精品論文，值得推薦熒光偏振和多重聚合酶鏈技術在肺炎支原體、肺炎衣原體檢測中的應用 作者：姜怡王玲伍雪艷閆小君董秀珍 【摘要】 目的: 應用多重聚合酶鏈反應和熒光偏振檢測技術建立一種方便可靠、簡單經濟的肺炎支原體、肺炎衣原體DNA同步檢測方法. 方法: 以與肺炎衣原體、肺炎支原體16SRNA序列互補的特異、無交叉反應的兩對引物在同一反應體系中行多重聚合酶鏈反應擴增陰陽性對照及521例患兒咽喉分泌物，將熒光偏振檢測技術與模板指導的DNA末端延伸反應（TDI FP）結合，對樣本PCR擴增產物進行進一步檢測，并與測序方法結果比較. 結果: 應用多重聚合酶鏈反應和TDI FP技術檢測患者521例，肺炎衣原體感染陽性121例，肺炎支原體感染陽性113例，與測序檢測方法符合率100%，其中肺炎衣原體、肺炎支原體雙重感染陽性10例. 結論: 建立了基于熒光偏振技術檢測肺炎衣原體、肺炎支原體的新方法，具有良好的特異性,方便簡單,無需標記探針,可用于臨床檢測. 【關鍵詞】 肺炎衣原體；肺炎支原體；熒光偏振；多重聚合酶鏈反應 【Abstract】 AIM: To develop a simple，economical，accurate and practical method for the detection of Mycoplasma pneumoniae (MP) and Chlamydia pneumoniae (CP) using Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization （TDIFP） and a multiple PCR. METHODS: Twopair primers of MP and CP were used to amplify DNA of positive and negative controls and 521 samples by a multiple PCR, then the PCR products were identified by TDIFP：MP and CP specific probe hybridization and special fluorogenic label ddNTP incorporation. A fluorogenic ddNTP was directly added to the end of probe under the direction of template. The results were measured by a fluorescencepolarization microplate reader and compared with the results of sequencing. RESULTS: There were 113 patients infected with MP, 121 patients infected with CP, 10 with double infections. Compared with the results of sequencing, the results measured by TDIFP showed an excellent overall agreement when single infection was taken into account. The proposed method could detect single or multiple infection by a multiple PCR, but DNA sequencing method was limited. TDIFP method reached the detection level (10 copies) and the data of FP values showed excellent reproducibility. CONCLUSION: The proposed method allows a sensitive, special, simple and economical detection of MP and CP by a multiplePCR without any use of label probes. It is expected to be an extremely useful tool in clinic. 【Keywords】 Mycoplasma pneumoniae; Chlamydophila pneumoniae; fluorescenc polarization, multiple PCR 0引言 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, CP)是引發呼吸道感染的常見病因，患者的起始癥狀及胸部X線特征與其他病原體特別是SARS病毒引起的呼吸道感染極其相似而易誤診. 因此，及早快速準確地檢測MP,CP感染，對鑒別診斷和預防控制相關疾病非常重要1-2. 我們采用熒光偏振檢測與模板指導的末端延伸反應檢測技術相結合（TDIFP）的方法，建立了在同一反應體系中應用多重引物，同步檢測MP,CP感染的方法. 1材料和方法 1.1材料 標本采集于在第四軍醫大學唐都醫院、西京醫院、西安交通大學第二醫院兒科的就診患者521例,在24 h內未使用任何抗生素. 用無菌咽試子插入咽喉處旋轉涂抹, 停留1 min后取出試子重懸于500 L PBS中，置于-20備檢. pGEMTEasy Vector System TA Cloning試劑盒(Promega Corporation公司)，BigDye Terminator Cycle Sequenceing試劑盒、ABI 377（美國AB公司），ddGTPR110/ddCTPTAMRA,核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶、熒光偏振檢測儀（美國Perkin Elmer公司）. 含CP，MP保守區基因質粒由本研究所提供. DNA引物及探針由上海博亞公司合成，據GenBank基因序列及引物合成原則選取CP(CP 16S ribosomal RNA)，MP(MP 16S ribosomal RNA)保守區序列設計各自特異、互不交叉的引物、探針及摻入堿基，擴增片段長度分別為160, 275 bp. CP：引物5 tatttgacaactgtagaaatacagc 3， 5 ttagagttccccaccctaagtgctggc 3，探針5 cgcaaggacagatacacaggtgctgcatgg 3，摻入堿基ddCTPTAMRA，MP：引物5 aaaggacctgcaagggttcgttat 3，5 ctctagccattacctgctaaagtc 3，探針5 agtagaatagccacaatgggactgacac 3，摻入堿基ddGTPR110. 