中山人學碩 ：論文 桐花樹耐鹽相關基因的克隆與表達 桐花樹耐鹽相關基因的克隆與表達 碩士生：劉晉 導師：黃椰林副教授 專業：植物學 研究方向：植物分子系統學 摘要 鹽脅迫對植物的生長和繁殖有著極大的影響，提高植物的耐鹽性是降低鹽脅 迫危害的有效方法，因此，研究植物耐鹽機理，通過基因工程培養耐鹽作物品種 已經成為了當前國際上關于植物耐鹽的研究熱點之一。紅樹植物所在的潮間帶高 鹽生境決定了其在長期的進化發展中必然會形成其特有的耐鹽分子機制。 本研究通過r a c e 技術，利用本實驗室已有的紅樹植物桐花樹( a e g i c e r a s c o m i c “l a t u m ) 正向抑制性差減文庫中的部分基因片段克隆得到三個桐花樹耐鹽相 關基因：a c n h x l ，a c n h x 2 ，a c n h d 。通過分析這些基因的e d n a 序列和編 碼蛋白的氨基酸序列，發現它們在結構上都具有n a + i r 轉運蛋白編碼基因的特 點，其中a c n h x i ，a c n i - 1 x 2 屬于n h x 基因家族，它們所編碼的蛋白a e n h x l 、 a c n h x 2 可能定位于液泡膜上，主要起n a + 液泡區隔化的功能；而a c n h d 基因 和已知的極少數植物n h d 基因構成了n h x s o s i 兩大公認類型之外的第三類 植物n a + ，h 十轉運蛋白編碼基因。 通過熒光定量p c r 技術分析桐花樹葉中a c n h x i ，a c n h x 2 ，a c n h d 在 鹽和滲透物質處理下的轉錄模式，我們發現a c n h x l 、a c n h x 2 ，a c n h d 的轉 錄水平變化不但與桐花樹葉中的n a + 濃度相關，還與k + 濃度有關，其中植物n h d 基因的轉錄與植物體內k + 濃度有關為本研究首次發現；a c n i t x l 基因的轉錄變化 主要是由離子脅迫引起的，其功能很可能主要與降低離子脅迫對植物細胞的傷害 有關；而影響a c n h x 2 轉錄的主要次級脅迫與a c n h x i 不同，是高滲壓脅迫， 這說明a c n h x 2 在植物耐鹽機理中的作用很可能主要與減少高滲壓脅迫對植物 桐花樹耐鹽相關摧川的克降j 表達 細胞的傷害有關。a c n h d 轉錄模式與a c n h x l 相似，推測其有可能與a c n h x l 受到類似調控。 a c n t t x 2 與擬南芥的a t n h x l ，a t n h x 2 在同樣化學物質處理同樣時問下的轉錄 卡楚式如出一轍，推測很可能受到類似于擬南芥a b a 依賴型信號轉導途徑的調控， j 在桐花樹中起著與擬南芥a t n h x l ，a t n h x 2 同樣的作用；而a c n h x l 與已知的 j 它植物n h x 基因在類似處理下的轉錄變化特點都不相同，說明桐花樹的耐鹽 分f 機理與其它植物既有共同點，又有其獨到之處。 a c n h x l 、a c h d 轉錄水平在2 5 0 i i l m 和5 0 0 m mn a c i 處理下不同，a c n h x l 、 一( p 5 c s 轉錄水平、k + n a + 比值、脯氨酸含量都隨著鹽激時間的增長而先升后降， 蛻明桐花樹在不同濃度、不同時間的鹽脅迫下有著不同適應機制。( a c p 5 c s 基因 的克隆和a c n h x l 、a c n h d 基因在不同時間赫激下的轉錄表達實驗已由本實驗 室傅新暉完成) 關鍵詞：耐鹽，桐花樹，鈉氫轉運蛋白，脯氨酸 i i 生盔蘭堡! 笙塞 塑些塑塑竺塑莖苧墮塑壅墮! 鍪 c l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i s o fs a l tt o l e r a n c e r e l a t e dg e n e si na e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m n a m e ：l i uj i n s u p e r v i s o r ：p r o f s h is u h u a , a s s o c i a t ep r o f h u a n g y e l i n m a j o r ：b o t a n y r e s e a r c hd i r e c t i o n ：p l a n tm o l e c u l a rs y s t e m a t i c s a b s t r a c t s a l ts t r e s ss e v e r e l ya f f e c t st h eg r o w t ha n dp r o d u c t i v i t yo fp l a n t sa n di m p r o v i n g t h ec a p a b i l i t yo fs a l t - t o l e r a n c eo fp l a n t si sa ne f f e c t i v ew a yt or e d u c et h ei m p a c tf r o m s a l ts t r e s s d i s s e c t i n gt h em e c h a n i s m so fs a l t - t o l e r a n c ei