SSR標記,一、簡介、原理 二、多態性基礎 三、開發、前景,主講人： 高慧,一、SSR標記 原理,簡單序列重復(single sequence repeat）簡稱SSR s)或微衛星(m icrosatellite)序列大量地存在于大多數真核生物及部分原核生物基因組的非編碼區和編碼區中，由串聯的1- 6 個核苷酸重復片段構成，長度一般在100bp以下，具有長度的超變性。 原理:與微衛星序列相鄰的兩側區域保守性通常較高，可以在此保守區域設計一對特異的PCR引物，擴增其中的微衛星序列，通過聚內酞胺凝膠電泳，即可顯示出個體間在此位點的微衛星序列的多態性。,二、SSR標記 多態性基礎,目前研究過的所有植物中均存在著SSR多態性。絕大多數作物，如大豆、水稻、小麥、玉米、大麥等中，SSR位點上的等位基因數目可多達十幾個乃至幾十個，個別作物多態性水平較低。和其他DNA分子標記相比，單個SSR位點檢測到的等位基因個數和多態性指數(diversity index，用1- E可表示，其中P為某一位點第i個等位基因)是最高的。 對人類SSR的研究表明，核心序列的重復次數與SSR的長度多態性有密切關系。重復次數增加，SSR的長度多態性增高。這一趨勢也在一些作物中得到證實。不同重復類型SSR多態性水平存在差異，二核苷酸重復構成的SSR多態性水平要高于其他類型。同一類型SSR的不同位之間，其多態性水平也不一樣。有些種類SSR位點其多態性水平明顯高于其它位點.如在大豆的研究中發現7個 (ATT) n位點等位基因數目可多達11-26個;由AT重復構成的SSR甚至可區分遺傳基礎極其狹窄的日本梗稻育成品種。 (TAA/ATT) n類型SSR是小麥基因組中最豐富、多態性最高的三核苷酸重復類型SSR。但因(AT)n類型寡聚核苷酸探針容易形成二級結構，降低了篩選效率，影響了這一類型SSR的分離.然而現有研究表明，(AT)n類型SSR仍是可以分離的。,SSR標記的優勢,與其他分了標記如:如RAPD ,RFLP等相比，SSR標記具有以下的優點: （1）在植物基因組中大量地、隨機地分布，具有廣泛的位點變異，揭示比RAPD , RFLP更多的多態性. （2） SSR標記揭示的是單個位點上復等位基因的信息，為共顯性標記，能夠區分純合型和雜合型，提供完整的遺傳信息. （3）微衛星序列多態性可以用PCR方法檢測，不需要過多的分了克隆乎段，對DNA模板的要求不高，重復性好.因此成為在植物中日前運用最廣泛的分了標記之一，廣泛地運用于植物種質鑒定、分了標記連鎖圖的構建和群體遺傳學等諸多領域. 但是微衛星標記存在一個重要的局限性就是微衛星序列兩側區域在種間保守性往往較低.種間擴增微衛星標記僅僅局限于同一個屬或相近的屬的不同物種間的擴增，這大大限制了SSR標記在其他物種中的運用現在有一些從微衛星序列衍生而來的其他分了標記，不用分離單個微衛星位點而獲得多個位點指紋圖譜，如LSSRs、SAM 等，但由于多位點微衛星指紋圖譜帶型復雜，難以確定等位基因，大多為顯性標記，這限制了它們的運用的范圍,三、SSR標記的開發,傳統用于克隆單位點微衛星序列的方法包括以下步驟: (1)構建小片段或大片段的基因組. (2)篩選陽性克隆.通過傳統的影印或挑單菌落點膜的方法，把克隆轉移到尼龍膜上，經過固定后，用標記過的序列重復寡核有酸或含微衛星序列的探針與尼龍膜上的克隆點雜交，篩選出其中的陽性克隆. (3)測序、設計引物、優化PCR反應條件.獲得的陽性克隆經過確認后，全部或經過隨機挑選后測序，然后根據微衛星序列兩側保守區域的序列設計引物，優化PCR擴增的條件，獲得穩定、可靠的SSR標記。,微衛星標記分離技術,為了避免篩選文庫，現在有一些與其他成熟技術結合的分離微衛星標記的方法，包括: （1）運用RAM P和RA PD技術分離單位點微衛星標記 RAM P 利用5含有四個錨定堿基的微衛星引物結合不同的RA PD引物在基因組DNA中擴增，獲得片段包括兩頭帶反向微衛星序列的擴增片段(為USSR產物)、隨機擴增的片段(RA P產物)、隨機引物與微衛星基因座間的片段(SSR產物).