y sw a n t e dt of i n do u tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rp r o t e i n c r y s t a lg r o w t h d i f f e r e n tp r o t e i n sm a yh a v ed i f f e r e n tg r o w t hc o n d i t i o n s ，a n di t s i m p o s s i b l et of i n do u tag e n e r a lc r y s t a l l i z i n gc o n d i t i o ns u i t e df o ra l lp r o t e i n s o u r s t u d yo nt h e f a c t o r sa f f e c t i n gac e r t a i np r o t e i nm a ys o m e h o wo f f e ru ss o m e e x p e r i e n c e so no t h e rp r o t e i n s c r y s t a lg r o w t h b yn o w , t h e r ei sl i t t l es t u d yn e i t h e ro n t h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e s , n o r0 1 1t h em e t a lb i n d i n gs i t ei nt h ec r y s t a l so f t h a u m a t i n s ot h es t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no f h e a v ya t o md e r i v a t i v e sw h i c hc o u l ds h o wt h ed e t a i l i n f o r m a t i o no nt h ec o r r e s p o n d i n gb i n d i n gs i t e so ft h ep r o t e i nm i g h th e l pu sf i g u r eo u t t h es w e e tm e c h a n i s m 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制備方法研究 b ys t u d y i n gt h ea f f e c t e df a c t o r si nt h ep r o t e i nc r y s m lg r o w t h ，w ec o m p a r e dt h e p h e n o m e n o ni np r o t e i nd r o p su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n su s i n gt h eh a n g i n gd r o p d i f f u s i n gm e t h o dt of i n do u tt h ek e yf a c t o r sa n dt h er u l e sb yw h i c ht h e ya f f e c t e dt h e c r y s t a lg r o w t h f o u rf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e da t2 7 7 ka n d2 9 3 k ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i ns o l u t i o n f o r4 0 m g m la n d2 0 m g m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r e c i p i t a t e s i n c l u d i n gs o d i u mp o t a s s i u mt a r t r a t ea n dg l y c o l ，a n dt h ep r o p o r t i o no fp r o t e i ns o l u t i o n a n dw e l ls o l u t i o n t h em i c r o s c o p ew a su s e dt ow a t c ht h ep h e n o m e n o ni nt h e d r o pa n d t h ec r y s t a lg r o w i n gs i t u a t i o n ，a n dt h ec r y s t a l sw e r ec h a r a c t e r i z e db yt h ex r a y d i f f r a c t i o na n a l y s i s 。 