免疫熒光技術(shù)（檢測抗核抗體（ANA）的實驗方案）

熒光免疫技術(shù)是以熒光物質(zhì)標(biāo)記的特異性抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于相應(yīng)

抗原或抗體的分析鑒定和定量測定。熒光免疫技術(shù)包括熒光抗體染色技術(shù)和熒光免疫測定

兩大類。熒光抗體染色技術(shù)是用熒光抗體對細(xì)胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)

行鑒定和定位檢測，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果，稱為熒光免疫顯微技術(shù)，或是應(yīng)

用流式細(xì)胞儀進(jìn)行自動分析檢測，稱為流式熒光免疫技術(shù)。熒光免疫測定主要有時間分辨

熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定等。本次實驗以熒光免疫顯微技術(shù)檢測抗核抗體（ANA）

為例進(jìn)行實習(xí)。

抗核抗體（antinuclearantibody,ANA）又稱抗核酸抗原抗體，是一組將自身真核細(xì)胞的

各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作為靶抗原的自身抗體

的總稱，能與所有動物的細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)，主要存在于血清中，也可存在于胸水［關(guān)節(jié)滑膜

液和尿液中。rjoAFNroE8tgBnxo

抗核抗體實驗原理

以小鼠肝細(xì)胞或某些培養(yǎng)細(xì)胞（如Hep-2）作抗原片，將病人血清加到抗原片上。如

果血清中含有ANA,就會與細(xì)胞核成分特異性結(jié)合。加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體又可

與ANA結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核部位呈現(xiàn)熒光。任BKTYS。QNoGoQuo

試劑與器材

1.抗原片現(xiàn)多用商品試劑。如需自行制備，方法如下：

(1)肝印片制備：取4-8周齡小鼠，斷頸殺死后，剖腹取肝。將肝臟剪成平面塊，用

生理鹽水洗去血細(xì)胞，用濾紙吸干滲出的漿液。將切面輕壓于載玻片上，使其在載玻片上

留下薄層肝細(xì)胞。冷風(fēng)吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。z0c962Do8WhtV8Ao

(2)Hep-2細(xì)胞抗原片制備：Hep-2細(xì)胞是建株的人喉癌上皮細(xì)胞。經(jīng)適宜培養(yǎng)在載玻

片上形成單層細(xì)胞抗原片，用洗滌洗去培養(yǎng)基。干燥后,用無水乙醇固定。rOiropAo

HPWLa7fo

(3)肝切片制備：取小鼠肝組織作冰凍切片，厚4U1。-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.異硫氮酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人IgG抗體(FITC-抗人IgG抗體)有商品供應(yīng)，

臨用時按效價稀釋。TeDblBjoKyR2J5Go

3.0.01mol/LpH7.2PBS

4.緩沖甘油取甘油9份加PBS1份。

5.待測血清、陽性和陰性對照血清臨床標(biāo)本篩選獲得。

6.器材熒光顯微鏡、孵箱、有蓋濕盒、染色缸、吸管、試管等

操作方法

1.準(zhǔn)備：檢查加樣板，生物載片恢復(fù)室溫，標(biāo)記。

2.稀釋：PBS-Tween緩沖液稀釋血清，設(shè)陰陽性對照。

3.加樣：加樣板放于泡沫塑料板上，加25Hl稀釋后血清，至加樣板的每一反應(yīng)

區(qū)，避免氣泡。加完所有標(biāo)本后開始溫育。Ke2fCtXoxhzfohwo

4.溫育：將生物薄片蓋于加樣板的凹槽里，反應(yīng)開始，室溫溫育30分鐘。

5.沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有

PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。g9cN0qio5K7UI85O

6.加樣：滴加20Hl熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白（結(jié)合物）至一潔凈加樣板的反應(yīng)

區(qū)，完全加完方可繼續(xù)溫育。熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白用前需混勻并以PBS-Tween緩沖液

稀釋。auCxgTdoEKFfKkIo

7.沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有

PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。2hL06d1oa8ohWBIo

8.封片：將蓋片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至蓋片：每反應(yīng)區(qū)約

10^lo從PBS-Tween緩沖液中取出1張生物薄片，用紙擦干背面和四邊。還要擦拭反應(yīng)