np l a n t sa n dd e v e l o p i n g s a l t - t o l e r a n tc r o p sb yg e n ee n g i n e e r i n gh a sb e c o m eac e n t r a li s s u ei ns t u d i e so fp l a n t s a l tt o l e r a n c e i n h a b i t i n gi n t e r t i d a lz o n e sw i t hh i g hs a l i n i t y , m a n g r o v e sh a v e d e v e l o p e du n i q u es a l t - t o l e r a n c em e c h a n i s md u r i n gl o n g t e r me v o l u t i o n a r yh i s t o r y i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h r e es a l t t o l e r a n c er e l a t e dg e n e sa c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h dw e r ei s o l a t e df r o mas s hl i b r a r yo f a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mt h r o u g hr a c e b a s e do nt h ea n a l y s i so ft h e i rc d n as e q u e n c e sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e s ，w ef o u n d t h a tt h e ya l lh a dc h a r a c t e r i s t i c so f g e n e se n c o d i n gn a + h + t r a n s p o r t e r a m o n gt h e s e g e n e s ，a c n h x ia n da c n h x 2c o m i n gf r o mt h en h xg e n ef a m i l y , a n da c n h x i a c n h x 2m a yl o c a l i z et ot o n o p l a s t ，w i t ham a j o r f u n c t i o ni nv a c u o l a r c e m p a r t m e n t a l i z a t i o no fn 礦：w h i l ea c n h dt o g e t h e rw i t ha f e wk n o w np l a n tn h d g e n e sf o r m e dt h e t h i r dp l a n tn a + wt r a n s p o r t e r - e n c o d i n gg e n eg r o u p ，w h i c hi s d i s t i n c tf r o mt h ea c k n o w l e d g e dp l a n tn h x a n ds o s lg r o u p s r e a l t i m ep c rw a su s e dt od e t e c tt r a n s c r i p tp a t t e r n so f a c n h x l ，a c n h x 2a n d a c n h di nt h el e a fo fa e g i c e r a sc o r n i c u l a m mu n d e rs a l ta n do s m o t i cm a t e r i a l s w e f o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e l so fa c n h x i ，a c n h x 2a n da c n h dn o to n l yh a v e i i i 桐花樹耐鹽相關皋吲的克降4 ，表返 r e l a t i o nt on a + c o n t e n tb u ta l s oa l er e l e v a n tt ok + c o n t e n ti nt h el e a fo fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u m t h a tt r a n s c r i p t i o nl e v e lo fp l a n tn h d g e n eh a sr e l a t i o nt ok + c o n c e n ti s f i r s td i s c o v e r e di nt h ep r e s e n ts t u d y t r a n s c r i p t i o nc h a n g eo f a c n h x lr e s u l t sm