i nt h es t u d yo ft h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e sp r e p a r a t i o n ，s o a k i n gm e t h o dw a su s e dt o p r e p a r et h ed e r i v a t i v e s w ea l s ot r i e dt h en o v e lm e t h o dc a l l e dv a p o ri o d i n el a b e l m e t h o dt oo b t a i nt h ei o d i n ed e r i v a t i v e s ，b e c a u s et h i sk i n do fd e r i v a t i v e sc a nh e a p p l i e di ns i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o nt os o l v et h ep h a s ep r o b l e m f i n a l l y , w ef o u n do u tt h ek e yf a c t o r so ft h ef o u ri n v e s t i g a t e do n e sa n dt h ep a t t e r n s t h e ya f f e c t e d f o l l o w i n gt h ep a r e m s ，w eo b t a i n e dh i g hq u a l i t yc r y s t a l sw h i c h d i f f r a c t e dw e l li nx r a yd i f f r a c t i o ne x p e r i m e n t s b e s i d e s ，t h ei o d i n ed e r i v a t i v e sw e r e p r e p a r e ds u c c e s s f u l l yb yt h ev a p o ri o d i n el a b e lm e t h o d k e y w o r d s ：s w e e tp r o t e i nt h a u m a t i n ，c r y s t a ls t r u c t u r e ，s i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o n ( s a d ) m e t h o d , i o d i n ed e r i v a t i v e s 中山大學碩士學位論文 第1 章緒論 1 1蛋白質結構研究背景 1 1 1蛋白質結構研究及其研究方法的發展 了解蛋白質的三維結構及其與功能的關系現在已經成為科學研究的前沿。這 是由于生物大分子( 蛋白質、多肽、核酸等) 以及其復合物參與了生物體內幾乎 所有的生命活動，是生物體內各種生物功能的主要執行者，而生物大分子三維結 構的解析可以為認識這些生命活動提供更加全面的信息，可以幫助解釋很多生物 方面的實驗數據，同時精確的三維結構信息讓定點突變和基于結構的藥物分子設 計成為可能。所以蛋白質以及其復合物的三維結構的測定是解釋生命活動機理， 研究生物體中分子結構和功能關系，揭示生命現象本質的研究基礎。目前為止已 經解析出了很多生物大分子的三維結構，其中對這些三維結構進行的深入研究使 得我們了解到了很多生物大分子結構和活性之間相互關系。 研究蛋白質三維結構主要有三種方法，分別為x 射線蛋白質單晶衍射、核 磁共振( n m r ) 和三維電鏡的方法。其中，n m r 法只能測定生物大分子在溶液 中的結構，所以其一般被用于研究分子在溶液中的動力學特性。其缺點是只能解 析相對小分子量的蛋白質( 約小于3 0 k d ) f i 】，而且分辨率不是很高。三維電鏡 適用于研究大的生物大分子復合物體系、膜蛋白以及全病毒的結構。