1.2方法 1.2.1DNA的提取及多重PCR擴增將分泌物在500 L PBS中反復震蕩洗滌擠干，12 000 g離心2 min, 棄上清， 沉淀震蕩重懸于200 L PBS中， -20反復凍融3次, 煮沸, 12 000 g離心5 min, 留上清作模板. 取DNA模板5 L，擴增靶片段DNA. 擴增條件：dNTP 150 mol/L，引物各20 pmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L. 94 5 min變性, 94 1 min，50 2 min, 72 5 min，30個循環. 含CP，MP16SRNA基因質粒DNA混合物為陽性對照，不含待測靶基因的同源質粒DNA為陰性對照. 1.2.2PCR擴增產物的分析采用CP,MP特異序列雜交與模板指導的末端堿基摻入延伸反應（TDIFP）對擴增產物分析. PCR產物與核酸外切酶I、蝦堿性磷酸酶37孵育1 h，消化剩余的引物和dNTP，95 15 min滅活酶活性. 然后以此產物為模板，分別以CP,MP特異探針及標記的ddGTPR110/ddCTPTAMRA為底物，在DNA聚合酶及其緩沖液中于95 2 min, 95 15 s，45 30 s,25個循環，特異序列雜交并引導模板指導的末端堿基ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入延伸反應(圖1)，分別于波長535,595 nm 檢測R110,TAMRA摻入熒光偏振值（mp）. 1.2.3敏感性測定以10倍比例分別將CP,MP陽性對照的質粒倍比稀釋直至10ag(1拷貝)，PCR擴增，產物進行TDIFP法分析判讀. 1.2.4重復性測定分別對陰陽性對照及521例標本的熒光偏振值重復檢測10次，觀察FP變化. 1.2.5與測序方法對比應用試劑盒將隨機抽取TDIFP檢測CP,MP陽性各50例標本PCR產物連接至pGEMTEasy質粒載體中，測定插入片段的DNA序列，在NCBI BLAST2.0中確定所測序列，并與TDIFP方法檢測結果比較. 統計學處理： 檢測結果用SPSS 10.0軟件經2檢驗. 2結果 21TDIFP法檢測檢測陰、陽性對照與標本DNA經2對引物擴增后，分別與CP,MP的特異探針及熒光標記堿基反應，分別檢測R110，TAMRA熒光偏振值. 陰性對照無特異的雜交反應并ddGTPR110/ddCTPTAMRA摻入，TAMRA，R110值均未增高，CP,MP陽性對照分別與相應特異的探針發生雜交反應并ddGTPR110或ddCTPTAMRA摻入，R110或TAMRA值分別增高；TAMRA及R110值均增高, 則CP,MP雙重陽性(表1). 521例標本中CP感染陽性121例，MP感染陽性113例，其中CP,MP雙重感染陽性10例.表1對照與標本的R110，TAMRA熒光偏振值（略） 2.2敏感性測定對陽性對照質粒倍比稀釋的PCR擴增產物進行的TDIFP分析表明，該法敏感度可達10拷貝. 2.3重復性測定在521例標本中，熒光偏振值檢測10次的變化幅度小于10 mp，無統計學意義. 2.4與測序方法對比50例單純CP，MP感染與測序方法符合率達98% (P>0.05). 3討論 CP，MP是引發急性呼吸、循環系統感染的主要病原體，在無實驗室依據時臨床難以與其他病原進行鑒別3-4. 傳統的抗原檢測易受到采樣、運送、保存、用藥及抗原交叉反應等多種因素的干擾. 基因診斷直接檢測臨床標本感染病原體的基因, 屬病因診斷，在疾病預防、診斷及療效考核等各方面都有重要意義5. 經典的采用瓊脂糖凝膠電泳等手段對檢測結果觀察分析，人為誤差大，假陽性、假陰性率高，實時熒光定量PCR檢測技術需特異標記的探針，實驗成本增加，價格昂貴6. 熒光偏振技術檢測偏振光強度而非熒光強度，靈敏度高，快速、簡單和準確. TDI反應是在DNA模板引導下的引物末端延伸反應，通過引物擴增、確定特異探針與靶DNA的識別雜交及在模扳指導下在特定位置特異鹼基摻入三重把關，決定基因型，從而確保反應的特異性7. 我們在一次PCR反應體系中加入2對高度特異、互不交叉的CP, MP引物，針對2個靶DNA進行擴增，再利用TDIFP基因檢測技術，使用2個特異探針及特異末端終止堿基，對PCR產物鑒定，檢測CP, MP，使得對感染的檢測快速、可靠、特異及操作簡單，尤其能降低多重混合感染的漏診率和檢測成本，提高了檢驗效率，與測序檢測方法符合率高, 敏感度高達10拷貝，不失為高通量的、臨床實驗室實用的基因診斷新方法. 【參考文獻】 1陳小友，賈土妹，陳黎勤. 肺炎衣原體和肺炎支原體MP感染與兒童哮喘的關系J. 浙江預防醫學，2006， 18（10）：50-54. 2姚瑩. SARS診斷的鑒別思考J. 中國誤診學雜志，2005,5(5)：959-960. 3Liu G, Talkington DF, Fields BS,et al. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in young children from China with communityacquired pneumoniaJ. Diagn Microbiol Infect Dis, 2005,52(1):7-14. 4Sinaniotis CA, Sinaniotis AC. Communityacquired pneumonia in childrenJ. Curr Opin Pulm Med, 2005,11(3):218-225. 5Ginevra C, Barranger C, Ros A,et al.Development and evaluation of Chlamylege, a new commercial test allowing simultaneous detection and identification of Legionella, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma pneumoniae in clinical respiratory specimens by multiplex PCRJ. J Clin Microbiol, 20