有限公司Co.,Ltd.文件名稱文件編號產品無菌檢測操作規程版本狀態V1.1頁碼第8頁有限公司Co.,Ltd.產品無菌檢測操作規程文件編號：HM-WI-SYS-0015版次：V1.1生效日期：20XX年04月10日分發號：文件變更記錄序號更改原因更改內容更改后版本更改人/日期1新編制全部V1.02第一次修改6無菌檢驗前的準備V1.1產品無菌檢測操作規程目的通過無菌檢驗，確保滅菌后產品能夠達到無菌的要求。范圍適用于滅菌后醫療器械產品的無菌檢驗。檢驗依據《EN1174-1996醫療器械滅菌產品中微生物數量的評估》《中國藥典》（2020年版）《GB14233.2-2005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第二部分：生物試驗方法》《GB15980-1995一次性使用醫療用品衛生標準》儀器、設備百級層流超凈工作臺、電熱干燥箱、電熱恒溫培養箱、霉菌培養箱、壓力蒸汽滅菌器、集菌儀（器）、電子天平、pH計、冰箱、恒溫水浴鍋、酒精燈、三角燒瓶，接種環、無菌棉簽、鑷子，試管架，大試管若干等。無菌檢驗室的環境要求無菌檢驗應在環境潔凈度10000級下的局部百級的單向流空氣區域內進行。無菌實驗室潔凈度、風壓、溫度、濕度應滿足潔凈區環境要求。無菌檢驗前的準備6.1器具滅菌、消毒6.1.1滅菌試驗過程中與供試品接觸的所有器具必須采用可靠方法滅菌。可經電熱干燥箱160℃以上干烤2小時，或置壓力蒸汽滅菌器內121℃蒸汽滅菌30分鐘后使用（根據滅菌效果驗證決定滅菌參數）。所有的滅菌物品不應超過2周即用畢，否則應重新滅菌。6.1.2消毒凡檢驗中使用的器材無法滅菌處理的，使用前必須經消毒處理。如無菌檢驗室的試管架、電子天平、工作臺面、工作人員的手、橡膠吸頭等。可采用消毒劑浸泡或擦拭。消毒劑應每月更換，以防止產生耐藥菌株。6.1.3標識器具的滅菌、消毒后必須做好標識，標明滅菌、消毒時間和使用有效期。6.2人員、物料進入無菌檢驗室6.2.1開啟紫外線燈或臭氧發生器進行空間滅菌處理，消毒時間不得少于30min。6.2.2物料進入無菌檢驗室流程6.2.2.1脫包：進入無菌檢驗室的物品若有雙重包裝的，需將外包裝在傳遞窗/緩沖間拆除后，傳入試驗室。6.2.2.2消毒進入無菌操作室的所有培養基、供試品等的外表都應采用適用的方法進行消毒處理，以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗室。6.2.2.3傳遞查看所有進入無菌檢驗室的器具上的滅菌、消毒標識，是否在有效期內。符合要求的經傳遞窗傳入無菌檢驗室。6.2.3人員進入無菌檢驗室流程6.2.3.1更鞋脫衣在一更區脫去一般區工作鞋，穿上無菌檢驗室工作鞋；脫去一般區工作服。6.2.3.2洗手首先用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水連續沖洗20秒，洗凈泡沫。6.2.3.3更衣在二更區按照從上到下的順序穿戴無菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求褲子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有頭發。6.2.3.4手消毒用消毒液浸泡雙手5秒以上或用浸過消毒液的棉球擦拭雙手。消毒液可用洗必泰、新潔爾滅、碘伏、75%酒精等。6.2.3.5人員進入經緩沖間進入無菌檢驗室。6.2.4人員進入無菌檢驗室后，進一步用消毒液擦拭工作臺面，戴無菌手套無菌檢驗操作要求7.1全過程必須嚴格執行無菌操作，防止微生物污染。7.2使用玻璃器皿應輕取輕放，避免破損，以防培養物擴散。7.3所有操作均應在近火焰區進行，且不得有大幅度或快速動作，以免攪動空氣中的塵埃微粒。7.4使用金屬接種器具時，用前、用后均需灼燒滅菌。7.5在接種培養物時，動作應輕、準，防止培養物濺出，產生汽溶膠，造成污染。7.6操作過程中所有的帶菌物品，用后均應作消毒、滅菌處理。可在檢驗過程中隨用隨時放入消毒液缸內浸泡或消毒桶內，或在檢驗完成后經傳遞窗傳至一般區，立即用壓力蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30分鐘。培養基制備8.1需氧菌、厭氣菌培養基（硫乙醇酸鹽流體培養基）的制備8.1.1使用按處方生產的符合規定的硫乙醇酸鹽流體培養基脫水干粉，嚴格按照使用說明書配制8.1.2硫乙醇酸鹽流體培養劑氧化層的顏色要求在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5，否剛需經100℃水浴加熱到粉紅色消失（不超過20分鐘）迅速冷卻，只限加熱一次，并應防止被污染。8.2霉菌培養基（胰酪大豆胨液體培養基）的制備8.2.1使用按處方生產的符合規定的胰酪大豆胨液體培養基脫水干粉，嚴格按照使用說明書配制8.3培養基配制后應盡快滅菌，避免微生物繁殖。一般采用高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘。8.4制備好的培養基應在2～25℃保存，在3周內使用。8.5培養基的無菌性檢查每批配制的培養基均應進行無菌性檢查（可與產品無菌檢驗同步進行）。檢查時，每批培養基隨機取不少于5支（瓶）培養14天，應無菌生長。9稀釋液、沖洗液的制備9.10.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，濾清，分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內，121℃滅菌30分鐘后，于4℃保存備用。分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內，121℃滅菌30分鐘后，于4℃保存備用9.2pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鉀7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000mL。微溫溶解，濾清，分裝后置入壓力蒸汽滅菌器內，121℃滅菌30分鐘后，于4℃保存備用。9.3浸提介質9g/L無菌氯化鈉溶液，可直接從有證單位采購。對照菌液制備10.1無菌檢驗所用的菌株傳代次數不得超過5代。