1、,Tianjin Medical University,天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院體內(nèi)藥物分析第三章,考馬斯亮藍法（Bradford法）,徐 亮,一、基本原理,酸性溶液兩者結(jié)合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。,二、試劑與器材 試劑： （1）考馬斯亮藍試劑： 考馬斯亮藍G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000ml, 濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 （2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液： 純的牛血清血蛋白，根據(jù)其純

2、度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。 2. 器材： （1）可見光分光光度計 （2）旋渦混合器,三、操作方法,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2、樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 另取兩支干凈的試管（做一重復(fù)），加入合適濃度的待測樣品，使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，測定方法同上，由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量。,四、Bradford法的優(yōu)缺點,1、優(yōu)點,（1）靈敏度高：蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測定的靈敏度較高

3、，最低檢出量為1ug蛋白質(zhì)。,（2）測定快速、簡便：染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2分鐘，結(jié)合物的顏色在1小時內(nèi)是穩(wěn)定的。,（3）干擾物質(zhì)少。,2、缺點,四、Bradford法的優(yōu)缺點,（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時最好選用 球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。,（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH,（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。,五、注意事項,1、 如果要求嚴(yán)格，最好在試劑加入后的520min內(nèi)測定光 吸收，因為這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。 2、 若選擇在旋渦混合器上混合，注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除。,六、思考題,說出你所