區(qū)間隙。將生物薄片面朝下放在已準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即查看并調(diào)整使蓋片嵌入載片的

凹槽中。然后繼續(xù)下1張。XSa2SVQomKzzIZTo

結(jié)果判定

熒光顯微鏡下觀察

1.細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽性染

色細(xì)胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測定效價。dlaB8L7。

YboEu3Co

2.根據(jù)細(xì)胞核著染色熒光的圖像，可區(qū)分為：

①均質(zhì)型：細(xì)胞核呈均勻一致的熒光；

②周邊型（核膜型）：細(xì)胞核周圍呈現(xiàn)熒光；③斑點型（顆粒型）：細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點

狀熒光；

④核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光。

⑤混合型：兩種以上核染色；

⑥應(yīng)用細(xì)胞片做抗原片可檢出著點型(ACA)

注意事項

1.PBS-Tween緩沖液在4℃下可存放兩周。

2.根據(jù)每次實臉的標(biāo)本量決定需要稀釋的FITC標(biāo)記的抗人球蛋白的量，稀釋后可

在4℃下可存放1周。

3.血清或FITC標(biāo)記的抗人lg應(yīng)滴加至加樣板上，不能直接滴到載片上。

4.載片蓋到加樣板上后，確保反應(yīng)區(qū)與液滴完全接觸后，才開始記時溫育。

5.沖洗載片時水流要緩慢，以免沖洗掉基質(zhì)。載片上的反應(yīng)區(qū)應(yīng)保持濕潤，不要

將載片風(fēng)干。

6.封片進(jìn)不可用力擠壓蓋玻片，以免損壞基質(zhì)。可左右挪動蓋玻片以使其正確嵌

入載片凹槽里。

7.封片介質(zhì)含有熒光穩(wěn)定劑，應(yīng)保存在2-8℃。封好的載片可于4℃長期保存。

實驗討論

方法評價間接免疫熒光技術(shù)是檢測ANA最常用的方法。該方法簡便、敏感，且

可根據(jù)核染色形態(tài)確定核抗原的類型。03o2AJ9oWIZnsypo

鼠肝印片細(xì)胞分布不均勻，多有重疊，沖洗時易丟失。Hep-2細(xì)胞具有核大、有絲分

裂旺盛、核內(nèi)細(xì)胞器較明顯、具備人源性抗原的特征，對診斷和鑒別不同類型的自身免疫

病十分有利。lovGZzRo6sVkMMLo

檢測抗核抗體(ANA)的實臉方案

ANA簡介

抗核抗體(antinuclearantibodies,ANAs)

經(jīng)典定義：針對細(xì)胞核成分的一大組抗體譜。

抗核抗體新概念(FANA)

傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱?狹義定義

現(xiàn)代定義：是指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱。對ANA的理解已不再局限

于核成分，而是指抗核酸(nucleicacid)和核蛋白(nueIeoprotein)抗體的總稱?廣義

定義lezbeRYonRDlyXbo

靶抗原分布：細(xì)胞核

細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分

裂周期

抗核抗體檢測方法

檢測細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體“金標(biāo)準(zhǔn)”一IIF

ANA檢測方法進(jìn)展：僅限于IIF改良法(底物選擇、制備方法)試圖將ELISA發(fā)推廣

為最基本的篩選方法未獲成功ZpKnAUB。xRoR7AVo

復(fù)制細(xì)胞抗原全部成分極其困難?抗原存在的相對濃度、自然抗原決定簇的二級結(jié)

構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)

熒光染色模型可初步判斷相應(yīng)抗體性質(zhì)范圍或確定抗體特異性

IIF法：HEp-2細(xì)胞底物(90%以上實驗室采用)

#完整的ANAs抗原譜(細(xì)胞核、漿、骨架、周期)

#可預(yù)測分析ANA靶抗原范圍

#經(jīng)臉性強

ELISA法：采用高度純化抗原或全細(xì)胞抗原

#抗原譜有限(十余種)