除此以外， 還有如中子衍射、熒光、電子衍射之類的光譜技術和顯微技術以及計算機模擬的 方法也對生物大分子的結構研究有一定的輔助作用。x 射線單晶衍射技術則適用 于研究各種大小的蛋白質結構，可以測定分子量達l o7 d 的全病毒以及2 5 x1 0 6 d 級別的核糖體1 2 3 1 ，同時其可在原子水平上對蛋白質等的精細三維結構進行研究。 這些優點使得其在結構生物學研究中一直占據著不可替代的位置。 1 9 1 2 年l a u e 發現晶體對x 射線衍射，這就預示了x 射線晶體學的時代的 到來 4 1 ；隨著b r a g g 點陣理論的發現，無機小分子晶體結構的測定，直到早期 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制備方法研究 d h o d g k i n 教授應用這個方法得到了膽固醇、維生素d 、青霉素和維生素b 1 2 的 結構，至今的1 0 0 年間x 射線晶體學技術一直飛快的發展著。蛋白質等生物大 分子的結晶學可以追溯到十八世紀三十年代，此后人類基因組的發現和后基因組 時代的到來讓蛋白質晶體學的三維結構解析成為揭示很多生物生理活動以及相 關疾病的重要部分。 伴隨著新的生物技術，如自動化篩選技術、重組d n a 技術等的不斷發展， x 射線衍射大分子結晶法已經成為最重要的測得大分子結構的方法之一。而近年 來結構測定方法和所用儀器的快速發展及改進更加鞏固了x 射線單晶衍射技術 在蛋白質結構測定中的主要地位。可變波長的同步輻射加速器的使用和多波長反 常散射方法的發展讓我們更容易獲得高分辨率和高質量的衍射數據：冷凍技術的 應用使得能在低溫收集數據，降低了對晶體的輻射損害和對晶體的質量要求：各 種面探測器和c c d 的出現很大程度上提高了數據的收集速度；而計算機技術的 日益更新更加為晶體學的發展提供了強有力的計算工具。截至到2 0 0 7 年4 月1 2 日，在發表的4 2 7 5 2 個生物大分子結構中，有3 6 3 2 6 個結構都是用x 射線單晶 衍射技術得到的( 統計數據來自p r o t e i n d a t a b a n k 官方網站) 。蛋白質晶體結構 這種常用的技術方法可以為我們提供豐富的信息，比如特定原子的位置及其間的 作用關系、溶劑的親合力、分子內的彈性區域等等，一般3 a 以上分辨率的結構 就可以得到這些基本信息了。 1 1 2蛋白質結構的應用 蛋白質結構的貢獻之一就是蛋白質3 d 結構信息在生物化學和生物研究中的 顯著作用。如果我們想要明白生物作用過程和機理，就要研究生物體內細胞中的 動態過程，對這種動態過程的應答機制，外界化學和物理作用力怎么對大分子作 用以及這種作用是怎么被調節的，怎么被傳遞的；那么首先我們就要知道大分子 或是它們的復合物的結構。這樣以精確的三維結構為基礎可以并且已經揭示了很 多重要生命過程。有名的例子之一就是細菌光合作用中心復合物以及細菌集光蛋 白復合物三維結構的闡明，比較完整地揭示了細菌光合作用的運行機理和光能高 效傳遞的時空關系和分子機制。 中山大學碩士學位論文 此外，3 d 結構信息有助于在新藥的研制和發現中進行合理藥物設計【5 ，6 l 。因 為一旦我們得到一個有活性位點的有效酶的結構，就可以合理地設計可能的先導 化合物，通過看它們是否可以抑制或者影響酶的作用來進行篩選：同時一些病毒 蛋白結構的發現也為病理學研究提供了重要依據，比如，h i v 蛋白酶以及與h i v 有強結合能力的糖蛋白c d 4 的三維結構的報道，還有抗體抗原復合物結構的測 定使我們對免疫反應機制和規律有了深入了解。 另一個重要貢獻是其在蛋白質基因工程中的應用，也即有一種結構指導使得 能有目的得，而不是盲目地對蛋白質進行基因水平上改造。觀察到突變后的結構 改變后，我們可以更有效的改變化學或是物理因素來進行突變從而達到改造目的 川。 1 2 蛋白質晶體特性及x 射線衍射法研究蛋白質結構的過程 1 2 1 蛋白質晶體與小分子晶體比較 作為結晶中的“大人物”，蛋白質晶體的特性也很重要。了解蛋白質晶體的 特性有助于我們在結晶實驗中更好地對實驗進行設計。 由于蛋白質的特殊性質，蛋白質晶體同小分子晶體的差別是很大的。 首先，晶體中的溶劑含量不同。通常蛋白質晶體中平均含有5 0 左右的溶 劑，雖然這個含量從2 0 到9 0 不等，但也遠比小分子晶體中的含量要大。這 使得晶體中的溶劑與周圍溶液很容易交換，讓小分子自由擴散進出晶體，同時晶 體中蛋白質問有相對更大的空間可以容納相關小分子。一個實證就是酶結晶通常 表現出強的催化活性。 其次，蛋白質晶體中分子間作用鍵( 鹽橋、氫鍵、疏水作用力等) 的數目與 分子質量的比例比起通常的小分子要低很多，這導致了蛋白質晶體中晶格作用力 很弱。 