a i n l y f r o mi o ns t r e s s ，s oi t sf u n c t i o ni sp r o b a b l yr e d u c i n gt h ed a m a g eo fi o ns t r e s st op l a n t c e l l w h i l et r a n s c r i p t i o no fa c n h x 2m a yb ei n d u c e db yo s m o t i cs t r e s s ，a n dh a sa p r o b a b l ef u n c t i o ni nr e d u c i n gt h ed a m a g eo fo s m o t i cs t r e s s t o p l a n tc e l l t h e t r a n s c r i p t i o np a t t e mo fa c n h d w a ss i m i l a rt oa c n h x i ，w h i c hs u g g e s t si tm a yb e r e g u l a t e dl i k ea c n h x l t h et r a n s c r i p t i o n a l p a t t e r n o fa c n h x 2u n d e rt r e a t m e n t sw i t hd i f f e r e n t b i o c h e m i c a l si ss i m i l a rt ot h a to fa t n h x ia n da t n h x 2i na r a b i d o p s i s t h u s ， a c n h x 2m a yb er e g u l a t e db yt h es a m es i g n a lp a s s w a ya sa b ad e p e n d e ds i g n a l p a s s w a yi na r a b i d o p s i sa n dm a yh a v et h es a n l ef u n c t i o na sa t n h x la n da t n h x 2i n a r a b i d o p s i s h o w e v e lt h et r a n s c r i p t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fa c n h x lu n d e rt r e a t m e n t s w i t hd i f f e r e n tb i o c h e m i c a l sa r ed i f f e r e n tf r o ma n yo t h e rk n o w np l a n tn h x g e n e s o u r r e s u l t si n d i c a t et h a tt h em o l e c u l a rs a l t - t o l e r a n tm e c h a n i s m so fa e g i c e r a s c o r n i c u l a t u mn o to n l yh a v es o m ec o m m o n sw i t ho t h e rp l a n t s ，b u ta l s oh a v ei t su n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s ， t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n i i x la n da c n h da r ed i f f e r e n tu n d e rt r e a t m e n t s w i t h2 5 0 m mn a c ia n d5 0 0 m mn a c l ，r e s p e c t i v e l y t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so f a c n h x la n da c p 5 c s ，k + n dr a t i o ，p r o l i n ec o n t e n ta r ei n c r e a s e da tt h ee a r l ys t a g eo f t h es a l t s t r e s sp r o c e s s ，a n dt h e na l ed e c r e a s e da f t e rt h ep e a kv a l u e s b o t ho fw h i c h i n d i c a t e st h a ta e g i c e r a sc o r n i c u l a t u mh a sd i f f e r e n ta d a p t a t i o nm e c h a n i s m su n d e r s a l t s t r e s sw i t hd i 舵r e n tc o n c e n t r a t i o na n dt i m e k e y w o r d s ：s a l tt o l e r a n c e ，a e g i c e r a sc o r n i c u l a t u m ，n a + wt r a n s p o r t e r s ，p r o l i n e 中山大學碩：l 論文桐花樹耐赫相關基因的克隧與表達 1 1 文獻綜述 第1 章引言 1 1 1 植物耐鹽分子機理研究進展 植物要在高鹽環境中生存，就必然有其相應的抗鹽機理?？