#假陰性結(jié)果

#操作簡單快速

其他方法：金標(biāo)法、比濁法

ANA靶抗原

多核昔酸：雙鏈DNA.單鏈DNA.RNA

組蛋白：H1,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B復(fù)合物

核漿的核糖核蛋白：UlfRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La).Ku、Mi-1.Mi-2.核點、增

殖性細(xì)胞核抗原…E7uSERG。m8DDGWno

核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纖維蛋白、RNA多聚酶I、PM-ScI(PM7)、7-2-RNP(To)、

4-6-S-RNA.核仁形成中心(NOR)…aUj5MrM°k4DeH0jo

核膜抗原：板層素（層粘連蛋白）

著絲點：著絲點蛋白

ANA檢出率

與年齡和性別有關(guān)

與個體的免疫穩(wěn)定性相關(guān)

使用足夠敏感的方法，每個人都可檢測出一些ANA。

_________天然ANA_________

生理性自身免疫

維持機體內(nèi)環(huán)境的生理穩(wěn)定。

滴度較低，親和力弱，大多為IgM型。

ANA檢測方法

初篩抗核抗體：IIF

最佳基質(zhì)：聯(lián)合生物薄片（HEp-2細(xì)胞/猴肝冰漆組織）

區(qū)分抗核抗體的靶抗原：ELISA、印跡法和免疫印跡法

ANA初篩

IFT：HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟

完整的抗原譜（細(xì)胞核及細(xì)胞漿）

可預(yù)測靶抗原

協(xié)助檢測其它項目（如ANCA.ENA）

ELISA：采用高度純化的抗原初篩ANA

抗原譜有限

操作簡單快速

生物薄片技術(shù)

生物薄片馬賽克E技術(shù)

采用滴定平板技術(shù)進(jìn)行間接免疫熒光實驗

為了使實驗操作標(biāo)準(zhǔn)化，歐蒙開發(fā)了滴定平板技術(shù)？：滴加標(biāo)本或標(biāo)記抗體至加樣板的反

應(yīng)區(qū)，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時，載片上的所有生物薄片均

與液滴接觸，反應(yīng)同時開始。系統(tǒng)的幾何結(jié)構(gòu)決定了液滴的位置和高度。因為液體被局限

在一封閉的空間里，所以不再需要傳統(tǒng)的“濕盒”。并且可在一致的反應(yīng)條件下同時溫育

任何數(shù)量的標(biāo)本。tkhiEago9Hf8Nt9o

準(zhǔn)備：檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時

可使用家用洗滌劑或ExtranMAOI（默克公司），再用水徹底沖洗。需要消毒時，可于3%

的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時。只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。

不要觸及生物薄片。按照要求用記號筆對玻片進(jìn)行標(biāo)記。RWtRbNoxChINeHo

稀釋：按照試劑盒使用說明稀釋血清標(biāo)本。每次實險均需加入陽性和陰性對照。對照血

清使用前必須混勻。

加樣：在加樣板的每個反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測標(biāo)本后

才開始溫育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加樣板。AHRWYiooxXsh6CCo

加樣體積：

10|11/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）

251/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）

70口1/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）

溫育：將載片蓋在加樣板對應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個標(biāo)本均能夠與生物薄片相

接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫溫育30分鐘。pgMwHEqouwdDZnOo

清洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩

沖液的小杯中浸洗至少5分釣。jNn66rRoCRkgd1mo

沖洗1秒鐘

小杯內(nèi)浸洗5分鐘

加樣：將熒光標(biāo)記的抗人免疫球蛋白（酶結(jié)合物）加入潔凈加樣板的每個反應(yīng)區(qū)。完

全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫黃（最多可加50個載片）。使用連續(xù)加樣器。加樣前

應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時間，可在第一步溫育的同時滴加酶結(jié)合物至另一個加樣板的

反應(yīng)區(qū)中。BOQxnDVow0UXtxso

加樣體積:

10nI/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）

20|iI/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）

60|iI/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）

溫育：從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后

立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不

要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，

注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。hZ4QBCGoENgqrJVo

清洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween

緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。可在每150ml磷酸鹽緩沖液中加10滴（150口I）伊文氏

藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。q7e01AmoocguCQSo

沖洗1秒鐘

小杯內(nèi)浸洗5分鐘

封片：在蓋玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。從PBS-Tween清洗緩沖液

中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝

下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整

位置，正確放置。然后再進(jìn)行下一個載片的操作。pL6s0wxocS6MRIPo

封片體積：

10口I/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）

10I/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）

20HI/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）

結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下觀察熒光。

具體操作

熒光工作臺的布置

清洗

清洗

載片的擦拭

封片

ANA的結(jié)果

間接免疫熒光法的獨特優(yōu)勢(一種基質(zhì)-可篩查上百種不同的抗

體)

用HEp-2細(xì)胞檢測自身抗體

ANA熒光模型

核均質(zhì)型

核仁型

核顆粒型

胞漿型

ANA確認(rèn)實險(1)

IFT：

-HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：特殊的熒光模型

如著絲點、核膜型、核糖體P蛋白、肌動蛋白

ELISA：

-ANA分項(含ENA譜)：包被高度純化抗原

斑點法/印跡法

-ENA譜：采用各種高度純化的抗原

ELISA：抗ENA譜

印跡法：抗ENA譜

IS

皿區(qū)「?一5

EMBUMRT-OTLA-OS-CSLAiY*Y

EUROIHHUHANTI-ENAPMFILPLUS

印跡法：抗ENA譜

nRNP/Sm

Sm

SS-A

SS-B

Scl-70

Jo-1

dsDNA

histones

rib.P-prot.

centromere

control

p/

ANA確認(rèn)實驗（2）

Westernblot:HEp-2細(xì)胞提取物

-定性

-適宜特別需要（如區(qū)分靶抗原Ro52或Ro60）

-檢測目前無法純化的靶抗原的抗體（如PM-Scl、Ku）

結(jié)論

初篩實臉：

免疫熒光技術(shù)（HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟）

ELISA（純化的多種核抗原）

確認(rèn)實驗：

ELISA

印跡法

斑點法

Westernblot

ANA譜與相關(guān)疾病

相關(guān)疾病的ANA譜

ANA的各種熒光模型、靶抗原及相關(guān)性

高滴度的ANA僅出現(xiàn)在自身免疫性疾病中

自身免疫性疾

病ANA陽性率

(%)

系統(tǒng)性紅斑狼

瘡

活動

期

95-

100

SS063Szoc3nos0U<,

非活動

期

80-100ZdpbwgN,

'EpqfZo

藥物誘導(dǎo)的紅斑狼

瘡100

混合性結(jié)締組織

病100

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

炎20-

40

進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥20-

50

多發(fā)性肌炎及皮肌炎85

95

干燥綜合

征

30-

50

慢性活動性肝

炎70-

80

潰瘍性結(jié)腸

炎70-

80

其它風(fēng)濕

病

26

SLE抗核抗體的檢出率

靶抗

原

檢出率(%)

dsDNA

30-90：VIAf61217Uk8ao

ssDNA

70-9510Px.yBS9iXC

白

抗細(xì)胞抗體熒光模型(immunofIuorescentpattern)

常見的熒光染色模型有6種:

核均質(zhì)型(homogeneouspattern,H)

核顆粒型(Granuloguspattern,S)

核仁型(nucleouspattern,N)

核膜型(membranouspattern,M)

著絲點型(centromertpattern,ACA)