此外，溶劑通道和充滿溶劑的空穴造成了蛋白質結構的復雜性和構象動力學 作用，并且由于分子間相對大的空間和晶體間弱的晶格力，使得晶體中的分子不 占據一定的位置和取向，所以即使在一個特定晶體中蛋白質分子也可能在多肽鏈 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 或是側鏈基團的相對位置上有微小的結構變化，這種結構易變性造成了衍射花樣 中有限的精確度，也使得蛋白質晶體有形態多樣性( 如圖1 1 ) ；即使對于同一種 蛋白質，在不同條件下結出的晶體也可能有完全不同的形態和外型，甚至是晶胞 參數等【8 】。 圖l l 幾種蛋白質的晶體( a ) 促黃體生成激素的p 亞單位，( b ) 煙草花葉衛星病毒 ( s a t e l l i t et o b a c c om o s a i cv i r u s ) ，( c ) c h 2 結構域切除的人體抗體，( d ) 甜味蛋白 t h a u m a t i n ，( e ) 雀麥草( b r o m e ) 花葉病毒，( f ) 種子中的刀豆球蛋i ! t ( c a n a v a l i n ) 小分子晶體一般有強的晶格力，相對高度有序的。它們一般物理強度較大比 較硬，易破碎，在空氣中穩定，所以容易操作：有很好的光學特性，適于x 射 線衍射。相比較起來，蛋白質晶體衍射實驗對蛋白質晶體的體積要求就高一些， 而且蛋白質晶體比較軟，暴露在空氣中容易失水、風化成粉，對溫度和射線敏感， 故操作起來難度要高很多：此外它們的光學特性不如小分子晶體，在x 射線衍 射中表現也差一些。 除了上面提到的不同點外，蛋白質晶體還有其他不同于普通小分子晶體的三 個特點：第一，大分子可能呈現不同的形態，比如沉淀，油狀物，凝膠或者晶體， 其中很多是在動力學上有利的。第二，對大分子而言，要達到使其長出晶核的超 4 中山大學碩士學位論文 飽和狀態比維持晶核生長的狀態要高得多，通常高出兩到三個數量級。第三，由 于體積大，擴散度低，相互作用弱并且不易從成核轉入生長狀態，大分子晶體成 核和生長的動力學比普通小分子慢很多。 蛋白質晶體的這些性質使得蛋白質結晶比小分子結晶復雜很多，兩者的生長 方法和解析過程都有很大的差異。在后面的實驗中我們可以看到這種差異。 1 2 2x 射線衍射法研究蛋白質結構的簡要過程 第一步結晶：解析蛋白質晶體結構的前提是制備均一的蛋白質樣品并得到 其單晶。在多數情況下，這一步需要通過大量的條件篩選和優化以使長出的單晶 符合衍射實驗的條件。 第二步數據收集：通常利用x 射線光束照射在一定角度范圍內旋轉的蛋白 質晶體，同時記錄晶體對x 光散射的強度。強度值被轉換為結構測定中的結構 因子振幅( 1 f i ) 。 第三步相角的測定：結構因子振幅( i f i ) 及相角( c t h u ) 是物理上相對獨 立的量。由于結構因子相角的全部信息在收集數據時丟失，因此必須通過其他途 徑來得到它們的信息。相角問題是續晶體獲得之后的又一個難題。 第四步相角的改進：電子密度圖的質量及其后的可解釋性主要決定于相角 的準確性。有的情況下采用晶胞不對稱單元中等價部分的電子密度平均，有可能 大大改善誤差較大的初始相角，使其得到優化。 第五步電子密度圖的計算：相位確定后可以開始計算電子密度圖。對于高 分辨率的數據( 衍射數據至少達到3 5 a ) ，從電子密度圖就可以跟蹤出肽鏈走向、 二級結構等，從而可能推出肽鏈的三維折疊方式等。再在一級結構( 氨基酸序列) 的基礎上構建出原子坐標形式的蛋白質結構模型。 第六步結構精修：結構的修正可以采用程序中的自動修正，或者手工進行。 精修可以鍵長、鍵角，b f a c t o r 等的限制為依據來進行。此外精修中需要加入位 于蛋白質周圍并同其有直接作用的水分子，從而方便考查氫鍵作用。精修這步一 般需要反復進行，以取得更好的數據和更精確的結構。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 1 3 甜味蛋白t h a u m a t i n 研究背景 1 3 1蛋白質來源 t h a u m a t i n 是一類存在于熱帶植物t h a u m a l o c o c c u $ d a n i e l l i ib e n t h 果實中的 甜蛋白。該蛋白具有組織表達特異性，僅發現于這種植物的肉質假種皮中。1 9 7 2 年，荷蘭科學家v a n d e r w j l 首次將其從該植物漿果中提取出來 9 1 。天然提取出 來的t h a u m a t i n 結構并不完全一樣，其由一個多基因的家族編碼，最少存在6 7 種相近的蛋白質產物，其中最主要的兩種蛋白為t h a u m a t i ni 和i i ，其分子量分 別為2 2 ，2 0 9 d a 和2 2 ，2 9 3 d a t t o l 。