10.2取金黃色葡萄球的普通瓊脂斜面培養物，接種一白金耳至營養瓊脂培養基內，在30～35℃培養18～24h后備用，同時制備0.9%氯化鈉溶液加入在6支小試管內，每支試管內加9.0mL的0.9%氯化鈉溶液，在壓力鍋內經121℃滅菌30min備用。將已配好的金黃色葡萄球菌培養菌液取1.0mL加入第一支小試管內，稀釋成濃度1:10的菌液；取第一支試管內1.0mL菌液加入第二支小試管內，稀釋成濃度1:100的菌液，同法稀釋成濃度1:106（每ml含菌量≤100CFU）即可。10.3采用平皿計數法測定活菌數。無菌檢驗培養溫度硫乙醇酸鹽流體培養基，置30～35℃培養。胰酪大豆胨液體培養基，置23～28℃培養。無菌檢驗12.1如產品注冊標準中明確“產品應經過一個確認過的滅菌過程”，則執行12.1項下各項。12.1.1放樣每個滅菌批次按已驗證的滅菌工藝，在滅菌柜內相應的位置放置適量菌片，滅菌后對菌片進行無菌檢驗。12.1.2菌片貯存滅菌前、后菌片應按菌片說明書規定條件保存。（REVEN公司菌貯存溫度為15～27℃）。12.1.3接種開啟超凈工作臺單向層流，在此環境下，分別將滅菌后的菌片成對放入已滅菌的硫乙醇酸鹽流體培養基中。同時以金黃色葡萄球菌作陽性對照，以未接種的硫乙醇酸鹽流體培養基和未接種的胰酪大豆胨液體培養基作為陰性對照。12.1.4培養陽性對照管于30～35℃細菌培養箱培養48～72小時。其余硫乙醇酸鹽流體培養基于30～35℃培養7天。胰酪大豆胨液體培養基于23～28℃培養7天。12.1.5結果判定培養后，陽性對照應有菌生長，陰性對照和被檢樣品未見需氣菌、厭氣菌和霉菌生長的為合格。12.2如產品注冊標準中明確產品應進行無菌檢驗，則執行12.2.1～12.2.5。12.2.1抽樣根據各自的產品注冊標準和相應產品出廠檢驗規程的規定，對成品庫內的產品進行抽樣。一般同一個滅菌批產品檢驗3～11個單位供試品。12.2.2供試液準備優先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培養基內培養的方法，如供試品不適宜直接投放，可按下列方法制備供試液，應使浸提介質充分洗提供試品的浸提表面，供試液制備應按無菌操作法進行，在制備后2小時內使用。根據供試品具體特性選擇下列方法：a)管類器具：按管內表面積每10cm2流過管內腔1mL浸提介質，流量約為10mL/min，收集到無菌的容器內。b)容器類器具：按容器內表面積每10cm2加入浸提介質1mL的比例，振搖數次。c)實體類器具：實體類器具按表面及每10cm2加入浸提介質1mL，振搖數次。收集上述沖洗液或浸提介質于無菌容器中。12.2.3接種12.2.3.1薄膜過濾法：優先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器），也可使用開放式薄膜過濾器。濾膜孔經不大于0.45μm。濾器和濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌，或直接采用無菌集菌器。a、如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯式集菌器，將供試液通過集菌儀過濾，使通過每只培養管的量基本均勻。然后通過集菌儀一只加120mL胰酪大豆胨液體培養基，另兩只分別加入120mL硫乙醇酸鹽培養基（其中一只做陽性對照，內加金黃色葡萄球菌液1mL）。另取一副二聯集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質120mL通過集菌儀過濾（每只約50mL），同法一只加硫乙醇酸鹽培養基120mL，另一只加胰酪大豆胨液體培養基120mL分別作陰性對照。b、如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50mL硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基的容器中，其中兩份作檢驗，一份作陽性對照。12.2.3.2直接接種法：適用于一次性使用注射針、一次性使用靜脈輸液針（包括輸液器、輸血器、注射器配套使用注射針）。a、敷料供試品：取規定數量，每個包裝以無菌操作拆開，于不同部位剪取約120mg或1cm×3cm的供試品，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養基中。b、無菌針頭：直接投入含15mL以上硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基的容器中。c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎斷，接種于各管足以浸沒供試品的適量培養基中。供試品按規定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基及胰酪大豆胨液體培養基的容器中，其中一份作陽性對照。每個容器中培養基的用量應符合：接種的供試品體積不得大于培養基體積的10%，或培養基的裝量足以浸沒供試品。每管培養基的最低用量——硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15mL，胰酪大豆胨液體培養基每管裝量不少于10mL。12.2.4培養、觀察上述含培養基的容器分別置規定溫度的恒溫培養箱中，除陽性對照管培養48～72小時外，其余管培養14天。培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生產，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中或劃線接種于斜面培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察是否再出現渾濁或斜面有無菌生長；或取培養液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。12.2.5結果判斷培養結束后，陽性對照管應有菌生長，陰性對管應澄清。否則，就判結果無效。所有供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定。若供試品