胞漿型（cytopIasmicpattern,ACYA）

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：核均質(zhì)型

ssDNA/dsDNA

靶抗原：單鏈、非天然DNA（喋吟和喀噫臉基對）

雙鏈、天然DNA（脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu)）

相關(guān)性：ssDNA

類風(fēng)濕80.8%

SLE40.0%

干燥綜合征44.0%

皮肌炎12.3%

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎51.7%

獻(xiàn)血

貝6.8%

SLE30%-90%

MdsDNA：綠蠅短膜蟲

組蛋白

靶抗原:組蛋白H1.H2A.H2B.H3.H4

（主要抗原H1和H2B）

功能:形成核小體

相關(guān)性：藥物誘導(dǎo)性LE：100%（唯一的標(biāo)志抗體）

SLE:40%-80%

其它風(fēng)濕性疾病：少見

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗RNP/Sm

U1-nRNP

靶抗原：與U1-nRNA連接的3個蛋白分子（70K、A和C蛋白）

功能：切割pre-mRNA

相關(guān)性：MCTD：95%-100%

SLE:15%-40%

抗Sm抗體

靶抗原：與山-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA連接的6種不同蛋白分子

(coreproteinsB,B',D,E,F,G)

功能：切割pre-mRNA

相關(guān)性：SLE：5%-30%

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗核糖體P蛋白

抗核糖體P蛋白抗體

抗原：核糖體的亞單位（60S）,3個蛋白分子組成：P0、P1.P2（38、19、17kDa）。

AZMFXmOoL07rYCIo

在碳末端具有相似的免疫反應(yīng)表位。

切能：蛋白合成易位過程中的輔蛋白

相關(guān)性：SLE：5%-15%

原發(fā)性干燥綜合征的抗體譜

靶抗原陽性率（％）

SS-A40-95

SS-B40-95

ssDNA40-95

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗SS-A/SS-B

抗SS-A抗體

靶抗原：與Y1,Y3,Y4或Y5型RNA連接的2個蛋白（52kDa和60kDa）

功能：調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯活性

相關(guān)性：干燥綜合征：40%-95%

SLE：20%-60%

抗SS-B抗體

靶抗原：與小分子RNA（U6-RNA,pre-tRNA）結(jié)合的磷脂蛋白（48kDa）

切能：RNA多聚酶III的輔蛋白

相關(guān)性：干燥綜合征：40%-95%

SLE:10%-20%

進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化征的抗體譜

靶抗原陽

性率（％）

著絲

點80-95

Sc1-70

25-75

ssDNA

30-60

原纖維蛋白5-10

RNA聚合酶4

PM-ScI（重疊綜合征）3

N0R-90（核仁形成區(qū)）少見

Ku（多肌炎型重疊綜合征）1-7

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗著絲點抗體

抗著絲點抗體

靶抗原：連接動粒（著絲點）上的4個蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量

（17、80、140、50kDa）YTrbtCFoWrc3ngdo

主要的靶抗原：著絲點B蛋白（與IIFT相關(guān)性：

100%）

切能：與紡錘體纖維連接

相關(guān)性：硬皮病:18%

局限性硬化征（CREST綜合征）：80%-95%

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗Scl-70

抗ScI-70抗體

靶抗原：DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(100kDa)

也能：DNA復(fù)制和翻譯過程的輔蛋白

相關(guān)性：硬皮病:25%-75%

HEp-2/靈長類肝臟：抗PM-Scl

抗PM-ScI抗體

靶抗原：多個蛋白分子的復(fù)合物

主要的靶抗原100kDa

（與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酹I不同）

也能：未知

相關(guān)性：硬皮病：2%-5%

肌炎：8%

重疊綜合征：24%

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗RNA多聚酶

RNA多聚酶I、II和III

靶抗原：多個蛋白亞單位組成的核仁酶復(fù)合物

切能：多聚酶I:轉(zhuǎn)錄rRNA基因

多聚酶||：轉(zhuǎn)錄mRNA基因

多聚酶III:轉(zhuǎn)錄tRNA基因

相關(guān)性：硬皮病：4%

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗原纖維蛋白

抗原纖維蛋白（U3-nRNP）抗體

靶抗原：與基礎(chǔ)蛋白（34kDa）連接的U3-nRNA和其它5個蛋白

功能：分離pre-rRNA

相關(guān)性：皮肌炎：5%-10%

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗N0R

HEp-2細(xì)胞/靈長類肝臟：抗Ku

多肌炎和皮肌炎的抗體譜

靶抗

原陽

性率（%）