這兩種蛋白由2 0 7 個氨基酸組成，只有5 個殘基 的不同。 目前t h a u m a t i n 的來源主要有兩個方面：一、天然植物提取 9 1 ：從果實原料 中一般采用提取單一的水抽提法，為了保持產品的天然特性，僅利用物理方法進 行過濾和超濾，再通過凝膠過濾、離子交換色譜分別得到純的t h a u m a t i ni 和i i 。 據報道l k g 果實可提取出9 0 0 m g 的t h a u m a t i n ：二、利用基因工程：將重組的 t h a u m a t i n 基因在微生物或植物中進行表達，再將其提取出來。此外改變基因序 列可以得到不同味道特性的蛋白【】。 1 3 2 t h a u m a t i n 的特性 研究發現這種甜味蛋白是一種堿性蛋白。極易溶于水，但是不易溶于有機溶 劑，其等電點約為1 2 0 ，并且其等電點和甜味活性按著c ，b ，孔i 和i i 的順序依次增 加【”j 。肽鏈中存在的1 6 個半胱氨酸可以形成8 個二硫鍵，二硫鍵被還原的 t h a u m a t i n 會有一種快速的自我水解作用，并且在合適底物存在的情況下，被還 原的t h a u m a t i n 會顯示出蛋白酶、酰胺酶及酯酶活性。有文獻 t 3 l 通過研究 t h a u m a t i ni 和i i 的光譜學性質發現在溫度逐漸升高的情況下蛋白會發生可逆的 構象改變，并且在固定溫度下改變p h 時，會發生不可逆熱變性。在p h i 5 0 時天 然構象最穩定，此時加熱至q 7 5 c ，構象變化也是可逆的。還有研究發現在p h ，j , 于5 5 ，溫度高于1 0 0 c 時這種蛋白質也不會失去甜味【1 4 1 。即使在巴氏殺菌法的條 6 中山大學碩士學位論文 件下蛋白質也仍然是穩定的，將t h a u m a t i ni x 一個小時后，一旦其冷卻下來它的 甜味就會恢復【1 5 l 。這種穩定性可能跟其二硫鍵有判1 6 1 。還有研究報道1 1 7 1 3 1 對蛋 白質中賴氨酸等殘基進行突變可以影響其甜味，所以這些殘基可能在其引起甜味 的過程中起到重要作用。 t h a u m a t i n 的另一個特性就是可作為食品。這種蛋白可以引起甜味，并且它 的甜度是等質量蔗糖的3 0 0 0 倍。它的甜味持續時間長。對人體和動物都無害，并 且不會引起牙病，可被糖尿病人食用【1 9 1 。早在1 9 7 9 年，t h a u m a t i n 就已經在日本 市場上被作為甜味劑和調味劑商品來出售了，并被美國的f e m a 批準用于口香糖 生產中剛。 1 3 3t h a u m a t i n 的主要研究方向 迄今為止關于t h a u m a t i n 的研究集中在3 個方面： 1 3 3 1 晶體學基礎研究 由于t h a u m a t i n 是最早通過x 射線單晶衍射法得到三維結構的蛋白質之一，又 因為其提取純化比較簡單，蛋白質容易得到，所以t h a u m a t i n 經常被用于基礎的 晶體學研究中。 在一些基本的理論研究中，t h a u m a t i n 常被做為實驗對象進行研究來為蛋白 質晶體學研究提供數據。比如在失重情況下生長t h a u m a t i n 的晶體，通過對其結 晶的動力學研究，來觀察失重情況對蛋白質晶體的生長影響 2 1 1 。為了考察一些物 理化學因素對蛋白質結晶的貢獻，有人通過動態光散射方法對t h a u m a t i n 的結晶 體系進行研究 2 2 1 ；在a f m 法 2 3 1 研究大分子結晶中的表面形態學、生長動力學、 結構缺陷等方面和考察壓力和凝膠( 如甘油) 對蛋白質晶體質量和生長影響 2 4 2 s ! 時，t h a u m a t i n 也被作為主要研究對象之一。此外在晶體性質研究中，t h a u m a t i n 被用作標準蛋白，通過凝膠穿刺技術探討毛細管中晶體生產速率而用來模擬生長 細胞中晶體的生成情況瞄】。 1 3 3 2 甜味機理的研究 雖然甜味劑使用時間已經長達一個世紀了，但是甜味劑，包括甜昧蛋白和小 分子甜味劑的致甜機理都還一直沒有弄清楚。而t h a u m a t i n 作為一種典型的甜味 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 蛋白自然是一直以來的研究對象。對t h a u m a t i n 的甜味機理研究一般從兩個方面 入手：一方面在t h a u m a t i n 本身構效關系研究中，通過其晶體結構及衍射結構數 據，再結合味覺實驗等手段，了解其結構與甜味產生間的關系。