偟膩碚f，植物抗 鹽機理可以分為三類：一是避鹽機理，指植物不讓外界鹽分進入體內從而避免鹽 脅迫，主要依靠細胞對鹽的不透性來適應鹽漬化環境：二是緩解機理，主要指通 過固定、稀釋、化學去活和泌鹽等方法消除鹽脅迫傷害；三是耐鹽機理，指通過 代謝或生理過程來適應細胞內高鹽環境的現象( 李曉燕等，2 0 0 4 ) 。對于高等植 物而言，其細胞體內的酶通常都是不耐鹽的，而在高鹽環境下，植物細胞內的鹽 濃度又往往會不可避免地提高，因此通過耐鹽機理束維持植物細胞質內微環境的 穩定對于植物適應高鹽環境有著至關重要地作用。 從分子生物學水平而吉，鹽脅迫對植物造成的不利影響主要有以下四方面： 一方面由于植物生長環境中的溶質濃度過高對植物細胞產生滲透壓脅迫，以及由 此引發的植物缺水；另一方面因為高鹽環境中植物與外界的離子交換失常而使植 物體內離子平衡發生改變，從而產生的離子脅迫，其主要表現為：n a + 和c l _ 在植 物體內的富集和k + 的流失以及由此引起的n a + o 一比例改變而( e d u a r d o ，2 0 0 0 ； a p s ee ta 1 。2 0 0 2 ) 。第三方面是鹽脅迫還破壞植物體內性氧代謝系統( a p s e e ta 1 ， 2 0 0 2 ；李曉燕等。2 0 0 4 ) ；最后，鹽脅迫還對植物的生長相關調節造成嚴重影響 ( z h u , 2 0 0 l b ) 。在以上的四方面中，離子脅迫和滲透壓脅迫被認為是鹽脅迫對 植物造成的主要次級脅迫，已得到了較為全面深入研究。相應的，植物的耐鹽分 子機理亦可分為四個方面：1 、植物細胞內離子平衡的維持；2 、細胞滲透壓的調 節；3 、生成抗氧化劑減少活性氧傷害；4 、生長相關調節。 1 1 1 1 植物細胞內離子動態平衡的維持 細胞內的離子動態平衡是植物存活與生長的基礎條件之一，要有效維持細胞 中山人學碩i ，論義 桐花樹耐鹽相關是閃的克降j 表達 內有害離子低濃度水平和聚集細胞所需離子就必需適當地調節細胞內的離子流 動( z h u ，2 0 0 3 ) 。目前，針對植物在能脅迫下如何維持細胞內離子動念平衡的研 口 究主要集中在降低細胞液中n a + 和c 1 濃度，提高k + 濃度的分子機理上( z h u 。 2 0 0 1 a ；b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；a p s ee ta 1 ，2 0 0 2 ：m a n s o u r ，2 0 0 3 ；z h u ，2 0 0 3 ) 。 n 植物細胞內n a + 的濃度維持 植物細胞內n a + 濃度維持主要通過調控n a + 進入細胞、n a + 排出細胞和n a + 的區室化區隔化( c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n ) 來實現，在這些過程中又必然會涉及到 n a + 流動的能量束源以及信號調節途徑的問題，下面就這些方面逐一進行論述。 ( 1 ) n a + 進入細胞 已知的n a + 進入植物細胞方式有三種：通過高親合力的k + 轉運蛋白；通過 非選擇性的離子通道和通過蒸騰流。 在擬南芥中，n a + 通過高親合力的k + 轉運蛋白a t h k t l 轉運進入細胞已經得 到了實驗的證實( r u s ae ta 1 ，2 0 0 1 ；m a 7s e fe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。小麥中也有類似發現 ( l a u r i ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。a m t m a n na n ds a n d e r s ( 1 9 9 9 ) 發現n a + 可以通過非選擇性 離子通道進入細胞。此外，y e 等( 1 9 9 9 ) 的實驗表明，在水稻中，n 礦可以利用 蒸騰流進入植物體內，而這種過程受到硅的抑制。 ( 2 ) n a + 排出細胞 與n a + 排出細胞相關的基因中，研究最為深入的是模式植物擬南芥中的s o s i 基因。大量研究表明，a t s o s l 是一種定位于細胞質膜上的n a + w 轉運蛋白的編碼 基因，其編碼的蛋白能夠將n a + 通過細胞質膜排出體外( s h ie ta 1 ，2 0 0 0 ；q u i n t e r o e ta 1 ，2 0 0 2 ；q i ue ta 1 ，2 0 0 2 ；s h ie la 1 ，2 0 0 2 a ) ，提高彳t s o s l 表達量能使擬南芥耐 鹽能力得到增強( s h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。