用標記的5錨定引物擴增或經Southern 后在用標記的微衛星探針與之雜交后，再經過自顯影，可以得到只含微衛星標記的指紋圖譜.在RAM P和RAPD技術的基礎上，人們運用RAM P技術和RA PD技術擴增基因組DNA，得到擴增產物，然后用標記的微衛星的探針與PCR產物Southern雜交或用標記微衛星錨定引物，在PCR擴增后膠上直接觀測，選擇陽性條帶克隆22 i、或者首先克隆所有的PCR產物，制成微列陣，然后篩選克隆。 ( 2)利用1SSR技術分離單基因座微衛星序列 1SSR是1994報道的一種方法.這種方法是用3或5端帶有1一4個錨定堿基的微衛星引物，來擴增基因組獲得在兩端帶有相反排列的微衛星序列的DNA片段，經電泳后，顯示復雜的指紋圖譜.用1SSR引物在基因組DNA中擴增，獲得1SSR DNA片段，然后克隆，經測序后，根據微衛星序列間的DNA序列設計兩個巢式引物.然后運用巢式引物用“步查”的方法在不同酶切片段的基因組文庫中擴增，直至獲得微衛星序列的另外一側的序列，再設計微衛星位點另一端的引物。,5錨定PCR 分離SSR標記,（3）采用5錨定PCR ( 5-anchored PCR)分離SSR標記 采用的5帶有六個簡并堿基錨定的微衛星序列引物.這種引物錨定效果要比1SSR技術中的隨機錨定引物的特異性好，避免了引物在微衛星序列上的滑動.然后用這個單引物在基因組DNA中擴增，得到兩端帶有反向微衛星序列DNA片段，用T載體克隆PCR產物，然后用Southern雜交的方法，在高嚴謹度的條件下，獲得含微衛星序列的克隆，然后對這些陽性克隆進行測序，根據獲得的序列，在微衛星序列的側翼設計引物，用5錨定簡并引物結合微衛星特異性引物，經擴增后獲得單位點的SSR標記. 也可以通過步查獲得微衛星序列另一側的序列，并設計另一個引物，然后用成對的特異性引物來擴增單個微衛星位點. 5錨定PCR技術有兩個明顯的優勢，其一，可以簡單而快捷地建立SSR富集文庫.第二，對于大多數位點僅僅需要一個特異性引物就可以獲得位點特異的共顯性標記。因此在以后開發的分離單位點微衛星序列的方法中很多都運用了這種引物.,SAM PL技術分離SSR標記,SAMP是Witsenboer等1997創立的一種分離微衛星標記的技術.它同AFLP一樣具有擇性堿基的AFLP引物接頭的連接和預擴增的過程.但是在第二步選擇性擴增時，運用的是一個末端帶有3個選物和5錨定微衛星引物的組合進行PCR擴增，通過電泳獲得多位點的微衛星圖，通過不同的A FLP引物和5錨定引物的組合，可以揭示基因組DNA的所有微衛星位點的多態性. 然而用這種方法獲得的大多是顯性標記，共顯性標記占少數，因此有必要把具有重要信息的位點轉化為帶有有用信息的微衛星標記，基于這種想法H ayden Sharp( 2001)發表了一種改良SAM PL程序，獲得SAM PL圖譜，在分了標記連鎖圖上定位SAIVI(se-ectively anplified m icnsatellite)位點選擇有興趣的SAP位點，然后有選擇的克隆、測序，根據這個微衛星序列一側設計一個特異性引物，用與F fisher( 1996)相同的方法來獲得單位點的共顯性的微衛星標記.,構建富集微衛星序列的基因組文庫,構建富集微衛星序列的基因組文庫是現在分離單微衛星位點的主要方法，它與傳統方法不同在于有一個富集微衛星序列的步驟，按照富集方法的不同，主要有兩種方法: 引物延伸反應富集微衛星序列 它的大致步驟為:首先建立以噬菌粒或M13噬菌體為載體的小片段基因組文庫這種文庫叫初級文庫.然后用輔助噬菌體、超感染初級文庫，產生單鏈環狀DNA，以單鏈DNA為摸板，用微衛星序列為引物合成雙鏈DNA，然后富集雙鏈.其卞要步驟如下: （1）經酶切的基因組DNA與噬菌粒相連，連接產物轉化大腸桿菌菌株，構建初級文庫.在這種菌株.