比如，知道側鏈 氨基酸的排列方向，可以確定哪個側鏈與受體分子相互作用，或者同另一側鏈的 疏水或氫鍵作用。通過加強或減小這些內部作用可能產生的味覺效果。再比如， 知道了甜味產生的活性位點，就可以設計出與其相似的蛋白質或者肽鏈，生產出 更好口感的甜味劑。另一方面在味覺研究中，因其于甜味受體的強結合作用，用 作探針來研究甜味產生機理，以便更好地了解其與受體相互作用以及甜味產生機 理。 1 3 3 3 轉基因研究 在工業生產中，人們將基因工程等應用于其生產研究中，以生成出低成本高 產量的轉基因產物，或者研究開發出更好的新型品種。 由于t h a u m a t i n 來源植物對生活環境有嚴格要求，在很多地方引種都不能成 功，不能滿足人們對這種甜味蛋白的大量需求。為了得到大量的t h a u m a t i n ，科 學家們曾先后將其克隆到大腸桿菌、酵母中，但因缺乏相應的蛋白質加工系統， 其在基因轉錄后難以形成正確的高級結構，所以得不到所需的蛋白質產物。于是 發展了其植物基因工程。1 9 9 0 年，w i t t y 等總結前人經驗，利用毛根轉化技術成 功地將t h a u m a t i n 基因在馬鈴薯中進行了表達，使得t h a u m a t i n 成為第一個在轉基 因植物中被表達的甜味蛋白【硎。 1 4 選題意義及課題進展 1 4 1 選題意義 盡管有著種種的優點，x 射線衍射技術最大的缺點就是不容易獲得蛋白質單 晶或者得到的單晶質量太差。由于蛋白質以及其晶體的種種特性，使得其不像小 分子那樣容易結晶，要獲得好的衍射數據的高質量、大體積蛋白質晶體更加不容 易；很多時候即使能長出微晶體，也不一定能長出足夠尺寸的晶體。蛋白質晶體 的獲得可以說是x 射線衍射法獲得蛋白質結構的“瓶頸”。 8 中山大學碩士學位論文 所以從出現x 射線單晶衍射技術開始，蛋白質晶體生長就被廣泛并且深入 地研究。從蛋白質晶體的生長過程到其生長機理研究中，我們已經發現了很多有 利于或者不利于蛋白質晶體生長的因素，也對蛋白質晶體的生長方式、缺陷種類 等進行了定義和總結。盡管對于蛋白質晶體生長有著很長的研究歷史，但是目前 為止，多數實驗室進行蛋白質晶體生長時，仍然需要采用嘗試的方法。因為晶體 生長的影響因素太多了，而且很難得到某一個一定的有指導意義的晶體生長條件 或方法，尤其是對于一個新的蛋白質。但是盡管如此，對生物體細胞內大分子( 包 括蛋白質、核酸、脂質和多聚糖) 結構及其相互作用等信息的迫切需要讓科學家 們不辭艱辛要去獲得完美的大分子晶體。對于很多化學家和生物學家，尤其是結 構生物學家，x 射線衍射法得到晶體結構作為唯一可以得到原子水平上結構信息 的一種方法做出了很多的貢獻。 正是在這樣的蛋白質晶體研究背景下，為了給新建結構生物學平臺的發展和 后續研究打下基礎，我們以甜味蛋白為例，在獲得高衍射質量蛋白質晶體和好的 結構數據的基礎上，對蛋白質晶體生長的主要影響因素和晶體結構的解析方法進 行了研究。此外我們還嘗試了獲得甜味蛋白晶體的金屬共結晶物或衍生物，以及 用一種新的1 2 擴散法得到甜味蛋白晶體的重原子衍生物。 在本課題中我們以甜味蛋白為主要研究對象，沿著其前2 個研究方向：一方 面從蛋白質晶體生長因素和重原子衍生物來對其進行晶體學基礎研究，另一方面 在前人研究的基礎上通過金屬鹽共結合物的制備對其甜味機理進行探索。 1 4 2 課題進展 我們的研究集中在蛋白質晶體生長影響因素和晶體重原子衍生物的制備上。 在對晶體生長影響因素的研究中，我們使用懸滴法對甜味蛋白t h a u m a t i n 進行結 晶。通過觀察、對比不同條件下液滴及晶體的生長情況，得到主要的影響因素以 1 一 及每種因素對晶體生長的影響規律。我們考察的因素一共有4 種，分別為溫度 ( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白質溶液濃度( 4 0 m g , m l 和2 0 m g m l ) 、沉淀劑濃度( 包 括酒石酸鈉鉀鹽和乙二醇) 、懸滴中蛋白質溶液和池液比例( 3 _ t l ：2 9 l 和 2 吐：2 此) 。研究手段為顯微鏡法觀察懸滴中溶液狀態及晶體生長情況，用x 射 9 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 線衍射實驗的方法來對晶體進行表征。 在重原子衍生物制備研究中，我們采用浸泡法來制備衍生物。同時由于s a d 結構解析法的種種優點，我們也嘗試用新報道過的碘擴散法來制備可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并嘗試了用于s a d 法數據收集方法。 