另外，鹽脅迫能使爿t s o s l 的表達上調，卻不 能增= c j i m t s o s l 啟動子的活性，但是當a t s o s l 與花椰菜花葉病毒( c a u l i f l o w e r m o s a i cv i r u s ) 3 5 s 啟動子相連時，其表達卻能受到鹽脅迫誘導上調，因此，鹽 脅迫對表達的調節可能時發生在轉錄自u 水平。( s h ie t a l ，2 0 0 0 ： s h i e t a l ，2 0 0 3 ； w a r de ta l ，2 0 0 3 ) 。 中山大學碩上論文 桐花樹耐鹽相關肇w 的克隆與表達 除了對a t s o s i 的研究外，g a x i o l a 等( 2 0 0 1 ) 發現在擬南芥中過表達a v p i 能夠提高植物耐鹽能力。n i u 等( 1 9 9 3 ) 發現鹽土植物濱藜細胞質膜上的一些 r c - a t p a s e g e n e 基因在鹽脅迫下表達上調。j u l i a n a 等( 2 0 0 7 ) 在水稻中克隆得到 a t s o s l 的功能同系物o ss o s i ，研究表明o ss o s l 能夠替代a t s o s l 的功能。 ( 3 ) n a + 的區隔化 為了減少對細胞的傷害，植物細胞除了將n a + 外排外，還能通過將n a + 聚集 于一些細胞器中達到維持細胞液中低n a + 濃度的目的。n a + 的區隔化主要發生在 液泡中，質體和線粒體也能聚集一些n a + ( b l u m w a l d ，2 0 0 0 ；y o k o ie ta 1 ，2 0 0 2 ；a p s e e ta 1 ，2 0 0 2 ；z h u ，2 0 0 3 ) ，將n a + 隔離在液泡中，不但可以降低細胞液中n a + 的濃 度，還能調節細胞內滲透壓，使細胞能在高赫環境中吸收水分( z h u , 2 0 0 3 ) 。 n h x 基因在n a 十的液泡區隔化中起著關鍵作用。在本論文的第一章1 2 部分 將做詳細介紹。 ( 4 ) n a + 流動的能量來源 細胞內n a + 流動的能量主要來源于a t p a s e s 通過水解a t p 推動質子跨過細胞 內的膜結構，從而產生的膜兩側電化學梯度( d u p o n t , 1 9 9 2 ；s z e ，1 9 8 5 ；s e r r a n o 。e t a 1 ，1 9 8 9 ；p a l m g r e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；g a r b a r i n oe ta 1 ，1 9 8 8 ；s t a a le ta 1 ，1 9 9 1 ) 。m a n s o u r 等( 2 0 0 3 ) 認為，在細胞質膜上，質膜a t p 酶( p - a t p a s e s ) 水解a t p 所產生的 質子梯度為質膜上的n a + h + 轉運蛋白將n a + 運出細胞提供了能量；類似的，在液 泡膜上，液泡膜a t p 酶( v - a t p a s e s ) 和液泡膜焦磷酸酶( v - p p a s e ) 所產生的質 子梯度為質膜上的n a + h + 轉運蛋白將n a + 運入液泡提供能量。主要關系圖1 - 1 所 示： 中山人學塒。論文 荊化樹耐豁相關基洲的克降j 表_ i 占 m 馘fm a m c 榭r 斟d | p l = ms d t n 撐| 甜，2 0 0 3 ；a 糾一9 0 0 圖1 - 1 植物細胞內n a + f i 蔬動的能量來源示意圖( 引自m a n s o u r e t a l 。2 0 0 3 ) f i g 1 - 1r e s o u r c eo f e n e r g yf o rt h ef l u xo f n a + i np l a n tc e l l 有研究表明，在艙脅迫下，甜土植物傾向于將n a + 通過質膜外排( l a u c h l ie t a 1 ，1 9 9 0 ) ，而鹽土植物則傾向于將n a + 和c l 留在液泡膜中( g r e e n w a ye ta 1 ，1 9 8 0 ) 。 ( 5 ) 信號調節途徑 目耵所知的與離子平衡相關信號調節途徑主要來自于對甜土模式植物擬南 芥的研究。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 在總結i i 人研究植物逆境脅迫相關信號途徑的基礎 上( i s h i t a n ie ta 1 ，1 9 9 8 ；z h u ，2 0 0 1 a ；s h i n o z a k ie ta 1 ，2 0 0 0 ；) ，結合實驗分析得出 擬南芥的n a + h + 轉運蛋白編碼基因參與的耐鹽相關信號途徑至少有三條：滲 透壓通過a b a 、m y c m y b 作用元件活化a t n h x l ；離子脅迫通過s o s 3 、s o s 2 活化s o s l ，再由s o s l 將n a + 外排；離子脅迫通過類似但不同于s o s l 的途徑 活化4 小h 耵。( 如圖1 2 所示) 中山人學碩1 ：論文桐花樹耐鹽相關基閃的克隧嚀表達 圖1 2 高滲透壓、離子脅迫調節彳t n h x i 。