由于缺乏(IUT-P ase和UDG(尿哈陡一DNA糖基化酶)，在復制過程中(IUTP可以有效地代替cIITP摻入DNA中而不會被修復系統修復，因此可以積累含(IUTP的DNA. （2）用M13輔助I體超感染初級文庫，產生富含(IUTP的單鏈環狀DNA，并分離出這種單鏈環狀DNA. （3）以單鏈環狀DNA為模板，以微衛星序列為引物用PCR方法對含微衛星序列的DNA進行延仲，這樣雙鏈DNA大多數是含微衛星序列的. （4）轉化這種反應產物到(dut ung的野生型菌株，由于單鏈DNA的轉化率低，轉化得到的克隆大部分為雙鏈DNA.由于在此菌株存(IUTPase和U DG,可以利用自身的修復系統以雙鏈DNA n1:常鏈為模板替換另一條鏈中(IUTP替換為cITP,可以得到復制.而經轉化而來的少量的單鏈環狀DNA由于尿哈陡一DNA糖基化酶降解cIUTP的作用，得不到有效的復制.這樣構建出的文庫中就富集了很高比率的含微衛星序列的克隆. 選擇雜交法富集微衛星序列 這是現在很多研究人員采用的方法.它在傳統構建基因組文庫的基礎上加上了選擇雜交富集含微衛星序列的片段、PCR擴增的過程.雜交的方法有兩種:1)把含有核有酸重復的探釗或寡核有酸重復序固定在尼龍膜9.2)把核有酸重復的探針1、寡核有酸重復序列的5端生物素化，然后固定在帶有鏈霉親和素的磁珠上.通過雜交、洗脫非特異雜交DNA片段后，再用PCR擴增富集洗脫的特異雜交的片段，然后轉化大腸桿菌，構建富集微衛星序列的基因組文庫。,STMP,STMP技術一種快速、高效分離SSR標記的技術 STMP(Sequence一tagged m icnsatellite pnfiling)是H ayden ( 2001年)在Nucleic acxlresearch發表的文章中介紹的一種方法.它利用SAGE ( serial analysis of gene expressxn)原理，建立含微衛星序列標簽文庫，可以快速大通量(比常規高25倍)的分離單位點微衛星序列.它通過擴增含有微衛星序列片段，再用限制性內切酶在識別位點下游酶切這些片段，產生了標簽序列.雖然這段序列僅有16飾但卻可以區分4 3x10倒6)個不同的微衛星位點，大大超過了在植物中估計含有的微衛星位點的數日.然后把這些標簽序列連接起來形成串聯體，再把它連接到載體上，經測序后，獲得串聯體中各個標簽的序列.由于在一個載體上串聯有平均25個左右的標簽，所以一個克隆就可以鑒定出多個微衛星位點.在串聯體中標簽和標簽間由一段序列(內切酶識別序列)來標志，這樣就可以分辨每個標簽和標簽的方向.每個標簽長度足夠設計引物可以用在基因組DNA或在酶切的基因組DNA擴增片段池中分離SSR標記了.它包括:雙酶切、加接頭經PCR擴增產生帶有PstI,M seI頭的擴增片段、用接頭引物與微衛星錨定引物擴增帶有微衛星序列的片段、富積帶有微衛星序列的擴增片段、用且s型限制性內切酶酶切產生標簽序列(啤)、在3一端加上B sgl接頭并擴增、用單酶切(EcoRl)在標簽兩端產生粘端、連接標簽形成串聯序列、克隆及測序.,前景計算機自動化,以前尋找SSR的方法是通過構建文庫，合成短重復序列分子標記做Southem雜交，然后將SSR兩端序列測出來，再設計引物，篩選多態性，將分子標記整合到遺傳圖譜上.周期長，費用大，所以有必要在以后基因組時代使用基于全基因組的計算機自動化SSR標記篩選方法。因而有必要充分的利用不斷增加的基因組序列數據資源。通過這個項目能夠建立一整套的SSR分析方法及軟件開發的流程，并且繪制出水稻全基因組的遺傳圖譜。SSR標記與AFLP、RAPD等標記均是以PCR為基礎的分子標記，但SSR標記的特殊之處在于其具有針對性的微衛星結構域，不象其他屬于隨機多態性標記，重復率要受到影響，所以尋找SSR標記的方法也是不一樣的。這樣就可以在進行SSR在基因組中的分布及其與基因組結構進化關系的研究的同時，得到一套反映等位基因片段多態性極高的SSR標記:從另一個角度，這又為其他特異PCR標記的研究和開發提供了許多借鑒和有價值的參考。SNP具有比SSR更高的多態性，大約高10一100倍，但尋找和研究SNP的技術和方法還在發展之中，一般需要依賴DNA芯片等設備，近階段還不能象SSR一樣在普通實驗室中得到應用，也不現實.如果要完整開發、研究SNP，和STS、sCAR、Es