最終我們在所研究的4 種影響因素中找到了主要影響因素及其影響規律。得 到了高質量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 單晶，并且在可重復制備蛋白質晶體的 基礎上用碘擴散法得到了晶體的碘原子衍生物。但是由于時間關系，我們沒有用 s a d 法解出晶體結構，碘擴散制備碘原子衍生物法的優化也還有待繼續研究。 i o 中山大學碩士學位論文 第2 章蛋白質晶體的培養 2 1 蛋白質晶體的生長階段、主要培養方法及影響因素 2 1 1 蛋白質晶體的三個生長階段 所有晶體的結晶過程都可以被分為三個階段：超飽和度的達到、成核階段和 生長階段。 超飽和狀態是指在一定條件下，大分子濃度高于溶解度的一個非平衡態。高 濃度溶液中，大分子首先形成大小不等的非晶態沉淀，當達到超飽和狀態并且能 量足夠低時溶劑分子就可以有足夠的時間和機會將自己排列到晶格中，有序地凝 聚，從而形成一定大小的晶核，繼而長成完整的晶體。也就是一個晶核不斷形成， 同時不斷長大的過程。因此超飽和度的適當達到是很重要的，如果超飽和度太高， 晶核數量大，會導致晶體過快析出，容易形成微晶甚至是不定形物；如果超飽和 度太低，成晶速度會很慢，可能長不出晶體或者晶體還沒有長成就被破壞了。 超飽和度是結晶的必需條件之一。由于蛋白質形狀、性質上的復雜性，并且 蛋白質受電解質性質、濃度、p h 、溫度以及各種其他因素的影響，在不同條件 下其有不同的溶解度最小值，甚至是由于母液性質的稍稍改變就可能結出不同晶 型的晶體，比如溶菌酶、核糖核酸酣2 8 】等等。因此想要找到適合用于x - r a y 衍射 實驗的晶體就要組合各種不同的實驗條件，從中篩選出可以產生晶體的最小溶解 度的條件組合。有的文獻中建議在一系列不同的p h 下，就一個給定的沉淀劑來 測定蛋白質的沉淀點，并且在不同溫度下重復。一般而言，我們可以通過一下幾 種途徑來達到適合的超飽和狀態【7 】：( a ) 改變蛋白質本身來降低它的溶解度或者 是增加各個蛋白質分子彼此間的吸引力，比如改變p h 使得表面氨基酸殘基的離 子化狀態發生改變；也可以應用重組基因工程，通過改變活性位點的殘基或者加 入小分子結合物對蛋白質從結構上進行修飾；( b ) 改變溶液性質來降低它對蛋白 質的溶解能力，比如減小其化學活性或者加入鹽：( c ) 改變蛋白質分子和溶劑之 間的作用力，比如加入高聚物或者離子。具體各種不同的方法在很多文獻中已有 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 描述 2 9 - 3 2 1 。 第二個階段就是成核，成核是這3 個階段中最難解決的。對于成核機理的研 究在這里就不詳細論述了。我們關心的是如何讓蛋白質進入這個階段。影響成核 的因素包括超飽和度、分子尺寸和添加物的表面自由能。高的蛋白質濃度可以加 快成核的速率，不過如果這個高濃度形成的太快就有可能長出非晶態沉淀。最好 是使體系非常緩慢的趨向于溶解度最小，從而達到有限的過飽和度。 第三個階段晶體的生長相對于成核就容易很多了，并且其機理已經被完全研 究清楚了。 在這3 個階段中，超飽和狀態是最重要的階段，因為它驅動其他2 個階段的 形成并且決定它們的發生和進行程度。在下面提到的一些影響因素和技術中很多 都是通過作用于超飽和度來影響結晶過程的。 2 1 2 晶體生長的影響因素 蛋白質結晶受很多因素影響( 見表2 - 1 ) 7 1 ，其中的很多因素都是相互影響 的，這使得整個影響關系變得很復雜。在所有這些因素中，最重要的因素有四個， 分別為溫度、p h 值、沉淀劑( 或鹽) 和蛋白質純度。 溫度變化是常用的誘導結晶的因素之一，一般蛋白質的結晶溫度都在4 3 5 ：大多數情況下都是在一個固定溫度下改變其他條件進行篩選的。 在其他條件不變的情況下，p h 通常會影響蛋白質的溶解度。因為p h 可以 反映蛋白質的氨基酸組成和其三維結構。有研究表f 1 ) j 3 3 , 3 4 1 ，蛋白質可以在等電點 達到其最小溶解度，等電點為不使蛋白質在電場中發生遷移的p h 值。 要選擇一個合適的沉淀劑很關鍵，也相當麻煩。沉淀劑可以分為兩類：鹽和 有機溶劑。已經發現的常用沉淀劑有硫酸鹽、乙酸鹽、乙醇、聚乙二醇、m p d 等等。需要強調的是，透析法中是不能使用p e g 作為沉淀劑的，這是由于p e g 分子不能穿過透析膜；所以p e g 一般用于批量結晶、汽相平衡等方法。此外也 可以使用二組分沉淀劑體系，就是說體系中可以同時含有鹽和有機溶劑或者同時 含有兩種不同的鹽。其相關研究早在二十世紀六十、七十年代就有報道。