2 和5 的信號途徑( 引n y o k o ie t a 1 ，2 0 0 2 ) f i g 1 2h y p e r o s m o t i ca n di o n i cs t r e s ss i g n a l l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t ea t n h x l 2 a n dj e x p r e s s i o n 不久之后，z h uj k 于2 0 0 3 年提出了著名的s o s 信號轉導途徑。其主要觀點 為：細胞中過量的n a + 和高滲透壓能夠分別被尚未研究清楚的傳感器感受到； n a + 濃度增高所引發的信號能通過c a + 傳給s o s 3 s o s 2 蛋白激酶復合物，該復 合物可以活化s o s i ，從而將n a + 排出細胞外；另一方面，高滲透壓所引發的 信號能導致a b a 的合成，而a b a 將使a t n h x l 和其他一些基因的轉錄水平上 調，進而通過a t n h x l 的轉錄上調加快將細胞液中n a + 的運入液泡產生區隔化效 應；n a + 的積累有可能通過抑制a k t ! 進而阻礙的k + 攝入。( 如圖1 3 所示) 進一步的研究表明，液泡膜上的n a + w 轉運蛋白也受到s o s 途徑調控，而s o s 途徑本身也有分支( q i ue t a l , 2 0 0 4 ) ?？梢娪嘘Pn a + h + 轉運蛋白編碼基因的信號 調節是極為復雜的，仍有待進一步深入研究。 5 中山人學頌l ：論文 桐托樹耐鹽相關基吲的克降表達 圖1 3 在赫脅迫下維持細胞液中低n a + 濃度的離子轉運蛋白的表達、活性調節信 號途徑( 引自z h u 2 0 0 3 ) f i g 1 3s i g n a l i n gp a t h w a y st h a tr e g u l a t et h ee x p r e s s i o na n da c t i v i t i e so f i o n t r a n s p o r t e r st om a i n t a i nal o wc y t o p l a s m i cc o n c e n t r a t i o no f n a + u n d e rs a l ts t r e s s o 植物細胞內心的濃度維持 關于植物細胞內維持k + 濃度的分子機理研究并不深入，但也有一些實驗證明 部分與k + 轉運相關的基因調控受到赫脅迫影響，如：豁脅迫會導致擬南芥根中的 k 5 轉運蛋白編碼基因a t k c l 轉錄水平上調( p i l o t e t a l 。2 0 0 3 ) ，而在另一些植物 ( c o m m o ni c ep l a n t ) 中鹽脅迫能提高k m t l k t k a t 基因家族成員) 和一些 h a k k u p ( 高親和性k + 轉運蛋白k + 攝入轉運蛋白) 的轉錄水平，同時降低刪丌 似k t k a t 基因家族的另一成員) 的轉錄水平( s u e ta 1 ，2 0 0 1 ；s ue ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 這些受到赫脅迫調節的基因可能與植物耐鹽相關，但需要進步的實驗證明。 1 1 1 2 細胞滲透調節 鹽分的次生脅迫主要是滲透脅迫，其對植物引起的主要脅變是細胞脫水。植 物主要通過避脫水來適應這種次生脅迫，而最有效的避脫水措施就是植物細胞的 滲透調節。所謂滲透調節，是指植物生長在滲透脅迫條件下，其細胞在滲透上 有活性和無毒害的溶質( 滲透保護物質) 主動凈增長的過程，這種增長的結果是 6 中山人學碩士論文桐花樹耐鹽相關基閡的克隆與表達 細胞濃度增加，滲透勢降低，使其在低滲透勢生境種能夠吸收水分( 林棲 風, 2 0 0 4 ) 。y a n e e y 等( 1 9 8 2 ) 認為，滲透保護物質是一類無毒的小分子復合物， 除了增加滲透壓外，還有在細胞內起穩定蛋白質和細胞的膜結構的作用。a p s e 等( 2 0 0 2 ) 認為，通過在細胞液中聚集滲透保護物質，能夠增加細胞液的滲透勢， 從而使植物細胞在細胞外界高滲壓和液泡內聚集高濃度n a + 、c l 的情況下仍然有 可能保持質膜和液泡膜內外的滲透壓平衡。從短期來看，這種平衡可以避免細胞 失水；就植物在鹽脅迫環境下長期生存而言，這種平衡能夠維持細胞的正常形態， 吸水和生長。 目前研究比較多的滲透保護物質，主要有脯氨酸( k i s h o r e t a l 1 9 9 5 ；r o o s e n s e t a l ，1 9 9 9 ；h o n g e t a l ，2 0 0 0 ；h u a e t a l ，2 0 0 1 ；n a n j oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、甜菜堿( r o n t e i n e ta 1 ，2 0 0 2 ；r a t h i n a s a b a p a t h i ，2 0 0 0 ；s a k a m o t oe la 1 ，2 0 0 0 ；h a y a s h ie ta 1 ，1 9 9 7 ； p r a s a de ta 1 ，2 0 0 0 ；h u a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ) 、四氫嘧啶( o n oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 、海藻糖 ( g o o d i j ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 等。