各種沉 淀劑和它們的性質也都被詳細地研究總結過 7 , 2 8 , 3 0 1 。 1 2 中山大學碩士學位論文 雖然在結晶之前所有的因素都要被考慮到，并且對于不同的蛋白質樣品需要 考慮的側重點不同，但是樣品的純度是被最頻繁提到的；一般而言，越純的蛋白 質越容易結晶，也越容易結出好的晶體。通常要求蛋白質純度在9 0 以上就可 以用于結晶實驗了。 表2 1 各種影響蛋白質結晶的因素 2 1 3 蛋白質晶體的主要培養方法 蛋白質在不同條件下溶解度的不同導致了同一種蛋白質的不同形態晶體的 形成，例如核糖核酸酶( r i b o n u c l e a s e ) 、酵母苯丙氨酸轉移核糖核酸( y e a s t p h e n y l a l a n i n e - t r n a ) 2 8 1 。這種現象的成因之一就是蛋白質的結晶受p h 、溫度、 沉淀劑、重力、蛋白質純度以及其他因素影響，所有這些因素都給合適的結晶條 件的獲得增加了難度。為了得到高質量可用于x 射線衍射并且可產生完美衍射 數據的晶體，我們首先要找到可以產生晶體物質的各種化學、物理和生化條件。 然后改善優化這些條件從而得到想要的晶體。這兩個階段分別被稱為篩選和優 化，它們在所有的蛋白質結晶中都是必需的過程。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長及重原子衍生物制各方法研究 三弛圭要縫菱直洼 應用于篩選和優化的方法有很多，像批量結晶、分批結晶、批量透析、微量 透析、液橋，自由擴散等等，其細節在很多文獻中都有詳細描迸7 邡1 ，這里我們 只想重點提到三種最常用的方法：微批量結晶法( m i c r o b a t c h ) 、坐滴氣相擴散法 f s i t t i n gd r o p ) 和懸滴氣相擴散法( h a n g i n gd r o p ) ，后兩種均屬于汽相擴散。在這三 種方法中都先將蛋白質溶液和結晶溶液( 也就是母液) 混合( 見圖2 1 ) 。m i c r o b a t c h 中混合后的液滴直接放置在結晶專用的多孔平板的凹槽中，并將凹槽用涂有真空 油的透明塑料片封住以防止溶劑揮發；可以通過改變混合液滴達到優化的目的。 圖2 - 1 從左到右分別s i t t i n g d r o p ，h a n g i n g d r o p ，m i c r o b a t c h 的結晶原理示意圖， 圖中的 p p t 代表試劑濃度 s i t t i n gd r o p 是在平板上進行的汽相擴散，混合液滴放置在多孔平板的凹槽 中，再將平板置于裝有結晶溶液的透明容器中( 母液不能沒過平板) ，最后將整 個裝置密封。這樣容器中的母液與凹槽中的混合液滴內包含的鹽或者有機溶劑的 濃度通過其間的汽相擴散達到平衡。和m i c r o b a t c h 相比，在混合液滴已經配好的 情況下由于容器中母液濃度可以改變，因而改變條件的自由度較大。現在也有很 多改進的s i t t i n gd r o p 法，如直接在載玻片上滴混合液滴和母液，使其不相互接 觸來進行擴散，或者在兩種液體間加入液橋介質。 h a n g i n gd r o p 是在懸滴中進行的汽相擴散，混合液滴懸在一塊蓋玻片下，然 后將其密封放在裝有母液的凹槽上方。這種方法最大的好處就是所需的液滴體積 小，適用于只有少量蛋白質樣品又要進行大量篩選的情況；但是由于液滴體積有 限并不適合大晶體的生長。 在m i c r o b a t c h 中，密封油的氣透性可以被調節，使得液滴緩慢揮發，類似于 通過調節濃度來影響結晶：在汽相擴散法中液滴和母液間的濃度平衡則是通過汽 相擴散來達到的。m i c r o b a t c h 適合在不同溫度，甚至是在梯度溫度下進行篩選： 1 4 中山大學碩士學位論文 同時，不同于汽相擴散法，m i c r o b a t c h 中不會出現液滴體積增大或是樣品稀釋p ，j 。 在特定蛋白的初始條件篩選中m i c r o b a t e h 和汽相擴散法的比較在一些文獻 f l s - j r l 中有過報道。關于上述三種方法的更多信息可以在文獻 3 5 1 中找到。當母液 是非揮發性時，最好使用微量透析的方法。 除了上述三種方法外，還有很多改進的方法，包括近年研究出的自動操作系 統，它可以加快整個實驗過程并且節省樣品【3 5 1 ；對于膜蛋白結晶可以使用脂質立 方相( 1 i p i d i cc u b i cp h a s e s ) 的方法【3 8 1 ；此外還可以使用相圖來預測結晶的合適條 件【3 9 】。 2 2 甜味蛋白晶體的培養及其生長研究 2 2 1 實驗材