但這些物質的具體作用方式、調節機理在目前仍不是 完全清楚。其中，脯氨酸的分子機理已有較為深入的研究。 早在1 9 9 5 年，k i s h o r 等就發現在煙草中過量表達脯氨酸合成途徑前兩步的關 鍵基因a 1 一p y r r o l i n e - 5 - - e a r b o x y l a t es y n t h a s e ( p 5 c s ) 和a l - p y r r o l i n e - 5 - c a r b o x y l a t e r e d u c t a s e ( p 5 c r ) 能夠有效提高轉基因植物中的游歷脯氨酸含量，然而，植物體內 的脯氨酸代謝卻遠遠不止于此。更為深入的研究表明，植物體內的游離脯氨酸能 夠抑制脯氨酸降解的關鍵酶脯氨酸脫氫酶，并得到了實驗證據的支持( r o o s e n s e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同時，p 5 c r 基因啟動子分析表明p 5 c r m r n a 的翻譯水平在脯氨酸 濃度增高的情況下下降，而5 非轉錄區的一段9 2 b p 的序列在鹽脅迫條件下使 p 5 c r m r n a 更為穩定，并抑制其翻譯( h u ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。此外，n a n j o 等人( 2 0 0 0 ) 還通過反義c d n a 轉化降低脯氨酸脫氫酶表達，從而使轉基因擬南芥的脯氨酸水 平在無鹽脅迫條件下和鹽脅迫條件下分別為未轉基因擬南芥中脯氨酸水平的兩 倍( 1 0 0 u g g 鮮重) 、三倍( 6 0 0 u g g 鮮重) 。 1 1 1 3 生成抗氧化劑減少活性氧傷害 鹽脅迫給植物帶來傷害的另一個主要方面是由活性氧自由基r e a c t i v eo x y g e n s p e c i e s ( r o s ) j 粼( z h u 2 0 0 1 b ) 。活性氧自由基是植物的葉綠體和線粒體代謝 7 中山人學壩| 論文 0 花樹耐鹽相關皋川的克降j 表達 在逆境脅迫下發生改變而生成的類有害物質，包括超氧陰離子s u p e r o x i d e r a d i c a l s ( 0 2 一) 、過氧化氫、h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) 、羥基自由基h y d r o x y lr a d i c a l s ( o h ) 等( a p s e e la 1 ，2 0 0 2 ) 。它們對于細胞內的蛋白質、核酸、膜脂質等成分造 成嚴重傷害( h a l i w e l le ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 為了避免活性氧自由基的傷害，植物細胞內一些與氧化還原相關的酶發揮了 重要的作用。r o x a s 等( 1 9 9 7 ) 研究表明，過表達谷胱甘肽過氧化物酶( g x p ) 和谷胱甘肽s 轉移酶( g s t ) 的煙草在鹽脅迫條件下能夠比未轉基因的煙草對照 株更好地萌發和生長。k o v t u n 等人( 2 0 0 0 ) 的研究表明，一種能夠介導氧化脅迫 反應的有絲分裂原活化蛋白激酶n p k i 與耐鹽相關。另外，在擬南芥的一種突變 體p s t l 中， 由于與氰化脅迫相關的一個負調控子發生了突變，從而使筇r ，突變 體擁有了比詐常擬南芥更加耐鹽的能力( t s u g a n ee ta 1 1 9 9 9 ) 。 此外，z h u ( 2 0 0 0 ) 認為一些滲調劑如：甘露醇、果聚糖、海藻糖、芒丙醇、 脯氨酸、氨基乙酸等和一些非酶的蛋白質如：大麥h v a l 、c b f d r e b s 能夠增強 植物耐鹽能力很可能也與減少植物細胞內活性氧有關。其中具有代表性的推測 是：s h e n 等( 1 9 9 7 ) 通過將甘露醇引入植物葉綠體的方法提高植物抗性，由于 葉綠體是植物細胞中產生活性氧自由基的主要細胞器之一，所以這種抗性被認為 很可能是由于進入葉綠體的甘露醇清除了其中的活性氧自由基而產生的。 1 1 1 4 生長相關調節 鹽脅迫對植物的危害最終表現為抑制植物的詎常生長，而植物的生長是由其 細胞的生長和分裂構成的。因此，通過影響細胞生長、分化相關基因的表達調控 而造成抑制植物的正常生長也是鹽脅迫對植物危害的主要方面之一。有關這一方 面的分子機理研究并不深入，但仍有部分受鹽脅迫影響的植物生長相關基因得到 了實驗證明。 w a n g 等( 1 9 9 8 ) 研究表明，在擬南芥中，脫落酸能夠誘導一種細胞周期依賴 性蛋白激酶抑制子i c k l ，其產物i c k i 蛋白能夠通過降低細胞周期依賴性蛋白的 活性來抑制細胞分裂。而赫脅迫會導致植物體內脫落酸的合成增加，從而通過使 i c k l 表達上調、細胞分裂減少最終實現抑制植物的生長。 此外，轉基因實驗表明脅迫相關基因c b 刀。d 兄融，爿4 乃培7 能夠減緩被轉入 中山大學碩士論文 桐花樹耐鹽相關基瞰的克隆與表達 這些基因的植物生長( l i ue t a l ，1 9 9 8 ；h j e l l s t r o me ta 1 ，2 0 0 0 ；h o l m s t r o me ta 1 ， 1 9 9 6 ) ，而這些基因都與植物細胞生長、分裂相關，能夠抑制植物生長( l i u e ta 1 ， 1 9 9 8 ；s o d e n n a ne ta l 一19 9 6 ) 。 1 1 2 w x 基因研究進展 植物n h x 基因的主要功能是編碼植物細胞液泡膜上的n a + h + 轉運蛋白，將 細胞液中n a + 運入液泡，從而維持細胞液中的低n a + 濃度，保持細胞內的離子平 衡，這對于植物在鹽脅迫條件下生存有著至關重要的作用。( n a s se ta 1 ，1 9 9 7 ； a p s ee ta 1 ，1 9 9 9 ；b l u m w a l dc ta 1 ，2 0 0 0 ；h a s e g a w ae ta 1 ，2 0 0 0 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ；) 因此，關于植物n h x 基因的研究長期是耐鹽相關基因研究中的熱點，其中又以 擬南芥n h x 基因家族最為清楚。 1 2 2 1a t n h x 基因家族研究進展 在a t n h x 基因功能方面，早在1 9 9 9 年，o a x i o l a 等的研究就表明擬南芥中 與酵母n h x 基因同源的基因a t n h x l 能夠抑制酵母n h x l 突變體的一些表型，并 且用2 5 0 r a mn a c l 或2 5 0 m mk c i 處理6 小時會引起擬南芥中的a t n i - i x i m r n a 增加。q u i n t e r o 等( 2 0 0 0 ) 也通過類似的實驗證明了a t n h x l 能夠替代酵母n h x l 的功能，并且n a c i 和a b a 都能提高a t n h x i 的轉錄水平。d 訓e y 等( 2 0 0 0 ) 進 一步證明了a t n h x l 能夠使細胞液中的n a + 進入液泡。 在a t n h x 的編碼蛋白定位、轉錄表達方面，a p s e 等( 1 9 9 9 ) 的研究證實了 a t n h x l 蛋白定位于液泡膜上。y o k o i 等( 2 0 0 2 ) 也通過實驗證實了a t n h x 2 同 樣定位于液泡膜上，并且通過n o r t h e r n 技術發現a t n h x l ，a t n i - 1 x 2 在擬南芥莖、 根中都有較強轉錄，a t n h x 3 在根中轉錄明顯而在莖中僅有弱轉錄，a t n h x 5 在 莖、根中有轉錄，a t n h x 4 、a t n h x 6 在莖、根中轉錄不明顯；s l l i 和z h u ( 2 0 0 2 b ) 通過實驗發現a t n i - i x l 在擬南芥生長發育的各階段都有表達，因而很可能具有抗 鹽之外的普通生理功能，并且a t n h x l 在n a c ! 、a b a 、k c ! 誘導下轉錄水平上 調，而干旱和寒冷脅迫則不能，同時，通過對比不同擬南芥突變體( a b i l j ， a b i l 2 ，a b a 2 - 1 、a b a 3 ，s o s l ，s o s 2 、s o s 3 ) 在n a c ! 、a b a 處理下的轉錄 情況，得出a t n h x l 的表達依賴a b a 而非s o s 途徑。另外其編碼蛋白很可能與 9 山人學碩i ：論文枷1 飩樹耐鹽相關基斟的克降j 表達 k + 的轉運有關。 后來的許多轉基因實驗都進步展現了a t n h x l 對植物耐鹽的重要作用，其 。 巾具代表性的成果有：擬南芥中a t n h x l 的過表達能使其生長于2 0 0 m mn a c l 中，并伴隨有a t n h x l 的活性、轉錄產物、編碼蛋白都升高的現象( a p 睇e ta 1 。 1 9 9 9 ) ；被轉入a t n h x l 的番茄能在2 0 0 m mn a c i 中生長、結果，并且其果實中 不富集n a c i ，因而不影響其食用( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 1 ) ；被轉入a t n h x l 的小麥能 詛極高鹽堿條件下具有高于普通小麥的萌發率和產量，并能保持細胞內的低n a + 島k + 水平( x u ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 此外，眾多的研究表明，a t n h x 基因是植物耐鹽相關信號途徑中的重要組 成成分。( 詳見本文第一章的1 1 1 1 ( 5 ) 信號調節途徑) 1 2 2 2 其它植物n h x 基因研究進展 隨著擬南芥中a t n h x 基因家族的重要性為人們所逐漸認識，其他植物的n h x 叢因克隆和表達、功能研究也在不斷地進行著。 關于單子葉植物中j 科基因的研究主要有：f u k u d a 等( 1 9 9 9 ) 克隆得到水稻 的n h x l ，并通過系統發育分析推測其定位于液泡膜上。之后，f u k u d a 等( 2 0 0 4 b ) 進一步通過試驗證明其編碼蛋白確實定位于液泡膜，而且其轉錄水平在n a c i 、 k c i 作用下上調，將o s n h x l 轉入水稻后能有效提高轉基因水稻耐鹽能力。w u 等 ( 2 0 0 5 )